肝硬化是各種慢性肝病進(jìn)展至以肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成、肝內(nèi)外血管增殖為特征的病理階段，失代償期可并發(fā)腹水、消化道出血、肝性腦病，甚至肝癌等嚴(yán)重后果

。中醫(yī)學(xué)并無(wú)此病名記載，根據(jù)肝硬化的病理變化和表現(xiàn)，可將其歸納于“積聚”“脅痛”“黃疸”等范圍。中醫(yī)認(rèn)為多種因素綜合作用于機(jī)體，導(dǎo)致肝絡(luò)瘀滯不通、疏泄失職，肝體失柔，而發(fā)展為肝硬化

。中醫(yī)藥在改善肝硬化癥狀和肝功能、改善肝內(nèi)血液循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等方面的優(yōu)勢(shì)已成為中西醫(yī)共識(shí)

。劉華寶教授是重慶市名中醫(yī)，第三批全國(guó)優(yōu)秀臨床人才，國(guó)務(wù)院特殊津貼獲得者，重慶市中醫(yī)院肝病科主任，碩士研究生導(dǎo)師，從醫(yī)30余年，治療慢性肝病的經(jīng)驗(yàn)豐富。本研究基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合應(yīng)用的方法，通過(guò)收集、整理劉華寶教授門診治療肝硬化的方劑，總結(jié)劉華寶教授治療肝硬化的用藥規(guī)律，并進(jìn)一步對(duì)核心藥物的潛在作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行分析，為肝硬化的防治和藥物的開發(fā)提供思路。

1 資料與方法

1.1 處方來(lái)源與篩選 收集整理2018年1月1日至2020年6月30日我院劉華寶教授門診治療肝硬化的有效處方。參照2019年《肝硬化診治指南》和2019年《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》，篩選劉華寶教授門診所有明確診斷肝硬化患者的治療處方。根據(jù)2015年《中國(guó)藥典》對(duì)中藥名稱進(jìn)行統(tǒng)一，如“紫丹參”統(tǒng)一為“丹參”，“茵陳蒿”統(tǒng)一為“茵陳”等。

1.2 數(shù)據(jù)錄入 利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)(v2.5)軟件(由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供)，將上述篩選的處方錄入中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)臨床采集系統(tǒng)，分別錄入患者相關(guān)信息，包括一般信息如姓名、性別、年齡等，診療信息如四診、用藥等。錄入過(guò)程由單人錄入、雙人審核，以確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，從而建立劉華寶教授治療肝硬化的醫(yī)案數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)中的多種分析功能，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，包括頻次統(tǒng)計(jì)、組方規(guī)律、新方分析、網(wǎng)絡(luò)展示等。藥物頻次和歸經(jīng)按照從大到小進(jìn)行排序；四氣和五味按照所占比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析中設(shè)置支持個(gè)數(shù)為20，置信度為0.9，通過(guò)“規(guī)則分析”獲得藥物組合出現(xiàn)的頻次和置信度，按照出現(xiàn)頻次和置信度從大到小進(jìn)行排序；基于熵聚類分析法的新方分析中，設(shè)置相關(guān)度為10，懲罰度為6，分析獲得核心藥物組合，并在此基礎(chǔ)上獲得新方組合。

1.4 核心藥物潛在靶點(diǎn)分析 將中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)分析獲得的核心藥物導(dǎo)入中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)使用數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)值Score cutoff為20，Adjusted P value為0.05，分析獲得核心藥物的活性成分和潛在靶點(diǎn)，并構(gòu)建核心藥物的“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能基因本體論(GO)功能注釋，采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 用藥頻次 篩選出劉華寶教授治療肝硬化相關(guān)疾病門診處方99首，其中所包含中藥188味，出現(xiàn)頻次≥20次的中藥有25味，見(jiàn)表1。排名前10位的分別是柴胡、黃芩、丹參、白術(shù)、鱉甲、佛手、郁金、茯苓、白芍、當(dāng)歸。

58到家今年員工已經(jīng)有6000多人，在我看來(lái)，全世界只有兩家家政公司，一家叫58到家一家叫其他。58到家現(xiàn)在還在持續(xù)投入技術(shù)研發(fā)，要養(yǎng)活很多員工，做很多產(chǎn)品，但這些投入都不是靠外面的輸血。關(guān)注好自己，就會(huì)發(fā)現(xiàn)自己活得越來(lái)越好，規(guī)模不停壯大，時(shí)間就會(huì)把你推上去。

2.6 核心藥物的生物信息學(xué)分析 將中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)分析獲得的核心藥物柴胡、黃芩、丹參、白術(shù)、鱉甲五味藥導(dǎo)入BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)獲得82個(gè)有結(jié)構(gòu)信息的化合物，包括Beta-humulene(β-葎草烯)、Caryophyllene(石竹烯)、8-nonenoic acid(8-壬烯酸)、Alpha-linolenic acid(α-亞麻酸)和Alpha-limonene(α-檸檬烯)等。核心藥物的潛在靶點(diǎn)包括醇脫氫酶1C(ADH1C)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)、鈣電壓門控通道亞單位α1D(CACNA1D)、鈣電壓門控通道亞單位α1A(CACNA1A)、N-甲基-D-天冬氨酸NMDA受體亞基2A(GRIN2A)、腺苷受體A1(ADORA1)、雌激素受體1(ESR1)、鈉電壓門控通道α亞基5(SCN5A)、白細(xì)胞介素1β(IL1B)、鉀電壓門控通道亞家族Q成員1(KCNQ1)和利鈉肽A(NPPA)等。潛在靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的疾病包括疼痛、偏頭疼、哮喘、不明原因疼痛、心律失常和止痛劑等(圖4)。

2.4 核心藥物網(wǎng)絡(luò)展示圖 設(shè)置支持個(gè)數(shù)為20，置信度為0.9，利用“網(wǎng)絡(luò)展示”功能得到核心藥物網(wǎng)絡(luò)展示圖，共6味中藥，分別為柴胡、黃芩、丹參、白術(shù)、鱉甲、佛手(圖3)。

2.5 新方組合 基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析，設(shè)置相關(guān)度為10，懲罰度為6，進(jìn)行聚類分析，利用熵層次聚類分析法對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行提取，得到核心藥物組合和新處方13首(表4、表5)。

例4.Shantou,then known as Swatow,was China’s third-largest port after Shanghai and Guangzhou and the port of departure of the Teochew diaspora...(China Daily,2018-05-23)(汕頭，廣州，潮州）

2.3 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律 利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)中的組方規(guī)律分析功能，設(shè)置支持個(gè)數(shù)為20，置信度為0.9，以藥物組合出現(xiàn)的頻次進(jìn)行排序，共有20個(gè)頻次≥20次的藥物組合，其中出現(xiàn)頻次前5的藥物組合由黃芩、柴胡、丹參、鱉甲和佛手組成(表3)。

近年來(lái)，南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在五年制醫(yī)學(xué)臨床本科專業(yè)采用PBL教學(xué)，我院對(duì)在急診外科的實(shí)習(xí)生也采用PBL教學(xué)進(jìn)行探索，我科在在泌尿外科見(jiàn)習(xí)生也試行PBL教學(xué)，在這方面也取得良好的效果[2-3]。在此基礎(chǔ)上，為探索泌尿外科住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)的PBL 教學(xué)方法，轉(zhuǎn)變現(xiàn)行的教學(xué)模式，切實(shí)提高住院醫(yī)師解決實(shí)際問(wèn)題的能力，進(jìn)行了本研究。

以藥物組合的置信度進(jìn)行排序，共有43個(gè)置信度≥0.9的藥對(duì)，其中出現(xiàn)置信度為1 的藥物組合由當(dāng)歸、柴胡、鱉甲、丹參、黃芩和佛手組成，表明這些藥物是劉華寶教授治療肝硬化最常用的藥物(表2)。

2.2 藥物性味、歸經(jīng) 結(jié)果顯示四氣頻次最高的為寒性，其次為溫性(圖1A)。五味中頻次最高的為苦味，辛味次之，具體結(jié)果見(jiàn)圖1B。藥物歸經(jīng)頻次最高為肝經(jīng)，其次為脾經(jīng)、胃經(jīng)(圖2)。

本研究運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了重慶市名中醫(yī)劉華寶教授治療肝硬化的用藥規(guī)律。研究結(jié)果顯示，劉華寶教授治療肝硬化常用藥物包括柴胡、黃芩、白術(shù)、丹參、鱉甲等，藥物功效分類顯示主要為疏肝健脾、活血祛瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等類藥。從四氣五味的分析結(jié)果看，性寒，味苦辛，歸肝、脾經(jīng)的藥物最多。劉華寶教授認(rèn)為諸因所致肝硬化，必伴見(jiàn)肝的氣血陰陽(yáng)發(fā)生異常變化，藏化于內(nèi)屬肝的氣陰兩虛，血行不暢；變現(xiàn)于外屬氣機(jī)失常和體用失調(diào)，病理過(guò)程各有所偏，或氣(陰)虛為主，或血瘀為主，瘀血阻絡(luò)既是致病因素，亦是病理產(chǎn)物，即實(shí)質(zhì)為肝脾氣虛、絡(luò)脈瘀阻，故治療法則為燮理體用，燮理氣機(jī)，和絡(luò)逐瘀

。徐列明等

認(rèn)為肝硬化的基本病機(jī)為正虛邪盛、肝絡(luò)受損、氣滯血瘀，治法當(dāng)以益精養(yǎng)肝、活血祛瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為主，與本研究的分析結(jié)果基本一致。

3 討論

進(jìn)一步的KEGG富集分析提示核心藥物的潛在靶點(diǎn)主要富集于Neuroactive ligand-receptor interaction、Calcium signaling pathway、CGMP-PKG signaling pathway、Oxytocin signaling pathway和Retrograde endocannabinoid signaling等信號(hào)通路(圖5)，由此可知核心藥物的潛在靶點(diǎn)主要涉及信號(hào)分子相互作用、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和氨基酸代謝等信號(hào)通路。潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程主要富集于Ion binding、Signal transducer activity、Cytoplasm、Plasma membrane、Signal transduction、Response to stress等，由此可知核心藥物的潛在靶點(diǎn)主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞間相互信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、脂肪酸代謝等過(guò)程(圖6)。

柴胡具有疏肝理氣升陽(yáng)的功效，黃芩具有瀉火解毒利膽的功效，柴胡、黃芩合用，可升清陽(yáng)，降濁陰，調(diào)轉(zhuǎn)厥陰少陽(yáng)、燮理陰陽(yáng)升降之樞機(jī)。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水的功效。鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，丹參活血通絡(luò)，二者合用具有強(qiáng)化和絡(luò)逐瘀之效?，F(xiàn)代研究顯示，柴胡的主要生物活性成分為柴胡皂苷，在減輕肝臟炎癥、抗肝纖維化方面發(fā)揮重要作用。在肝炎細(xì)胞和動(dòng)物模型中，柴胡皂苷d可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，降低炎癥因子IL1β、IL18的水平，升高肝臟細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)等的活性，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛(MDA)等的水平，從而減輕肝臟炎癥，抑制肝臟纖維化形成

。本研究基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析結(jié)果顯示柴胡和黃芩組合頻次最高。柴胡和黃芩在臨床中常作為藥對(duì)使用，如經(jīng)典方劑小柴胡湯中柴胡和黃芩配伍使用。黃芩中的主要成分為黃芩苷、黃芩素等，具有抗炎抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用

。研究顯示與柴胡、黃芩單用相比，柴胡黃芩配伍使用時(shí)不僅柴胡皂苷和黃芩苷的煎出量有一定的增加，而且藥對(duì)的抗炎抗氧化能力也有一定的增強(qiáng)

。丹參主要藥效成分為丹參酮、隱丹參酮等，是近年研究的熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種肝臟疾病如肝纖維化、藥物性肝損傷等肝臟疾病的防治研究中，且有部分成分已開發(fā)為新藥應(yīng)用于臨床。丹參酮類成分具有調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號(hào)通路和Nrf2/HO-1氧化應(yīng)激信號(hào)通路的作用，從而抑制TGF-β、IL6等炎癥因子的釋放，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的水平，通過(guò)上述抗炎抗氧化的作用，對(duì)肝纖維化產(chǎn)生保護(hù)作用

。臨床上白術(shù)常作為復(fù)方中的藥味之一應(yīng)用于酒精性肝纖維化的治療

，目前尚缺乏其在肝硬化中的機(jī)制研究。鱉甲應(yīng)用于肝硬化的治療已久，復(fù)方鱉甲軟肝片、鱉甲煎丸等均是以鱉甲作為主要藥味而開發(fā)出的治療肝纖維化、肝硬化的中成藥，現(xiàn)已在臨床中得到廣泛應(yīng)用

。本研究基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類新方分析共獲得13首新方，各新方功效側(cè)重不同。例如，“白芍、連翹、川楝子、白花蛇舌草”的新方組合具有清熱解毒、疏肝止痛的功效，“鱉甲_莪術(shù)_白花蛇舌草_水蛭”具有消積活血止痛的功效，臨床上可根據(jù)患者病癥不同而選擇加減。但上述結(jié)果是基于數(shù)據(jù)分析而獲得，其治療肝硬化的療效尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

某煤氣化項(xiàng)目采用殼牌Hybrid下行水激冷粉煤氣化工藝，生產(chǎn)6×104 m3/h有效氣CO和H2。其中煤粉儲(chǔ)倉(cāng)自身質(zhì)量約28.5 t，最大荷載75 t，該設(shè)備基礎(chǔ)支撐點(diǎn)采用4個(gè)，通過(guò)查詢稱重傳感器的選型手冊(cè)，k1=0.35， k2=0.85，k3=2.5。

11月16日，10個(gè)新成立的農(nóng)村集體經(jīng)濟(jì)組織獲得了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的登記證書。目前，全國(guó)已有超過(guò)13萬(wàn)個(gè)農(nóng)村集體經(jīng)濟(jì)組織完成改革，共確認(rèn)集體成員2億多人。

本研究進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)高頻核心藥物柴胡、黃芩、白術(shù)、丹參和鱉甲進(jìn)行分析，獲得潛在作用的靶點(diǎn)、信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程。潛在作用靶點(diǎn)主要包括與炎癥相關(guān)的IL1β，與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的ESR1、CACNA1D、CACNA1A，與乙醇分解代謝相關(guān)的ADH1C、ADORA1，與代謝有關(guān)的CYP11A1，和與水液代謝有關(guān)的NPPA等。信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程富集分析結(jié)果主要與細(xì)胞間相互信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、脂肪酸代謝等有關(guān)。在多種病因的刺激下，肝臟中出現(xiàn)代謝異常、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，發(fā)展為肝硬化，其中涉及復(fù)雜的病理生理過(guò)程。肝臟炎癥是肝纖維化、肝硬化形成的使動(dòng)因素，也貫穿于肝硬化的病理過(guò)程中。致炎因子IL1β可由TLR4/NF-κB信號(hào)通路及NLRP3炎癥小體共同調(diào)節(jié)表達(dá)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激影響肝硬化進(jìn)程。而既往有研究顯示柴胡中的主要成分柴胡皂苷d可通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體抑制IL1β表達(dá)，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

，這與本研究的藥物和靶點(diǎn)分析結(jié)果一致。多項(xiàng)研究顯示醇脫氫酶ADH1C基因的多態(tài)性與酒精性肝硬化的易感性密切相關(guān)，其突變雜合子等位基因可增加罹患酒精性肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)

。目前尚缺乏其他潛在靶點(diǎn)在肝硬化中的研究，但同時(shí)也提示它們可能作為肝硬化診斷或治療研究的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，挖掘了劉華寶教授治療肝硬化的遣方用藥規(guī)律，分析出常用藥物及藥物組合，由此挖掘出新方組合，并進(jìn)一步對(duì)核心藥物進(jìn)行了靶點(diǎn)和信號(hào)通路的分析，對(duì)深入理解和傳承劉華寶教授治療肝硬化的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)和思想提供了思路和方法。但以上研究是基于數(shù)據(jù)分析所獲得，核心藥物的獲得僅是根據(jù)藥物使用頻次等參數(shù)進(jìn)行篩選，而非從學(xué)術(shù)理論和對(duì)中藥的認(rèn)識(shí)出發(fā)所獲得，尚需進(jìn)行中醫(yī)理論和基礎(chǔ)研究的驗(yàn)證。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).肝硬化診治指南[J].中華肝臟病雜志,2019,27(11):846-865.

[2]徐列明,劉平,沈錫中,等.肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2019,39(11):1286-1295.

[3]張揚(yáng)武,羅偉生,陳姍,等.枇杷葉熊果酸對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用及對(duì)PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2017,33(4):517-521.

[4]何艷莎,劉華寶.劉華寶主任中醫(yī)師治療肝硬化經(jīng)驗(yàn)薈萃[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2016,37(6):3-5.

[5]張娜,晏旎,周蒙恩,等.柴胡皂苷d對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞活化后ROS形成及NLRP3炎性小體表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2020,31(4):805-809.

[6]Chen Y, Que R, Lin L,

. Inhibition of oxidative stress and NLRP3 inflammasome by Saikosaponin-d alleviates acute liver injury in carbon tetrachloride-induced hepatitis in mice[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2020,34:2058738420950593.

[7]白慶云,陶思敏,田錦鴻,等.黃芩對(duì)肝病的防治作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2020,45(12):2808-2816.

[8]潘燕,孫立弟.柴胡-黃芩藥對(duì)配伍前后有效成分比較研究[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào),2016,37(6):78-81.

[9]李敏,高凱,王華林,等.柴胡皂苷d-黃芩苷配伍對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠HSC的TLR4-NF-κB通路作用研究[J].陜西中醫(yī),2018,39(1):3-5.

[10]王蓉,王靜,宋復(fù)興,等.丹參素通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1和NF-κB/IκBα信號(hào)通路發(fā)揮抗大鼠肝纖維化的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2019,33(10):918.

[11]朱曉紅,王全楚,董曉鋒,等.蒙脫石散、雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合參苓白術(shù)散治療酒精性肝病的臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2018,28(3):178-180.

[12]鱉甲煎丸治療肝纖維化臨床應(yīng)用專家共識(shí)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝膽病學(xué)分會(huì),中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2020,30(6):577-578，584.

[13]Lin L, Que R, Shen Y,

. Saikosaponind alleviates carbontetrachloride induced acute hepatocellular injury by inhibiting oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation in the HL7702 cell li-ne[J]. Mol Med Rep, 2018,17(6):7939-7946.

[14]何晶晶,張嶺漪,張亞武,等.乙醇脫氫酶1C基因多態(tài)性與酒精性肝硬化易感性的Meta分析[J].中國(guó)普通外科雜志,2018,27(7):870-879.