肝硬化是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一，作為一種慢性進(jìn)行性肝病，如不及時(shí)干預(yù)其會(huì)發(fā)展為肝腎綜合征、肝性腦病、肝癌等

。目前臨床對(duì)于肝硬化的治療通常采用保肝、降低門(mén)脈壓力等對(duì)癥治療，只能緩解肝硬化的疾病進(jìn)展，所以對(duì)于肝硬化治療藥物的研發(fā)仍是目前臨床的迫切需求?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，TGF-β1/PI3K通路是與肝硬化疾病進(jìn)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，該通路相關(guān)蛋白的異常激活導(dǎo)致肝硬化疾病惡化加速

。當(dāng)歸作為一種補(bǔ)血活血的傳統(tǒng)中藥，其對(duì)于肝硬化的治療作用近年來(lái)逐漸被發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸能夠明顯修復(fù)大鼠肝功能，對(duì)肝硬化進(jìn)展及預(yù)后具有一定的效果

。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠門(mén)靜脈及TGF-β1/PI3K通路的調(diào)節(jié)作用，為當(dāng)歸注射液在肝硬化治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠72只，雄性，6～8周齡，體重180～200 g，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2017-0003，于動(dòng)物房飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑 當(dāng)歸注射液(福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)201806221，規(guī)格2 ml，濃度0.1 g/ml)；水飛薊素(德國(guó)馬博士大藥廠，批號(hào)10291103)；ALT、AST ELISA試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)CSB-E13024r-1、CSB-E13023r-1)；PI3K、p-PI3K及TGF-β1兔多克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)AF7742、AF5905、AF0297、AF1186、A0208)；總RNA抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)R1200、T2240、SR1110、R0010、PE0010、G1120)；PCR引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.3 儀器與設(shè)備 CX31熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；Omega Fluor 凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像儀(美國(guó)Aplegen公司)；Sigma8K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；C1000梯度PCR儀(美國(guó)bio-rad公司)；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；壓力傳感器(上海艾爾科特生物科技有限公司)。

1.4 大鼠分組及造模處理 72只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、肝硬化組、當(dāng)歸注射液低、中、高劑量組及水飛薊素組，12只/組，除對(duì)照組外，其余各組大鼠按照5 ml/kg腹腔注射給予大鼠體積分?jǐn)?shù)為20%的CCl

大豆油溶液

，2次/周，連續(xù)7周，對(duì)照組大鼠腹腔注射大豆油溶液。造模結(jié)束后，隨機(jī)取3只大鼠進(jìn)行肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察，以大鼠肝組織細(xì)胞壞死、炎癥浸潤(rùn)、大量膠原沉積視為造模成功。當(dāng)歸注射液低、中、高劑量組大鼠分別按照3 ml/kg、6 ml/kg、12 ml/kg

腹腔注射給予當(dāng)歸注射液，水飛薊素組大鼠給予30 mg/kg的水飛薊素腹腔注射

，對(duì)照組及肝硬化組大鼠給予生理鹽水腹腔注射。各組大鼠均1次/d，連續(xù)4周

。

1.5 大鼠血清ALT、AST水平測(cè)定 大鼠眼眶取血，于4℃靜置1 h，離心取上清，使用ALT、AST ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清ALT、AST水平。

1.6 大鼠門(mén)靜脈壓力及血流量的測(cè)定 大鼠禁食24 h后，使用戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，參考文獻(xiàn)方法[10]測(cè)定大鼠門(mén)靜脈壓力及門(mén)靜脈血流量。

1.7 大鼠肝、脾指數(shù)的計(jì)算 大鼠稱重后處死，分離肝、脾組織，按照以下公式計(jì)算大鼠肝、脾指數(shù)。肝指數(shù)=肝組織重量(mg)/體重(g)，脾指數(shù)=脾組織重量(mg)/體重(g)。

1.8 大鼠肝組織病理學(xué)檢查 大鼠處死后立即取出肝組織，肝組織用10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，制成5 μm切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2.4 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠肝組織病理形態(tài)的影響如圖1所示。結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理性改變；與對(duì)照組比較，肝硬化組大鼠肝組織細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積增多，提示造模成功；與肝硬化組大鼠比較，當(dāng)歸注射液低、中、高劑量組及水飛薊素組大鼠肝組織病理性明顯改善。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，

<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠門(mén)靜脈壓力、門(mén)靜脈血流量、內(nèi)臟血管阻力的影響 見(jiàn)表2。

站在醫(yī)院發(fā)展層面，腦血管病在省內(nèi)和國(guó)內(nèi)均是被十分看重的項(xiàng)目。其中，河南省正在打造建設(shè)6個(gè)國(guó)家區(qū)域醫(yī)療中心，其中腦血管病區(qū)域醫(yī)療中心是其中之一。而在2017年，腦血管疾病也被定義為國(guó)家發(fā)改委疑難危重能力提升工程的重點(diǎn)項(xiàng)目。

2.1 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠血清ALT、AST的影響 見(jiàn)表1。

1.10 大鼠肝組織PI3K及TGF-β1蛋白表達(dá)測(cè)定 取大鼠肝組織加入RIPA裂解液，研磨勻漿后離心，取上清液煮沸變性，測(cè)定總蛋白含量，各組取等量蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，封液封閉后，用PI3K、p-PI3K及TGF-β1兔多克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗孵育，滴加顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

(3)車(chē)輪旋轉(zhuǎn)的上述效應(yīng)更多來(lái)自輪軌力相對(duì)車(chē)輪的旋轉(zhuǎn)，在陀螺效應(yīng)也是很明顯的，如圖8所示。圖8中示出了3條曲線，實(shí)線是車(chē)輪不旋轉(zhuǎn)時(shí)的動(dòng)柔度，虛線是車(chē)輪以400 km/h旋轉(zhuǎn)時(shí)的動(dòng)柔度，而點(diǎn)線是令陀螺矩陣G=0所得到的動(dòng)柔度?？梢钥闯?，當(dāng)陀螺矩陣G=0時(shí)，頻率分解有的加寬有的變窄了，但峰值的高度改變不是特別大。

測(cè)區(qū)位于內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗黃河邊上，溝壑縱橫，植被覆蓋較少，為典型的黃土地貌。項(xiàng)目要求地形圖比例尺為1∶2 000，等高距為2 m[1-2]，用于礦山地質(zhì)災(zāi)害治理。整個(gè)測(cè)區(qū)面積合計(jì)24.7 km2，分布在5個(gè)治理區(qū)域。測(cè)區(qū)內(nèi)主要地物為：在建高架鐵路、普通工業(yè)廠房及居民地、網(wǎng)圍欄、公路及大車(chē)路、電桿(塔)、光纜樁、路堤、路塹和田坎，主要植被為耕地、零散樹(shù)木及成片的果園。測(cè)區(qū)最低海拔為870 m，最高海拔為1 346 m，最大高差達(dá)476 m。

反轉(zhuǎn)教學(xué)模式充分體現(xiàn)了以學(xué)生為主體，教師為主導(dǎo)的教學(xué)理念，因此在該模式下學(xué)習(xí)，能夠激發(fā)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)生更具社會(huì)化，并且有終身學(xué)習(xí)意識(shí)等。

2.3 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠肝、脾指數(shù)的影響 見(jiàn)表3。

1.9 大鼠肝組織PI3K及TGF-β1 mRNA測(cè)定 取大鼠肝組織勻漿液，使用RNA提取試劑盒從組織勻漿中提取總RNA，提取后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR反應(yīng)試劑盒測(cè)定并計(jì)算PI3K及TGF-β1 mRNA表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，采用2

法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列為GAPDH:正向引物：5'-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3'，反向引物：5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3'；PI3K：正向引物：5'-GAGGAACTGCATTGGGAAAC-3'，反向引物：5'-TGGGATCTGGCAGTAGCTC-3'；TGF-β1：正向引物：5'-TACGCATACCTGAAAGGCAC-3'，反向引物：5'-GGACTTCACACAATGCCCAGT-3'。

2.5 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠肝組織PI3K及TGF-β1 mRNA的影響 見(jiàn)表4。

2.6 當(dāng)歸注射液對(duì)肝硬化大鼠PI3K及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表5及圖2。

3 討論

肝硬化是由于病毒感染、酒精中毒、循環(huán)障礙等多種原因引起肝組織細(xì)胞損傷后導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性再生、結(jié)締組織增生、肝纖維化等病理性改變。門(mén)靜脈高壓大多數(shù)是由于肝硬化病理進(jìn)展過(guò)程中引起的并發(fā)癥，主要原因是由于靜脈血流不能經(jīng)過(guò)肝臟進(jìn)入下腔靜脈，進(jìn)而導(dǎo)致門(mén)靜脈壓力持續(xù)增高。長(zhǎng)期的門(mén)靜脈高壓會(huì)導(dǎo)致食管胃底靜脈曲張、脾臟腫大、脾功能亢進(jìn)、腹水等一系列并發(fā)癥

。目前臨床對(duì)于肝硬化及門(mén)靜脈高壓的治療多采用對(duì)癥治療及支持治療以減緩肝硬化的疾病進(jìn)展，水飛薊素是近年來(lái)研究表明能夠明顯抑制肝硬化及肝纖維化進(jìn)展的藥物，所以本實(shí)驗(yàn)選用水飛薊素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

當(dāng)歸作為一種傳統(tǒng)中藥，來(lái)源于傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其味甘，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具有活血通便、調(diào)經(jīng)止痛等功效，用于治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)等病癥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸具有抗炎、抗氧化損傷等藥理作用

，同時(shí)對(duì)腦血管損傷

及血腦屏障損傷

具有明顯的修復(fù)及保護(hù)作用。早期黃自平等人

通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)肝硬化門(mén)脈高壓患者輸注當(dāng)歸注射液后，患者門(mén)靜脈壓力及血流量均明顯減輕，且患者未出現(xiàn)全身不良反應(yīng)；李校天等

研究報(bào)道了肝硬化患者口服當(dāng)歸治療后，患者肝功能明顯恢復(fù)且患者門(mén)靜脈及脾靜脈壓力降低。近年來(lái)研究報(bào)道了當(dāng)歸補(bǔ)血湯及當(dāng)歸芍藥湯等中藥湯劑均能夠明顯降低肝硬化患者ALT、AST水平，修復(fù)患者肝功能，調(diào)節(jié)肝硬化患者門(mén)靜脈血流動(dòng)力學(xué)改變，降低腹水的發(fā)生及進(jìn)展。

我國(guó)傳統(tǒng)節(jié)日內(nèi)涵豐富，是踐行和培育社會(huì)主義核心價(jià)值觀的寶貴資源。學(xué)?？缮钊胪诰騻鹘y(tǒng)節(jié)日的內(nèi)涵，創(chuàng)新開(kāi)展形式各異的踐行活動(dòng)。清明節(jié)組織全校師生走進(jìn)中國(guó)工農(nóng)紅軍西路軍紀(jì)念館，舉行“重溫革命歷史，緬懷革命英烈”掃墓活動(dòng)；端午節(jié)通過(guò)開(kāi)展“包粽子比賽”“屈原詩(shī)詞朗誦比賽”等活動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)愛(ài)國(guó)愛(ài)鄉(xiāng)情感；中秋節(jié)舉行“圖說(shuō)我家的中秋節(jié)”電子手抄報(bào)比賽，通過(guò)豐富的圖片解說(shuō)，引導(dǎo)孩子們體會(huì)闔家團(tuán)圓、國(guó)泰民安的喜悅……

其作用是防治地下害蟲(chóng)，如螻蛄、蠐螬、金針蟲(chóng)等。方法是將 “菌蟲(chóng)必殺”藥劑每畝用5袋（400 g/袋），拌細(xì)土均勻撒入播種溝內(nèi)。

ALT、AST是反映肝損傷的常用指標(biāo)，ALT、AST水平升高提示肝組織細(xì)胞損傷，肝功能降低；肝脾指數(shù)是反映肝、脾組織水腫狀態(tài)的指標(biāo)，楊牧祥

研究表明肝硬化大鼠肝、脾組織處于水腫狀態(tài)，肝脾指數(shù)明顯升高。門(mén)靜脈壓力及門(mén)靜脈血流量是反映肝門(mén)靜脈血流動(dòng)力學(xué)的重要指標(biāo)，張成剛等

研究表明門(mén)靜脈壓力升高及血流量增加是肝硬化門(mén)靜脈血流動(dòng)力學(xué)變化及門(mén)靜脈壓力異常的重要原因。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與肝硬化組大鼠比較，當(dāng)歸注射液各劑量組大鼠血清ALT、AST水平、肝脾指數(shù)、門(mén)靜脈壓力及門(mén)靜脈血流量降低，提示當(dāng)歸注射液能夠呈劑量依賴性的改善大鼠肝功能及門(mén)靜脈血流動(dòng)力學(xué)改變。

研究證實(shí)TGF-β1通路的過(guò)度激活是導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞激活，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的重要原因

。PI3K通路能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PI3K通路的過(guò)度激活是肝硬化向肝細(xì)胞癌癌前惡變的重要機(jī)制之一

。過(guò)度激活的PI3K能夠通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、增強(qiáng)肝細(xì)胞癌上皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力。馮雪等

研究發(fā)現(xiàn)CCl

誘導(dǎo)的肝硬化小鼠肝組織TGF-β1表達(dá)升高，抑制TGF-β1的過(guò)表達(dá)，能夠改善小鼠肝功能，緩解小鼠肝硬化進(jìn)展；吳燦等

研究表明TGF-β1/PI3K通路的過(guò)度激活是肝硬化病理進(jìn)展重要原因之一，而丹參多酚酸鹽能夠通過(guò)抑制TGF-β1/PI3K通路進(jìn)而抑制大鼠肝硬化的進(jìn)一步惡化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與肝硬化組大鼠比較，當(dāng)歸注射液各劑量組大鼠肝組織p-PI3K/PI3K及TGF-β1水平降低，且隨著當(dāng)歸注射液劑量的增加，肝組織p-PI3K/PI3K及TGF-β1水平逐漸降低，即當(dāng)歸注射液能夠呈劑量依賴性的抑制肝硬化大鼠肝組織TGF-β1/PI3K通路的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而抑制大鼠肝硬化的進(jìn)展。

綜上所述，當(dāng)歸注射液能夠抑制肝硬化大鼠肝組織TGF-β1/PI3K通路的過(guò)表達(dá)，降低門(mén)靜脈壓力，調(diào)節(jié)門(mén)靜脈血流動(dòng)力學(xué)改變。

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