郭彥，楊樂樂，戚華宇

小鼠雄性生殖干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示成熟精原干細(xì)胞特征

郭彥1，楊樂樂2，戚華宇2

1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)系，合肥 230026 2. 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，細(xì)胞譜系與發(fā)育研究中心，廣州 510530

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是成年動(dòng)物睪丸中的成體干細(xì)胞，具有自我更新與分化的能力。小鼠()精原干細(xì)胞來源于胚胎期的原始生殖細(xì)胞(primodial germ cells, PGCs)，小鼠出生前原始生殖細(xì)胞處于有絲分裂靜止?fàn)顟B(tài)，出生后恢復(fù)增殖并由曲細(xì)精管中央遷移至管壁基質(zhì)，建立穩(wěn)定的精原干細(xì)胞克隆。成熟小鼠的精原干細(xì)胞周期性地啟動(dòng)精子發(fā)生以維持雄性動(dòng)物長(zhǎng)期穩(wěn)定的生殖能力。精原干細(xì)胞在其建立和成熟后是否具有特征上的差異目前尚不清楚。本研究在前期建立的不同年齡小鼠精原干細(xì)胞(表達(dá)多能性基因編碼的OCT4)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠新生期(出生后3天)、幼年期(出生后7天)和成熟期(2～3月齡)精原干細(xì)胞的基因表達(dá)差異進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，包括差異表達(dá)基因(differentially expression genes, DEGs)的篩選、DEGs編碼的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)的建立、功能聚類富集(Gene Ontology, GO)和通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，以及使用基于GO、KEGG和HALLMARK的基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)。結(jié)果顯示，OCT4陽性精原干細(xì)胞在小鼠新生期、幼年期和成熟期存在大量差異表達(dá)基因，所編碼的蛋白主要生物學(xué)功能集中在生物合成和能量代謝、免疫反應(yīng)、細(xì)胞連接和遷移以及細(xì)胞分化等方面。精原干細(xì)胞細(xì)胞膜成分的顯著變化可能影響精原干細(xì)胞的超敏反應(yīng)、細(xì)胞間相互作用以及對(duì)細(xì)胞外環(huán)境因子的應(yīng)答反應(yīng)。在能量代謝方式上，隨著年齡的增加，OCT4陽性精原干細(xì)胞逐漸從線粒體氧化磷酸化作用轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒庾饔?，同時(shí)也顯著減少了細(xì)胞內(nèi)核糖體形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究雄性生殖干細(xì)胞形成和成熟的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。

精原干細(xì)胞；OCT4；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因

在全世界范圍內(nèi)，不孕不育癥影響著越來越多的人群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在育齡夫婦中，8%～12%的夫婦存在不孕不育問題[1]。其中，男性因素造成的不育疾病約占50%[2]。在雄性性腺(睪丸)中，精原干細(xì)胞是支持精子發(fā)生的成體干細(xì)胞。在正常生理環(huán)境下，精原干細(xì)胞通過自我更新和分化產(chǎn)生階段性的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，繼而進(jìn)入減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體精子細(xì)胞，后者通過細(xì)胞形態(tài)發(fā)生形成精子[3～5]。精原干細(xì)胞的自體移植可以幫助恢復(fù)和治療部分由于生精障礙造成的不育癥。在哺乳動(dòng)物模型中的研究表明，一些失去生育能力的牛()和猴()通過精原干細(xì)胞的自體移植可以恢復(fù)睪丸組織精子發(fā)生的能力并產(chǎn)生有功能的精子[6～9]。精原干細(xì)胞的自體移植技術(shù)為在性成熟之前(如青春期) 由于癌癥等因素造成的生殖能力喪失人群提供了一種可以保留生育能力的可能性。

精原干細(xì)胞的臨床應(yīng)用目前面臨許多尚未解決的問題。例如，精原干細(xì)胞還沒有被認(rèn)可的、單一的標(biāo)記分子，這對(duì)精原干細(xì)胞的研究和應(yīng)用都造成一定的阻礙。對(duì)小鼠的研究表明，同種異體移植的、分化啟動(dòng)的未分化精原細(xì)胞在不育受體睪丸組織中可以產(chǎn)生長(zhǎng)期生精的精原干細(xì)胞群落，表明睪丸內(nèi)發(fā)揮干細(xì)胞功能的細(xì)胞數(shù)量或大于已知干細(xì)胞數(shù)量[10～12]。因此，有學(xué)者提出應(yīng)該基于它們是否具有基本的干細(xì)胞功能，即自我更新和多能性，來識(shí)別精原干細(xì)胞[13]。目前，鑒定和評(píng)估精原干細(xì)胞功能的主要方法是觀察細(xì)胞移植入曲細(xì)精管后在受體中是否具有形成克隆并長(zhǎng)期產(chǎn)生精子的能力[14]。由于移植后的精原干細(xì)胞需從曲細(xì)精管管腔轉(zhuǎn)移至基底膜(歸巢)，因此對(duì)精原干細(xì)胞表面蛋白和遷移調(diào)控的研究對(duì)提高和改善細(xì)胞移植效率具有一定意義。研究表明，小鼠中精原干細(xì)胞移植后穩(wěn)定克隆形成率約為10%，在小鼠等常用動(dòng)物模型中，歸巢的精確效率尚不明確[15,16]。另一方面，由于動(dòng)物體內(nèi)精原干細(xì)胞數(shù)量的稀少，發(fā)展不同物種中長(zhǎng)期穩(wěn)定的體外培養(yǎng)體系，也有助于獲得足夠數(shù)量的、可用于移植的精原干細(xì)胞。

雖然精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在小鼠、大鼠()、山羊()和人()等物種[17]已取得了一定的成功，但是伴隨體外培養(yǎng)產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致移植細(xì)胞誘發(fā)癌癥的發(fā)生[3]。同時(shí)長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)可能會(huì)造成精原干細(xì)胞多能性下降、端?？s短以致無法無限增殖[17]。目前，用于體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的精原干細(xì)胞多來源于年幼動(dòng)物的睪丸，成年后動(dòng)物個(gè)體的精原干細(xì)胞相比而言仍較難以在體外長(zhǎng)期維持[18,19]。通過對(duì)幼年期和成熟期精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，或許可以為精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的改良提供參考。

目前普遍認(rèn)為，由于成年小鼠的睪丸中體細(xì)胞的成熟以及不同發(fā)育階段生精細(xì)胞的增長(zhǎng)，形成了與幼年期小鼠不同的精原干細(xì)胞生態(tài)位(精原干細(xì)胞周圍可以維持其干細(xì)胞特性，并決定其自我更新或分化命運(yùn)的微環(huán)境)[20,21]，進(jìn)而引起精原干細(xì)胞性質(zhì)的變化[22]。已有的研究表明，衰老的精原干細(xì)胞分化過程受到嚴(yán)重阻礙，尤其是在表觀遺傳水平，許多促分化基因的甲基化減少，分化信號(hào)通路中的基因甲基化分布異常[23]。動(dòng)物個(gè)體從新生到逐漸發(fā)育成熟，直至衰老失去生育能力，這一漫長(zhǎng)的發(fā)育過程是否會(huì)伴隨著精原干細(xì)胞自身特征的不斷變化，目前新生和成熟動(dòng)物體內(nèi)精原干細(xì)胞間的差異研究相對(duì)較少。為探究不同年齡階段小鼠精原干細(xì)胞的特征變化，本研究在前期建立的不同年齡小鼠精原干細(xì)胞(表達(dá)多能性基因編碼的OCT4)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠新生期(出生后3天)、幼年期(出生后7天)和成熟期(2～3月齡)OCT4陽性精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，旨在從轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)小鼠個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中的精原干細(xì)胞變化獲得新的認(rèn)識(shí)，為精原干細(xì)胞的研究提供新的方向和思路，為促進(jìn)精原干細(xì)胞在臨床上的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)過濾和表達(dá)矩陣有效性檢查

出生后3天(3 days-post-partum, 3-dpp)、出生后7天(7-dpp)和2～3月齡(2～3-M)的雄性O(shè)G2轉(zhuǎn)基因小鼠(表達(dá)處于啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的GFP)的精原干細(xì)胞的流式分選、RNA提取和cDNA文庫建立，在本實(shí)驗(yàn)室的另一項(xiàng)工作中完成。其中，通過流式分選出的、用于文庫建立的OCT4陽性精原干細(xì)胞的純度達(dá)到95%以上[24]。質(zhì)量合格的樣品文庫送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司，使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)序樣品各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，一共9個(gè)測(cè)序樣品。在本研究中，3-dpp組代表新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞，7-dpp組代表幼年期精原干細(xì)胞，2～3-M組代表成熟期精原干細(xì)胞。

原始RNA測(cè)序數(shù)據(jù)(raw reads)去除任意一端含有測(cè)序接頭的序列和低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)(clean reads)。使用HISAT2[25]將各樣品的有效數(shù)據(jù)與小鼠參考基因組進(jìn)行比對(duì)。為防止表達(dá)量低的基因數(shù)據(jù)對(duì)整體測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果的影響，分析中去除了同一基因原始讀數(shù)豐度(raw read counts)大于1且樣本個(gè)數(shù)小于6的基因數(shù)據(jù)。然后利用R軟件的DESeq2[26]中歸一化算法(中位數(shù)比率法)對(duì)所有基因的原始讀數(shù)豐度進(jìn)行歸一化，檢驗(yàn)常見基因(如管家基因)在每個(gè)樣本中的表達(dá)量是否正常，并檢查表達(dá)矩陣中每個(gè)樣本的基因表達(dá)量和表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)的有效性。

1.2 基因的差異表達(dá)分析

基于歸一化后的樣本RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)3組基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間的差異基因分析，即7-dpp3-dpp (幼年期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞比較)、2～3-M7-dpp (成熟期精原干細(xì)胞與幼年期精原干細(xì)胞比較)、2～3-M3-dpp (成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞比較)。使用R語言中DESeq2[26]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。由于不同階段細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)整體水平存在差異，需要為不同組間的表達(dá)差異設(shè)置合適的log2FoldChange值。依據(jù)整體數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)學(xué)公式：

計(jì)算適合的log2FoldChange值[27]，確定差異表達(dá)基因列表值<0.05，|log2FoldChange|7-dpp vs 3-dpp> 1.278，|log2FoldChange|2～3-M vs 7-dpp>1.755，|log2Fold-Change|2～3-M vs 3-dpp>2.226。其中，x是某一基因log2FoldChange的絕對(duì)值。

1.3 qRT-PCR驗(yàn)證

利用qRT-PCR方法對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證。隨機(jī)選取7個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的mRNA序列，使用在線引物設(shè)計(jì)工具Primer BLAST (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)引物(附表1)。以9個(gè)樣品的cDNA為模板，在Bio-Rad CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀上使用兩步法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，39個(gè)循環(huán)；70℃ 5 s；在70℃～92.4℃區(qū)間內(nèi)以每秒上升0.4℃繪制熔解曲線。以為內(nèi)參，使用2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 蛋白–蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)密集連接區(qū)域分析

在STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes, https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫[28]中分別輸入3個(gè)階段(3-dpp、7-dpp、2～3-M) OCT4陽性精原干細(xì)胞的差異基因，并下載與差異表達(dá)蛋白存在互作關(guān)系的蛋白質(zhì)信息。利用Cytoscape 3.9.0軟件[29]創(chuàng)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)。

MCODE[30]是Cytoscape軟件中的一個(gè)插件，用于對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析以便識(shí)別出密集連接的區(qū)域。通過拓?fù)浞治霁@得的聚類子網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)至少與個(gè)其他節(jié)點(diǎn)相連接。K核(k-core)是重要的分析參數(shù)，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的特征性k核值越大，該節(jié)點(diǎn)所在子網(wǎng)絡(luò)位置的結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定。設(shè)置最小k核值為2后，選擇綜合評(píng)分(子網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)乘以總連接數(shù)與理論最大連接數(shù)的比值，即子網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)與子網(wǎng)絡(luò)密度之積)最高的前兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)簇作為進(jìn)行功能分析的候選簇。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類以確定在3個(gè)階段OCT4陽性精原干細(xì)胞中重要的特征變化網(wǎng)絡(luò)，并由DAVID(Database for Annotation, Visua-lization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf. gov/)在線數(shù)據(jù)庫對(duì)位于子網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能注釋[31]。

1.5 基于多個(gè)基因集的基因集富集分析

使用基于GO、KEGG和HALLMARK基因集的GSEA方法對(duì)所有基因進(jìn)行分析[32～35]，分別獲得3個(gè)發(fā)育階段的HALLMARK功能富集結(jié)果、潛在GO功能和KEGG通路結(jié)果。用Benjamini和Hochberg方法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[36]。選擇調(diào)整后的值小于0.05的GO和KEGG通路。利用R軟件篩選出3個(gè)階段均被富集到的潛在GO功能，并將屬于同一GO功能的潛在基因組合在一起作為該條GO功能的潛在基因，然后將所有上調(diào)和所有下調(diào)的GO功能潛在基因分別進(jìn)行KEGG分析。同樣地，利用R軟件找出成熟期OCT4陽性成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞以及幼年期精原干細(xì)胞均具有顯著差異的潛在KEGG通路，并對(duì)潛在KEGG通路下的所有潛在基因做GO分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

RNA測(cè)序樣本數(shù)據(jù)的處理和分析在用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算和分析的R軟件環(huán)境中進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)均以mean± s.e.m表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 歸一化轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)有效性分析

鑒于對(duì)小鼠個(gè)體差異和批次效應(yīng)的考慮，以及為了使組內(nèi)和組間的測(cè)量數(shù)據(jù)具有可比性，在分析測(cè)序數(shù)據(jù)之前本研究對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理(見材料與方法1.1)。數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化后，各樣本的整體基因表達(dá)量處于同一水平，表明樣本數(shù)據(jù)間可以進(jìn)行比較，不存在批次效應(yīng)(圖1A)。而相同細(xì)胞類型來源的總體基因表達(dá)分布從概率密度的角度是相似的(圖1B)。由于管家基因通常被用做比較基因表達(dá)變化時(shí)的參照物，其表達(dá)水平往往高于細(xì)胞內(nèi)其他基因的平均表達(dá)水平。與此一致，本研究中精原干細(xì)胞樣品的基因平均表達(dá)量均在5以下(圖1A)，而和在樣本中的表達(dá)量幾乎都高于10 (圖1C)。樣品聚類分析顯示，來自同一年齡組別的3個(gè)樣品在空間距離上相近，且相關(guān)性高，其次是精原干細(xì)胞前體細(xì)胞和幼年期精原干細(xì)胞的空間距離相較于成熟期精原干細(xì)胞。上述結(jié)果顯示，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)具有可靠性和可比性。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選和表達(dá)量聚類分析

為了探究不同階段精原干細(xì)胞之間的差異，本研究利用DESeq2進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，并篩選出組間的差異表達(dá)基因。在組間(7-dpp3-dpp、2～3-M7-dpp、2～3-M3-dpp)差異表達(dá)基因分析中，共獲得948個(gè)差異表達(dá)基因。其中，與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞相比，幼年期精原干細(xì)胞中93個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，311個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)(圖2A)；與幼年期精原干細(xì)胞相比，成熟期精原干細(xì)胞中有323個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，95個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)(圖2B)；與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞相比，成熟期精原干細(xì)胞中有310個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，284個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)(圖2C)。對(duì)所有差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量的聚類分析，發(fā)現(xiàn)同一組別下的3個(gè)樣本形成獨(dú)立的簇，即3-dpp、7-dpp和2～3-M樣品的3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)組分別各自形成一個(gè)獨(dú)立簇(圖2D)。依據(jù)在不同發(fā)育階段OCT4陽性精原干細(xì)胞中的表達(dá)變化，所有的差異表達(dá)基因可大致分為5類：1)在7-dpp時(shí)表達(dá)下調(diào)，2～3-M時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因；2)在3-dpp和7-dpp時(shí)低表達(dá)，2～3-M時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因；3) 3-dpp到2～3-M表達(dá)持續(xù)上調(diào)的基因；4) 3-dpp到2～3-M持續(xù)表達(dá)下調(diào)的基因；5)在3-dpp時(shí)高表達(dá)，7-dpp和2～3M低表達(dá)的基因(圖2E)。差異表達(dá)基因分析表明，3個(gè)不同年齡小鼠中的OCT4陽性精原干細(xì)胞的基因表達(dá)整體水平的趨勢(shì)是不同的，與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞相比，幼年期精原干細(xì)胞的變化主要由較多基因表達(dá)下調(diào)引起。但與幼年期精原干細(xì)胞相比，成熟期精原干細(xì)胞的變化主要是基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果。

圖1 歸一化基因表達(dá)數(shù)據(jù)有效性分析

A：各樣本所有基因在經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后的整體平均表達(dá)量；B：各樣本基因表達(dá)量總體分布概率密度圖；C：管家基因和在各組中的標(biāo)準(zhǔn)化后表達(dá)量；D：包含所有基因的樣品間相關(guān)性分析熱圖。

圖2 差異表達(dá)基因及其表達(dá)量聚類分析

A：7-dpp3-dpp的基因差異分析結(jié)果。設(shè)置|log2FoldChange|>1.278。B：2～3-M7-dpp的基因差異分析結(jié)果。設(shè)置|log2FoldChange| > 1.755。C：2～3-M3-dpp的基因差異分析結(jié)果。設(shè)置|log2FoldChange| > 2.226。< 0.05為差異表達(dá)基因。紅點(diǎn)表示上調(diào)差異表達(dá)基因，藍(lán)點(diǎn)表示下調(diào)差異表達(dá)基因，黑點(diǎn)表示非差異表達(dá)基因。D：所有差異表達(dá)基因熱圖。E：5類表達(dá)趨勢(shì)的代表性差異表達(dá)基因折線圖。數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m表示。

2.3 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的真實(shí)性和差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)，本研究利用qRT-PCR方法對(duì)隨機(jī)選取的7個(gè)差異表達(dá)基因()進(jìn)行了表達(dá)量測(cè)定。結(jié)果顯示，所選的7個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量曲線與RNA-seq數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的表達(dá)趨勢(shì)相似(圖3)，顯示用于生物信息學(xué)分析的RNA-seq數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

圖3 隨機(jī)選取的7個(gè)差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m表示。

2.4 蛋白–蛋白互作聚類子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選

蛋白–蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)描述了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，對(duì)了解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能和蛋白質(zhì)間相互作用具有重要意義。本研究在篩選出的組間差異表達(dá)基因基礎(chǔ)上構(gòu)建了相應(yīng)階段的PPI網(wǎng)絡(luò)。為了獲得在3個(gè)階段OCT4陽性精原干細(xì)胞間差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)中重要的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及相關(guān)基因，本研究利用Cytoscape 3.9.0軟件的MCODE插件對(duì)構(gòu)建的差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞與幼年期精原干細(xì)胞的PPI網(wǎng)絡(luò)共聚集到14個(gè)模塊簇，包含90個(gè)基因和516個(gè)互作關(guān)系(圖4A)。幼年期精原干細(xì)胞與成熟期精原干細(xì)胞的差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)共聚集到15個(gè)模塊簇，包含75個(gè)基因和217個(gè)互作關(guān)系(圖4B)。新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞與成熟期精原干細(xì)胞的差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)共聚集到17個(gè)模塊簇，包含106個(gè)基因和379個(gè)互作關(guān)系(圖4C)。

圖4 蛋白–蛋白互作聚類網(wǎng)絡(luò)簇

A：7-dpp3-dpp差異基因PPI聚類網(wǎng)絡(luò)簇(共14個(gè))；B：2～3-M7-dpp差異基因PPI聚類網(wǎng)絡(luò)簇(共15個(gè))；C：2～3-M3-dpp差異基因PPI聚類網(wǎng)絡(luò)簇(共17個(gè))。圖中每個(gè)基因團(tuán)是聚類分析得到的一個(gè)模塊簇。虛線圈出的是綜合評(píng)分最高的2個(gè)聚類網(wǎng)絡(luò)簇。紫紅色表示轉(zhuǎn)錄上調(diào)，粉色表示轉(zhuǎn)錄下調(diào)，藍(lán)色表示差異表達(dá)基因互作節(jié)點(diǎn)(node)，三角形為種子節(jié)點(diǎn)，圓圈為聚類節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間結(jié)合強(qiáng)度越大，節(jié)點(diǎn)間的邊(edge)顏色越深、寬度越寬。

2.5 聚類子網(wǎng)絡(luò)功能分析

PPI綜合評(píng)分(子網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)與子網(wǎng)絡(luò)密度之積)最高的兩個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)(圖4虛線所注)，可以提示對(duì)應(yīng)發(fā)育階段OCT4陽性精原干細(xì)胞的重要蛋白相互作用特征，選擇這些模塊中的基因進(jìn)一步分析有助于了解特定細(xì)胞中重要聚類子網(wǎng)絡(luò)涉及的生物學(xué)功能。分別選擇3個(gè)階段中綜合評(píng)分最高的兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)模塊簇作為進(jìn)行功能分析的候選簇，進(jìn)行聚類子網(wǎng)絡(luò)功能分析。如圖5A所示，新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞與幼年期精原干細(xì)胞相比，在幼年期精原干細(xì)胞中富集的第一個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因前10條GO功能主要集中在細(xì)胞膜表面、細(xì)胞間或與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、細(xì)胞間的連接等方面；富集的前10條KEGG通路主要與細(xì)胞粘附、細(xì)胞自我更新等相關(guān)。幼年期精原干細(xì)胞中富集的第二個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因前10條GO和KEGG通路則提示細(xì)胞遷移，以及通過細(xì)胞膜表面變化來改變對(duì)外界環(huán)境刺激的應(yīng)答。因此，相較于新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞，幼年期精原干細(xì)胞可能通過細(xì)胞表面的變化來改變對(duì)來自細(xì)胞外環(huán)境或其他細(xì)胞的信號(hào)反應(yīng)，并且伴隨有活躍的遷移活動(dòng)。

幼年期精原干細(xì)胞與成熟期精原干細(xì)胞相比，在成熟期精原干細(xì)胞中富集的第一個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因前10條GO和KEGG通路均與免疫系統(tǒng)活動(dòng)有關(guān)，尤其是超敏反應(yīng)被顯著正向調(diào)控(圖5B)。而第二個(gè)子網(wǎng)絡(luò)模塊的富集結(jié)果在精子發(fā)生、細(xì)胞分化、精子活動(dòng)和多細(xì)胞生物的發(fā)育等方面改變更為顯著。此外，KEGG結(jié)果顯示，成熟期精原干細(xì)胞在能量代謝方面出現(xiàn)糖酵解作用方式(圖5B)。

成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞相比，有兩個(gè)顯著的生物學(xué)功能變化：第一個(gè)子網(wǎng)絡(luò)的富集結(jié)果顯著集中在與細(xì)胞外基質(zhì)或環(huán)境的相互作用關(guān)系上；而第二個(gè)子網(wǎng)絡(luò)的富集結(jié)果顯示成熟期精原干細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間存在關(guān)聯(lián)性(圖5C)，提示小鼠個(gè)體成熟后的精原干細(xì)胞改變了與細(xì)胞外基質(zhì)的聯(lián)系方式，如在減少膠原產(chǎn)生、促進(jìn)膠原分解上表現(xiàn)出明顯變化(圖5C)。

綜合3個(gè)發(fā)育不同年齡階段小鼠OCT4陽性精原干細(xì)胞聚類子網(wǎng)絡(luò)的功能富集結(jié)果，聚類子網(wǎng)絡(luò)分析提示成熟期精原干細(xì)胞存在產(chǎn)生細(xì)胞外泌體、與先天性免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)和補(bǔ)體激活有關(guān)的特性。例如，能夠啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)的TLR3[37,38]在新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平最高，幼年期精原干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄量已顯著降低，成熟期精原干細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)；細(xì)胞外泌體標(biāo)志蛋白CD63[39]在幼年期精原干細(xì)胞中未見明顯變化，在成熟期精原干細(xì)胞中的表達(dá)水平有所上調(diào)；相反，參與抗體結(jié)合的FCGR3和FCER1G，以及主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)的組成[40]成分H2-K1和H2-D1的轉(zhuǎn)錄水平在幼年期下調(diào)后又在成熟期顯著上調(diào)(圖6A)。但精原干細(xì)胞中補(bǔ)體C1QA、C1QB和C1QC的表達(dá)水平在小鼠幼年期未見明顯變化，在成熟階段顯著上調(diào)(圖6B)。先天免疫反應(yīng)是針對(duì)病原體的非特異性免疫反應(yīng)；而超敏反應(yīng)是適應(yīng)性免疫針對(duì)特定抗原產(chǎn)生的，以生理功能紊亂為主的異常特異性免疫應(yīng)答。這些結(jié)果提示，幼年期精原干細(xì)胞參與先天免疫反應(yīng)的啟動(dòng)，而成熟期精原干細(xì)胞通過產(chǎn)生補(bǔ)體參與先天免疫反應(yīng)以預(yù)防炎癥的發(fā)生[41]，并與超敏反應(yīng)相關(guān)。由于成熟期時(shí)有影響巨噬細(xì)胞耐受表型[41]的補(bǔ)體(C1QA、C1QB、C1QC)大量表達(dá)，從而防止了自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。因此，成年小鼠精原干細(xì)胞的移植可能存在組織相容性問題。

2.6 HALLMARK基因集富集分析

HALLMARK基因集富集分析可以總結(jié)多個(gè)基因集的信息，突出顯示協(xié)調(diào)表達(dá)和具有明確生物學(xué)過程定義的基因，從而減少基因分析的誤差和冗余，并為GSEA分析更好地描述生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)[34]。本研究對(duì)不同發(fā)育時(shí)期精原干細(xì)胞中的所有基因進(jìn)行了HALLMARK基因集富集分析。在新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞與幼年期精原干細(xì)胞之間的分析結(jié)果中，顯著性和標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)排在前5位的生物學(xué)功能均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，分別是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、IL2_ STAT5信號(hào)通路、凝血級(jí)聯(lián)、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和通過NFκB的TNFα信號(hào)通路(圖7A)，該結(jié)果提示幼年期精原干細(xì)胞EMT、STAT信號(hào)和TNFα信號(hào)下調(diào)，以及凝血級(jí)聯(lián)和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)等免疫相關(guān)反應(yīng)下調(diào)。在幼年期精原干細(xì)胞與成熟期精原干細(xì)胞之間的分析結(jié)果中，排在前5位的是下調(diào)的MYC_TARGETS_V1、氧化磷酸化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、E2F_TARGETS和上調(diào)的精子發(fā)生(圖7B)，說明成熟期精原干細(xì)胞EMT持續(xù)下調(diào)，增殖減慢，氧化磷酸化下調(diào)，存在分化趨勢(shì)。而成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞之間的分析結(jié)果和幼年期與成熟期精原干細(xì)胞之間的分析結(jié)果相同，但EMT、MYC_TARGETS_ V1和氧化磷酸化的下調(diào)程度不同(圖7C)，該結(jié)果表明，與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞相比，成熟期精原干細(xì)胞在增殖、EMT和有氧代謝方面顯著下調(diào)，并出現(xiàn)分化傾向。綜上，HALLMARK基因集富集結(jié)果表明，小鼠從新生到成熟，OCT4陽性精原干細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是持續(xù)下降的，并且出現(xiàn)上調(diào)的精子發(fā)生過程相關(guān)基因表達(dá)，說明OCT4陽性精原干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上存在多能性下降特征，同時(shí)出現(xiàn)氧化磷酸化作用逐漸削弱的現(xiàn)象，且成熟精原干細(xì)胞的增殖活動(dòng)減少。

圖5 綜合評(píng)分最高的兩個(gè)PPI聚類網(wǎng)絡(luò)簇基因的生物學(xué)功能分析

A：7-dpp3-dpp差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中綜合評(píng)分最高的兩個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因的生物學(xué)功能分析結(jié)果；B：2～3-M7-dpp差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中綜合評(píng)分最高的兩個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因的生物學(xué)功能分析結(jié)果；C：2～3-M3-dpp差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中綜合評(píng)分最高的兩個(gè)聚類子網(wǎng)絡(luò)基因的生物學(xué)功能分析結(jié)果。<0.05，x軸為富集基因數(shù)，y軸為功能描述。

圖6 免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)

A：免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)；B：補(bǔ)體基因的表達(dá)趨勢(shì)。數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m表示。

圖7 HALLMARK基因集富集分析

A：7-dpp3-dpp樣本在HALLMARK基因集富集分析中富集最高的5個(gè)條目；B：2～3-M7-dpp樣本在HALLMARK基因集富集分析中富集最高的5個(gè)條目；C：2～3-M3-dpp樣本在HALLMARK基因集富集分析中顯著性最高的5個(gè)條目。Pathway：功能描述；Gene ranks：基因排序；NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)；-adj：調(diào)整后值。

2.7 潛在信號(hào)通路和功能富集分析

為了發(fā)現(xiàn)在不同階段精原干細(xì)胞中的潛在信號(hào)通路，本研究還采用了基于GO和KEGG基因集的GSEA分析方法。因?yàn)镚SEA分析方法不局限于用給定的差異基因范圍來富集潛在生物學(xué)功能，某些在表達(dá)上差異不顯著，但存在重要生物學(xué)意義的基因也會(huì)被囊括在富集到的相關(guān)潛在信號(hào)通路中。該方法不僅可以指出潛在信號(hào)通路方向和具有生物學(xué)意義的基因，還可以根據(jù)整體的基因表達(dá)來計(jì)算出這些潛在信號(hào)通路的上調(diào)和下調(diào)情況，從而預(yù)估潛在信號(hào)通路在不同階段精原干細(xì)胞中的生物學(xué)意義。

通過基于GO基因集的GSEA分析，新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞與幼年期精原干細(xì)胞之間共獲得潛在GO功能357條，幼年期與成熟期精原干細(xì)胞之間的比較共獲得潛在GO功能162條，成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞之間比較共獲得潛在GO功能388條，在3個(gè)發(fā)育階段OCT4陽性細(xì)胞中都具有顯著性差異的生物學(xué)過程有16個(gè)(圖8A)。其中13個(gè)生物學(xué)過程在3個(gè)時(shí)期的OCT4陽性細(xì)胞中持續(xù)下調(diào)，主要包括：含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、超分子纖維組織、外包裹結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞–基質(zhì)粘附、上皮管分支的形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)組裝和結(jié)構(gòu)分子活性等，共483個(gè)潛在基因；另外3個(gè)生物學(xué)過程則是持續(xù)上調(diào)，主要包括：雄性配子生成、精子發(fā)生、精細(xì)胞分化，共111個(gè)潛在基因。對(duì)3個(gè)上調(diào)的生物學(xué)過程中的潛在基因經(jīng)過KEGG通路分析，富集到了多條信號(hào)通路，包括：PI3K-Akt、Wnt、Estrogen、Hippo、Rap1、TNF、趨化因子信號(hào)通路等，也包含了白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、緊密連接、間隙連接等相關(guān)信號(hào)通路(圖8B)。13個(gè)下調(diào)的GO生物學(xué)過程的潛在基因經(jīng)過KEGG通路分析，富集到的信號(hào)通路包括：核糖體、粘著斑、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、ECM-受體相互作用、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、癌癥中的蛋白多糖、緊密連接、粘附連接以及吞噬體等相關(guān)功能(圖8C)。通過觀察上調(diào)和下調(diào)的GO生物學(xué)功能中潛在基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)在兩種趨勢(shì)的GO生物學(xué)功能中。緊密連接相關(guān)蛋白CLDN11[42]的表達(dá)在幼年期精原干細(xì)胞中顯著上調(diào)，但在成熟期精原干細(xì)胞中又下調(diào)到幼年期轉(zhuǎn)錄水平之下(圖8D)。這些結(jié)果說明，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，精原干細(xì)胞與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織以及周圍細(xì)胞間的連接在不斷減少，表明精原干細(xì)胞與微環(huán)境的連接方式發(fā)生改變。與此相反，精子發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)則隨小鼠年齡增加而持續(xù)上調(diào)。隨著小鼠個(gè)體的逐漸成熟，OCT4陽性精原干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上的分化趨勢(shì)也逐漸明顯。

基于KEGG基因集的GSEA分析結(jié)果表明，共有8條潛在生物學(xué)信號(hào)通路在不同年齡小鼠精原干細(xì)胞中均具有顯著差異(圖9A)。如成熟期精原干細(xì)胞在免疫反應(yīng)相關(guān)的通路上表現(xiàn)出顯著上調(diào)，包括抗原加工和呈遞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?。而物質(zhì)的合成與線粒體能量代謝在成熟期精原干細(xì)胞中有所下降，包括藥物代謝–細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝、藥物代謝–其他酶、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病和核糖體通路。對(duì)富集到的8條潛在生物學(xué)通路下的所有基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，成熟期精原干細(xì)胞在核糖體組裝、蛋白質(zhì)合成、氨基酸代謝、線粒體相關(guān)的能量代謝以及線粒體組裝等生物合成過程調(diào)控顯著下調(diào)(圖9B)。由RNA測(cè)序結(jié)果可知，隨著小鼠年齡的增加，參與線粒體ATP合成偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因(如、、)、三羧酸循環(huán)的基因(如、、)、參與線粒體組織(、、)和線粒體翻譯(、、)的基因[43]轉(zhuǎn)錄水平在精原干細(xì)胞中逐漸下調(diào)(圖9C)。而參與糖酵解代謝的關(guān)鍵糖酵解酶在成熟期精原干細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，如己糖激酶(HK1)、磷酸果糖激酶(PFKFB3)、GAPDHS、烯醇化酶(ENO3)、乳酸脫氫酶(LDHC)、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK2)。相反，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的丙酮酸脫氫酶的表達(dá)顯著下調(diào)，如PDHA1(圖9D)。這些結(jié)果表明，在小鼠個(gè)體發(fā)育過程中，OCT4陽性精原干細(xì)胞從幼年期開始出現(xiàn)氧化磷酸化作用降低并逐漸提高糖酵解代謝的現(xiàn)象，且伴有核糖體形成減少和整體蛋白質(zhì)合成水平顯著降低的趨勢(shì)。

圖8 GO基因集富集分析及Cldn11基因表達(dá)趨勢(shì)

A：GSEA分析：持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的GO術(shù)語。x軸為標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)，y軸為功能描述。B：上調(diào)GO術(shù)語基因的KEGG分析(顯著性最高的10條通路)。x軸為富集基因占總基因數(shù)量的比例，y軸為KEGG通路描述。C：下調(diào)GO術(shù)語基因的KEGG分析(顯著性最高的10條通路)。x軸為富集基因占總基因數(shù)量的比例；y軸為KEGG通路描述。顏色表示值范圍，點(diǎn)的大小表示通路下富集基因數(shù)量。D：基因的表達(dá)趨勢(shì)。數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m表示。

3 討論

本研究對(duì)出生后不同年齡小鼠的OCT4陽性精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，成熟期小鼠精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞及幼年期精原干細(xì)胞相比，在細(xì)胞膜表面、細(xì)胞間或與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、細(xì)胞間的連接等方面存在顯著性差異，在膠原產(chǎn)生的減少、促進(jìn)膠原分解上的變化尤為明顯。成熟期精原干細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞外泌體，參與先天性免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)和補(bǔ)體激活過程。隨著小鼠個(gè)體的發(fā)育成熟，精原干細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化作用逐漸減少，糖酵解代謝上調(diào)，且伴有整體蛋白質(zhì)合成能力的顯著降低。

精子發(fā)生的正常進(jìn)行需要生殖細(xì)胞之間以及生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間的密切聯(lián)系和高度配合。精原干細(xì)胞在細(xì)胞膜上的顯著改變值得注意。成熟期精原干細(xì)胞中差異基因表達(dá)分析結(jié)果提示，細(xì)胞粘附相關(guān)分子和通路在這一時(shí)期具有顯著變化，這與一些已有的研究報(bào)道一致。例如：以豬()精原干細(xì)胞為模型的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白IV會(huì)強(qiáng)烈地刺激豬精原干細(xì)胞的分化[44,45]。相較于新生期和幼年期小鼠，成年小鼠中的精原干細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的膠原三聚體分解，這可能是精原干細(xì)胞在形成穩(wěn)定克隆以后減少了膠原蛋白的產(chǎn)生和連接，從而減少刺激其分化的因素。但精原干細(xì)胞表面起連接作用的分子遠(yuǎn)不止一種。有研究表明，生精小管的支持細(xì)胞在成熟期間失去了典型的上皮連接結(jié)構(gòu)，取而代之的是特殊的細(xì)胞粘附和連接方式[46]。在小鼠發(fā)育成熟過程中，支持細(xì)胞分子特征上的這種變化會(huì)給睪丸中的生精細(xì)胞帶來連接分子表達(dá)上的變化。例如，CLDN11是緊密連接相關(guān)蛋白，基因缺陷造成精原干細(xì)胞很難在睪丸中定植和形成克隆[42,47]。相較于幼年期精原干細(xì)胞，成熟期精原干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，原因可能是小鼠成熟后睪丸支持細(xì)胞改變了細(xì)胞間連接方式，從而導(dǎo)致精原干細(xì)胞表面粘連蛋白的表達(dá)隨之改變，包括的表達(dá)變化。

圖9 基于KEGG基因集的基因集富集分析和線粒體及糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)

A：GSEA分析：持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的KEGG通路。x軸為標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)，y軸為通路描述。B：潛在KEGG通路基因的GO分析(顯著性最高的12個(gè)生物學(xué)功能)。x軸為富集基因占總基因數(shù)量的比例；y軸為功能描述。顏色表示值范圍，點(diǎn)的大小表示基因數(shù)量。C：線粒體相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)。D：糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)。數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m表示。

睪丸是一個(gè)具有免疫特權(quán)的器官，雖然免疫系統(tǒng)反應(yīng)顯著降低，但來自血液循環(huán)系統(tǒng)和通過男性泌尿生殖道入侵的微生物病原體通常會(huì)被清除，這種現(xiàn)象表明睪丸對(duì)侵入的病原體具有局部有效的先天免疫反應(yīng)[48]。已有研究指出，各種模式識(shí)別受體在睪丸細(xì)胞中大量表達(dá)并啟動(dòng)睪丸先天免疫反應(yīng)。小鼠出生后7天的精原細(xì)胞和21天的精母細(xì)胞中的TLR3以及精細(xì)胞中的TLR11能夠啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)[37,38]。RNA測(cè)序結(jié)果顯示，TLR3在新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞中的表達(dá)量最高，在幼年期精原干細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低，在成熟期精原干細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)，但補(bǔ)體C1QA、C1QB和C1QC在成熟期精原干細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。產(chǎn)生這些現(xiàn)象的一種可能性是OCT4陽性精原干細(xì)胞在小鼠出生后或許承擔(dān)著一定的啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)的作用，隨著睪丸組織的成熟，陸續(xù)形成的精母細(xì)胞和精細(xì)胞開始負(fù)責(zé)啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，而精原干細(xì)胞主要通過分泌補(bǔ)體參與其中。

具有免疫特權(quán)的睪丸組織除了具有局部細(xì)胞先天免疫防御功能，還可以保護(hù)自身抗原性生殖細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊。RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析富集到的通路中有多條與自身免疫相關(guān)，例如抗原加工和呈遞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及3種超敏反應(yīng)等，說明除了被血睪屏障保護(hù)的減數(shù)分裂后生殖細(xì)胞具有細(xì)胞表面抗原外，精原干細(xì)胞可能也具有免疫原性，這與已報(bào)道的血睪屏障之外的生殖細(xì)胞表達(dá)自身抗原具有一致性[49,50]。本研究也從OCT4陽性精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了主要組織相容性復(fù)合體分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)隨年齡的增加而上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟期精原干細(xì)胞具有分泌補(bǔ)體的能力，而補(bǔ)體的作用不局限于協(xié)助先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)自身免疫耐受[41]。因此，OCT4陽性精原干細(xì)胞分泌的補(bǔ)體可能也為避免自身免疫的發(fā)生提供了一定的幫助。這些結(jié)果說明精原干細(xì)胞在睪丸免疫特權(quán)中可能發(fā)揮著一定的作用，并且成體精原干細(xì)胞的非自體移植可能引起自身免疫性反應(yīng)。

目前普遍認(rèn)為，多種成體干細(xì)胞均具有低線粒體呼吸和無氧代謝特征，線粒體氧化磷酸化作用持續(xù)產(chǎn)生的潛在有害活性氧減少，從而維護(hù)基因組的完整性[51]。代謝方式的轉(zhuǎn)變似乎是生命體成長(zhǎng)發(fā)育和命運(yùn)決定所必須的，并存在于多個(gè)組織中[52]。例如，植入前胚胎被認(rèn)為依賴丙酮酸消耗，偏愛高度氧化代謝[53～55]，而在囊胚形成時(shí)糖酵解急劇增加[56～58]。原始生殖細(xì)胞被認(rèn)為依賴線粒體呼吸，而伴隨氧化磷酸化產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物是表觀遺傳變化所必需的[59～61]。那么，從原始生殖細(xì)胞到新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞，到幼年期精原干細(xì)胞，直至成熟期精原干細(xì)胞，代謝方式的轉(zhuǎn)變可能是生殖細(xì)胞發(fā)育的必然過程。在豬中，二月齡動(dòng)物精原干細(xì)胞中可檢測(cè)到代謝方式從氧化磷酸化開始轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醮x[62]。已報(bào)道的睪丸細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也表明，未分化精原細(xì)胞中糖酵解相關(guān)基因大量富集以及分化過程中氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[43,63]。小鼠3個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的OCT4陽性精原干細(xì)胞的RNA測(cè)序分析結(jié)果顯示，幼年期精原干細(xì)胞尚未出現(xiàn)糖酵解代謝或氧化磷酸化的下降，但在成熟期精原干細(xì)胞中出現(xiàn)了顯著的氧化磷酸化降低和糖酵解的上調(diào)。因此，糖酵解代謝或許不是精原干細(xì)胞建立時(shí)的主要代謝途徑，而隨發(fā)育和細(xì)胞內(nèi)部分子網(wǎng)絡(luò)的變化調(diào)整，才形成為有利于精原干細(xì)胞增殖和長(zhǎng)期維持干性的代謝方式，這可能也是生殖細(xì)胞從發(fā)育潛能性高且依賴有氧代謝的原始生殖細(xì)胞階段，逐漸轉(zhuǎn)變成高分化特性和依賴糖酵解代謝的成熟期精原干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)變化所必經(jīng)的過程。然而，本研究存在一定的局限性，因?yàn)榧?xì)胞中發(fā)揮實(shí)際作用的大部分是蛋白質(zhì)，需要與精原干細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合，以進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果。

綜上所述，成熟期精原干細(xì)胞與新生期精原干細(xì)胞前體細(xì)胞以及幼年期精原干細(xì)胞之間，存在多方面的顯著基因表達(dá)差異。這些基因表達(dá)的改變可以在伴隨小鼠個(gè)體成熟變化的同時(shí)，更好地維護(hù)精原干細(xì)胞的自我更新，保證周期性精子發(fā)生的有序進(jìn)行，并讓后代擁有完整的基因組。雖然精原干細(xì)胞還沒有很好的特異性單一標(biāo)記物，但OCT4陽性精原干細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組研究和分析，可以為精原干細(xì)胞特性的了解和研究提供一定的參考。

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 qRT-PCR引物序列

Supplementary Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

序號(hào)基因上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′) 1ActinTGTACCCAGGCATTGCTGACAGCTGCTGGAAGGTGGACAGTG 2Id4CACTCACCGCGCTCAACACTCCGGTGGCTTGTTTCTCTT 3Ybx2GGAGTTTGATGTCGTGGAAGGCGTCGATTAGGGGCATAGCG 4Ddr1ATGCTGACATGAAGGGACATTTGGTGTAGCCTACGAAGGTCCA 5NefmATGACGAGCCATTTCCCACTTGCAGTCCAAGAGCATCGAG 6Fxyd6TCTCCGTTGGGATACTTCTCATCTCCGCAGCGTTTGTAGTGAT 7Gfra1AACTGCCAGCCAGAGTCAAGGGCTGCTGGAGTCTATGTAG 8RargTGCCTGGTTTTACAGGGCTCTCCGAGAATGTCATAGTGTCCT

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Transcriptome analysis of mouse male germline stem cells reveals characteristics of mature spermatogonial stem cells

Yan Guo1, Lele Yang2, Huayu Qi2

Spermatogonial stem cells (SSCs) are adult stem cells in the testis of male animals and have the ability in self-renewal and differentiation. SSCs are derived from primordial germ cells (PGCs) that are mitotically arrested in the embryo before birth. Following the birth of the animal, PGCs resume mitosis and migrate from the centre of the seminiferous tubules to the basement membrane. The descendent of PGCs (also called gonocytes) establish stable SSC colonies in about a week postnatally in order to support the life-long spermatogenesis. Whether SSCs at different developmental stages differ in their molecular and cellular characteristics is currently unclear. In the presented study, we conducted bioinformatics analyses using transcriptomics data established previously in the laboratory on OCT4 (encoded by the pluripotent gene) expressing SSCs from the neonatal (3 days-post-partum, 3-dpp), juvenile (7-dpp) and adult (2～3-month) mice, including screen of differentially expressed genes (DEGs), protein-protein interaction (PPI) network analysis of DEGs and clustering of sub-networks from PPI. GO (Gene Ontology) and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) analyses were also performed on clustered sub-networks of the PPI. In addition, all genes were analyzed using GSEA (gene set enrichment analysis) based on GO, KEGG and HALLMARK gene sets. The results showed that SSCs have a large number of DEGs among OCT4-positive SSCs from neonatal, juvenile and adult mice. The distinguishable biological functions encoded by these DEGs include biosynthesis and energy metabolism, immune response, cell junction and expression of migration and cell differentiation-related genes. Significant changes in the cell membrane composition of OCT4-positive SSCs may not only cause hypersensitive immune reactions but also affect the cell-cell contact and responses to secreted cytokines in the extracellular environment. The results also suggest that OCT4-positive SSCs may shift metabolic state from oxidative phosphorylation to glycolysis and significantly reduce the transcription of genes related to ribosome formation during aging. These results provide new clues for future research on the regulatory mechanisms of male germline stem cell development, growth and aging.

spermatogonial stem cells; OCT4; transcriptome; differentially expressed genes

(責(zé)任編委: 劉默芳)