近年來，中草藥的抗腫瘤作用已成為研究熱點

。木鱉子(MC)屬于葫蘆科苦瓜屬植物，其主要包含甾體類、烯烴類等成分，具有抗癌、抗炎等作用

。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種5′與3′端以共價鍵結(jié)合形成的RNA分子，具有穩(wěn)定性、組織特異性等特點，并可通過結(jié)合微小RNA(miRNA)調(diào)控肝癌等腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移過程

。環(huán)狀RNA_002178(circRNA_002178)在乳腺癌中表達(dá)水平升高，下調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌發(fā)展進(jìn)程

。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)信號通路在肝癌細(xì)胞增殖及遷移過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用

。但木鱉子是否可通過調(diào)控circRNA_002178表達(dá)及PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用尚未可知。因此，本研究主要探討木鱉子對肝癌細(xì)胞的影響，探究其對circRNA_002178及PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 木鱉子(寧夏香草生物)；人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H(美國ATCC)；Lipofectamine2000、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher)；熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化)；circRNA_002178小分子干擾RNA(si-circRNA_002178)、亂序無意義陰性序列(si-NC)(廣州銳博生物)；pcDNA3.1(上海遠(yuǎn)慕生物)；CCK-8檢測試劑盒(上海宇淳生物)；Transwell小室(美國Corning)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD)。

1.2 實驗分組 MHCC97-H細(xì)胞分別加入含有不同濃度(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)木鱉子的培養(yǎng)基處理24 h

，分別記作MC-L組、MC-M組、MC-H組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。分別將si-NC、si-circRNA_002178轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-circRNA_002178組。分別將pcDNA、pcDNA-circRNA_002178轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細(xì)胞，分別加入含有濃度為200 μg/ml木鱉子的培養(yǎng)基處理24 h，分別記作MC-H+pcDNA組、MC-H+pcDNA-circRNA_002178組。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取各組MHCC97-H細(xì)胞接種于96孔板(1×10

個/孔)，加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD)，計算細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD/對照組OD)×100%。

其實，大道至簡，在班主任專業(yè)成長的路上，離不開“堅持”二字。嘗試許自己一個“365天”（一年）或者“730天”（兩年），甚至更多更多的日子……你會發(fā)現(xiàn)，最好的自己潛藏在每一個堅持的日子里。

2.2 木鱉子對肝癌MHCC97-H細(xì)胞中circRNA_002178表達(dá)量的影響 與Con組比較，MC-L組、MC-M組、MC-H組circRNA_002178的表達(dá)水平降低(

<0.05)，且呈劑量依賴性(

<0.05)，見表2。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中circRNA_002178的表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR擴增反應(yīng)體系參照熒光定量檢測試劑盒說明書并檢測circRNA_002178相對表達(dá)量。

生態(tài)文明是一種人類尊重自然、保護利用自然，與自然和諧共生、良性循環(huán)、全面可持續(xù)發(fā)展的文明形態(tài)[5]。最早的酒是自然的產(chǎn)物。慢慢地人類學(xué)會了利用自然條件釀造白酒，并不斷的改進(jìn)釀酒工藝，提高酒的品質(zhì)。川酒擁有上千年發(fā)展歷史，其酒文化中蘊含著豐富的生態(tài)文明理念。主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá) 提取MHCC97-H細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)(美國CST)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)(美國Santa Cruz)一抗稀釋液與二抗稀釋液(武漢艾美捷)，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 使用培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，隨后加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，置于培養(yǎng)箱孵育5 h，將各組MHCC97-H細(xì)胞加入Transwell小室的上室(5×10

個/孔)，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室(600 μl/孔)，分別采用多聚甲醛固定(20 min)與0.1%結(jié)晶紫染液染色(10 min)。細(xì)胞遷移實驗與侵襲實驗中后續(xù)實驗步驟相同，置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)。

2.1 木鱉子對肝癌MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響與Con組比較，MC-L組、MC-M組、MC-H組細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力降低(

<0.05)，且呈劑量依賴性(

<0.05)，見圖1、表1。

2 結(jié)果

“測量基礎(chǔ)”課程是高職院校工程測量技術(shù)專業(yè)的專業(yè)基礎(chǔ)課，一般在大一上學(xué)期開設(shè)，主要內(nèi)容為：測量學(xué)的基本概念、水準(zhǔn)測量、角度測量、距離測量、小區(qū)域的控制測量和地形圖的測繪應(yīng)用[1]。該課程的學(xué)習(xí)，主要是為后續(xù)的測量平差、控制測量、數(shù)字測圖、工程測量、GNSS定位技術(shù)等專業(yè)課打好基礎(chǔ)，因此該課程學(xué)習(xí)效果的情況直接影響到后續(xù)專業(yè)課程的學(xué)習(xí)，若基礎(chǔ)沒有打好，后續(xù)課程學(xué)習(xí)起來會比較吃力。

保證檔案資源橫向縱向交流暢通，應(yīng)該結(jié)合信息技術(shù)的發(fā)展，不斷的通過加密技術(shù)、規(guī)范的數(shù)字化技術(shù)、數(shù)據(jù)分析技術(shù)等進(jìn)行全面的管理，核實。從而滿足在大數(shù)據(jù)時代下，企業(yè)檔案管理的安全性，實現(xiàn)服務(wù)多元化，管理高效化。

讀楊鵬筆下的故事，你會發(fā)現(xiàn)，他的絕大部分作品承載的是一個小小男孩的英雄夢想。楊鵬自己也說，他作品的主人公都有自己的影子，他在心靈深處的某一個角落，永遠(yuǎn)是一個14歲的孩子，從未長大。

2.4 circRNA_002178過表達(dá)降低木鱉子對MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用 與MC-H+pcDNA組比較，MC-H+pcDNA-circRNA_002178組細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強(

<0.05)，見圖3、表4。

2.3 干擾circRNA_002178表達(dá)對MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circRNA_002178組細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力降低(

<0.05)，見圖2、表3。

2.5 各組MHCC97-H細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與Con組比較，MC-H組、si-circRNA_002178組p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低(

<0.05)；與MC-H+pcDNA組比較，MC-H+pcDNA-circRNA_002178組p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著升高(

<0.05)，見圖4、表5。

3 討論

中草藥在肝癌治療方面已取得一定進(jìn)展，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及減緩疾病進(jìn)展，并可延長患者生存期及提高患者生活質(zhì)量

。但關(guān)于中草藥在肝癌治療過程中的作用機制尚未闡明。circRNA可調(diào)控miRNA或相關(guān)基因表達(dá)，還可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平，并可參與肝癌發(fā)生及發(fā)展過程

，但中草藥是否以circRNA為作用靶點從而發(fā)揮作用尚未闡明。

木鱉子可抑制食管癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)展進(jìn)程

。本研究結(jié)果顯示不同劑量的木鱉子處理后肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，提示木鱉子可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，且呈劑量依賴性。MMP-2、MMP-9高表達(dá)可降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積而增強細(xì)胞遷移及侵襲能力

。本研究結(jié)果顯示不同劑量的木鱉子處理后可明顯降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。研究表明circRNA_002178表達(dá)水平升高可促進(jìn)肺腺癌發(fā)展進(jìn)程

。本研究結(jié)果顯示不同劑量的木鱉子處理后可明顯降低circRNA_002178的表達(dá)水平，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示木鱉子可能通過調(diào)控circRNA_002178的表達(dá)從而發(fā)揮抗肝癌的作用。本研究進(jìn)一步分析顯示干擾circRNA_002178的表達(dá)后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯減弱，提示木鱉子可能通過下調(diào)circRNA_002178的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

為進(jìn)一步驗證木鱉子是否可通過調(diào)控circRNA_002178的表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究將pcDNA-circRNA_002178轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，使用高劑量的木鱉子處理后，細(xì)胞存活率明顯升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示circRNA_002178過表達(dá)降低木鱉子對MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。研究表明PI3K/Akt信號通路中PI3K被激活形成磷酸化p-PI3K，p-PI3K可促進(jìn)下游基因Akt發(fā)生磷酸化形成p-Akt從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，通過抑制PI3K/Akt信號通路的活化可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

。本研究結(jié)果顯示木鱉子處理后肝癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平降低，干擾circRNA_002178的表達(dá)后肝癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平降低，而circRNA_002178過表達(dá)可明顯提高p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平，提示circRNA_002178可能正向調(diào)控PI3K/Akt信號通路，而木鱉子可能通過下調(diào)circRNA_002178的表達(dá)而負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號通路從而減弱肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，木鱉子可通過抑制circRNA_002178的表達(dá)而減弱肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，其作用機制與抑制PI3K/Akt信號通路的活化有關(guān)，circRNA_002178可能作用肝癌靶向治療的潛在靶點，可為進(jìn)一步揭示木鱉子抗腫瘤的分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

[1]朱云,李成,林鑫盛,等.白術(shù)多糖對肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用及其機制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2019,39(10):1180-1185.

[2]鄧通元,黃桂柳,黃贊松,等.苦參素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響及機制[J].山東醫(yī)藥,2018,58(10):5-8.

[3]范戎,許敏,馬曉霞,等.苦瓜屬植物的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,37(6):93-100.

[4]Zhang PF,Wei CY,Huang XY,

.Circular RNA circTRIM33-12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression[J].Mol Cancer,2019,18(1):105-115.

[5]Liu T,Ye P,Ye Y,

.Circular RNA hsa_circRNA_002178 Silencing Retards Breast Cancer Progression via microRNA-328-3p-mediated Inhibition of COL1A1[J].J Cell Mol Med,2020,24(3):2189-2201.

[6]曹煜姍,孫達(dá)權(quán),夏慶,等.PI3K/Akt通路在肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用[J].山東醫(yī)藥,2018,58(2):14-17.

[7]高榮,李子晗,馬錦榮,等.中藥木鱉子促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30自噬研究[J].生物化工,2019,5(3):99-101.

[8]陳源紅,鄒佳峻,李松波,等.靈芝多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖及體外遷移的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2018,39(11):1625-1628.

[9]錢亞云,李文原,趙雪煜,等.南蛇藤提取物靶向mTOR抑制人肝癌HepG2細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的研究[J].中草藥,2018,49(20):120-126.

[10]Wang L,Long H,Zheng Q,

.Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression[J].Mol Cancer,2019,18(1):119-129.

[11]Chen Q,Chen Z,Cao S,

.Role of CircRNAs_100395 in Proliferation and Metastases of Liver Cancer[J].Med Sci Monit,2019,25(1):6181-6192.

[12]艾征東,陳立.木鱉子抗腫瘤的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2018,34(4):482-485.

[13]趙芳惠,侯小濤,郝二偉,等.木鱉子化學(xué)成分、毒理與藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2020,26(3):222-235.

[14]Gao X,Zhou Y,Zheng X,

.Peniciketal A,a novel spiroketal compound,exerts anticancer effects by inhibiting cell proliferation,migration and invasion of A549 lung cancer cells[J].Anticancer Agents Med Chem,2018,18(11):1573-1581.

[15]Wang J,Zhao X,Wang Y,

.circRNA-002178 act as a ceRNA to promote PDL1/PD1 expression in lung adenocarcinoma[J].Cell Death Dis,2020,11(1):32-42.

[16]黃丹紅,吳建兵,簡捷,等.TPX2通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及凋亡[J].腫瘤,2019,39(11):897-907.

[17]Liu Z,Chen M,Xie LK,

.CLCA4 inhibits cell proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma by suppressing epithelial-mesenchymal transition via PI3K/AKT signaling[J].Aging (Albany NY),2018,10(10):2570-2584.

[18]Huang JL,Cao SW,Ou QS,

.The long non-coding RNA PTTG3P promotes cell growth and metastasis via up-regulating PTTG1 and activating PI3K/AKT signaling in hepatocellular carcinoma[J].Mol Cancer,2018,17(1):93-103.