楊 春，喬大河，郭 燕，梁思慧，林開勤，陳正武

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

氨基酸是茶葉中重要的呈味物質(zhì)，是綠茶鮮味、甜味的主要貢獻物質(zhì)，其含量與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)。茶氨酸是一種非蛋白氨基酸，是茶葉中含量較豐富的氨基酸組分，不僅直接決定茶葉的鮮爽風味，還是茶葉中重要的功能性成分，具備防治神經(jīng)損傷，抑制癌細胞侵襲、遷移，抗抑郁等多種生理功能，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應用廣泛。選育、利用高氨基酸和高茶氨酸的功能性茶樹品種，是提高茶葉產(chǎn)品附加值的關(guān)鍵，也是茶樹品種選育的重要導向。

行業(yè)標準NY/T 2031—2011《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評價規(guī)范 茶樹》規(guī)定，茶樹春季頭輪一芽二葉新梢中氨基酸總量在5.0%以上的為特異高氨基酸資源，茶氨酸含量在3.0%以上的為特異高茶氨酸資源。高氨基酸和高茶氨酸品種的選育是茶樹品種選育工作的關(guān)鍵，然而，自然界中高氨基酸和高茶氨酸茶樹資源稀少，茶氨酸含量大于3.0%的特異高茶氨酸資源尤為稀缺。研究人員在湖南選育出特早生高氨基酸茶樹品種保靖黃金茶1號，并從75份黃金茶群體資源中篩選出36份高氨基酸資源、1份高茶氨酸資源；在湖北選出2個高氨基酸優(yōu)良品系E1和20-2-1；在浙江選育出中白1號、中黃1號和景白1號等白化類高氨基酸茶樹新品種；在四川選育出川茶2號，其連續(xù)3年的春季新梢氨基酸總量在5.0%以上。此外，方開星等從218份茶樹資源中篩選出高氨基酸材料55份、高茶氨酸材料13份。

貴州省現(xiàn)有茶園面積近50萬hm，品種主要為福鼎大白茶、龍井43等，存在栽培品種較單一、茶葉品質(zhì)同質(zhì)化等問題。同時，貴州擁有豐富的野生茶組植物資源和地方群體品種，其中可能蘊含著大量生化成分含量特異的資源。依托貴州豐富多樣的茶樹資源，選育和利用好貴州特色高氨基酸和高茶氨酸茶樹品種，對于打造貴州綠茶特色產(chǎn)品、提高市場競爭力來說意義重大。為此，本研究對從資源圃收集保存和原地采集的115份貴州地方茶樹資源的氨基酸總量和茶氨酸含量進行測定，分析其特征，并從中篩選出特異高氨基酸和特異高茶氨酸資源，以期為貴州優(yōu)質(zhì)高氨基酸、高茶氨酸茶樹品種的選育打下種質(zhì)資源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II分析型液相色譜純化系統(tǒng)、G1314F紫外檢測器，美國安捷倫公司；TU-1800紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

茶氨酸標準品購自合肥博美生物科技有限責任公司。乙腈購自美國天地(TEDIA)有限公司，磷酸購自廣東翁江化學試劑有限公司，均為色譜純級。十二烷基磺酸鈉(SDS)，分析純，購自美國Sigma公司。

1.2 材料

115份材料均取自貴州省，其中，45份材料保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所湄潭種質(zhì)資源圃，34份采集自地方群體品種，36份為野生茶樹資源。將這115份茶樹資源的基本信息整理于表1。

表1 115份茶樹資源的基本信息

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

于2020年3—5月，按1芽2葉標準采摘鮮葉原料，采用微波殺青法制備干茶茶樣。

1.3.2 檢測方法

參照國家標準GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測定 高效液相色譜法》，采用沸水浸提法制備茶湯，用于后續(xù)檢測。

氨基酸總量檢測，參照國家標準GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》，采用分光光度法進行。

茶氨酸檢測，參考岳婕等，采用高效液相色譜法進行。色譜條件如下：色譜柱為依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A相為SDS-磷酸溶液(2.1 g SDS、0.71 mL磷酸，超純水定容至500 mL)，B相為100%乙腈，A、B相的體積比為68∶32。檢測條件：柱溫40 ℃，運行時間15 min，進樣量10 μL，檢測波長203 nm。

樣品檢測時均重復測定3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用茶氨酸含量與氨基酸總量的百分比表征茶氨酸占比。

采用香農(nóng)-維納指數(shù)(′)評價遺傳多樣性。

使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)。利用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：采用Spearman相關(guān)系數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析；對有顯著(<0.05)差異的，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。利用TBtools軟件，基于歐氏距離(Euclidean)，采用全連接法(complete-linkage)進行聚類分析，并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 115份茶樹資源的氨基酸總量和茶氨酸含量分析

全部115份茶樹資源的氨基酸總量在0.95%(SD-19)～7.96%(石苔14號)(表2)，平均值為3.40%(表3)，變異系數(shù)為41.61%，香農(nóng)-維納指數(shù)為1.998；茶氨酸含量不超過3.80%，以WM18的最高，平均值為1.58%，變異系數(shù)為61.47%，香農(nóng)-維納指數(shù)為1.957，來自三都的16份資源(編號GT80～GT95)均未檢測到茶氨酸；茶氨酸占比不超過67.66%，以LP050最高，平均值為40.32%，變異系數(shù)為48.41%，香農(nóng)-維納指數(shù)為1.344?？偟膩砜?，這115份茶樹資源中，氨基酸總量的變異系數(shù)最小、遺傳多樣性最大，說明貴州地方茶樹種質(zhì)資源中氨基酸總量類型較為豐富。

表2 115份茶樹資源的氨基酸總量、茶氨酸含量和茶氨酸占比

表3 115份茶樹資源氨基酸總量、茶氨酸含量和茶氨酸占比的統(tǒng)計分析

對這115份茶樹資源氨基酸總量的分布特征進行研究(圖1)，可以看出，分布在3.0%～<4.0%的種質(zhì)材料數(shù)量最多，有32份。氨基酸總量在5.0%以上的有11份材料，分別是石苔14號(7.96%)、WM18(5.79%)、銅沿668(5.74%)、石苔2號(5.65%)、鳥王種1號(5.47%)、LP055(5.46%)、本莊3號(5.34%)、本莊2號(5.23%)、貴定鳥王種(5.20%)、銅沿00993(5.17%)和LP051(5.06%)，可以將其認定為特異高氨基酸資源。

圖1 115份茶樹資源的氨基酸總量分布

對這115份茶樹資源的茶氨酸含量分布特征進行研究(圖2)，可以看出，分布在1.0%～<2.0%和2.0%～<3.0%的數(shù)量最多，分別有41份和40份。茶氨酸含量在1.0%以下的有31份，其中，采集自三都的SD系列的16份茶樹資源均未檢出茶氨酸。茶氨酸含量在3.0%以上的有3份，分別是WM18(3.80%)、石苔14號(3.59%)和LP050(3.36%)，可以將其認定為特異高氨基酸資源。

圖2 115份茶樹資源的茶氨酸含量分布

對這115份茶樹資源的茶氨酸占比分布特征進行研究(圖3)，可以看出，分布較多的為40.0%～<50.0%和50.0%～<60.0%，分別有36份和41份。有19份資源的茶氨酸占比不足10.0%。

圖3 115份茶樹資源的茶氨酸占比分布

2.2 不同地區(qū)茶樹資源氨基酸總量和茶氨酸含量的對比分析

根據(jù)115份茶樹資源的來源地(湄潭、貴定、石阡、沿河、黎平、望謨、三都和普安)，將樣品分成8組，對各組茶樹資源的氨基酸總量和茶氨酸含量進行統(tǒng)計分析(表4)，可以看出，來自貴定、石阡和黎平的茶樹資源，氨基酸總量和茶氨酸含量較為豐富，其氨基酸總量和茶氨酸含量均顯著(<0.05)高于普安、湄潭、三都、望謨的茶樹資源。三都和普安的茶樹資源，氨基酸總量和茶氨酸含量較低，均顯著(<0.05)低于其他6個來源地。

表4 不同地區(qū)茶樹資源的氨基酸總量和茶氨酸含量特征

2.3 115份茶樹資源氨基酸總量與茶氨酸含量的聚類分析

依據(jù)氨基酸總量和茶氨酸含量，對115份茶樹資源進行聚類分析，共將其分為5個類群(圖4)。類群Ⅰ包含33份資源，氨基酸總量和茶氨酸含量分別為4.26%～5.79%和1.75%～3.80%(表5)，主要特點為氨基酸總量和茶氨酸含量較高，顯著(<0.05)高于類群Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，主要來自黎平(13份)、石阡(9份)和望謨(6份)，貴定的3份資源全部聚在類群Ⅰ。石苔14號以遠高于其他資源的氨基酸總量和較高的茶氨酸含量單獨構(gòu)成一類(類群Ⅱ)，其氨基酸總量和茶氨酸含量分別為7.96%和3.59%。類群Ⅲ包含37份資源，主要來自湄潭(13份)、石阡(9份)和望謨(7份)，其氨基酸總量和茶氨酸含量適中，含量分別為3.07%～4.22%和1.22%～2.29%。類群Ⅳ包含資源18份，主要來自普安(9份)和望謨(5份)，特點為氨基酸總量和茶氨酸含量相對較低，含量分別為2.24%～2.95%和0.52%～1.52%。類群Ⅴ包含26份資源，氨基酸總量和茶氨酸含量分別為0.95%～1.92%和0～0.79%，顯著(<0.05)低于其他類群，主要來自三都(16份)和普安(8份)。

表5 不同類群茶樹的氨基酸總量和茶氨酸含量比較

圖4 115份茶樹資源氨基酸總量和茶氨酸含量的聚類熱圖

此外，從聚類分析結(jié)果還可以看出各來源地茶樹資源在氨基酸總量和茶氨酸含量方面的一些特性，除LP059外的13份黎平資源均分布在第Ⅰ類，說明黎平的茶樹資源整體具有較高的氨基酸總量；望謨的茶樹資源分布于除類群Ⅱ外的其余4個類群中，是8個來源地中分布最廣的，說明望謨的茶樹資源氨基酸總量和茶氨酸含量變異較大，資源類型豐富；三都的16份資源全部聚在類群Ⅴ，推測三都的茶樹資源氨基酸總量整體偏低。

3 討論

氨基酸和茶氨酸對綠茶、紅茶、烏龍茶等茶葉產(chǎn)品的品質(zhì)具有積極的作用，含有較高含量氨基酸和茶氨酸的茶樹品種，所制產(chǎn)品鮮爽甘醇，廣受市場歡迎。為選育適合貴州乃至西南茶區(qū)種植的高氨基酸、高茶氨酸茶樹品種，本研究對收集的115份貴州當?shù)夭铇滟Y源的氨基酸總量和茶氨酸含量進行檢測，共獲得特異高氨基酸(≥5.0%)茶樹資源11份、特異高茶氨酸(≥3.0%)資源3份。

茶氨酸是茶樹體內(nèi)最重要的一種氨基酸，約占游離氨基酸總量的30%～60%。方開星等分析了218份資源，發(fā)現(xiàn)其茶氨酸占比在0～78%，主要分布在20.0%～50.0%，少數(shù)在60.0%以上。本研究的115份茶樹資源中，有77份的茶氨酸占比在40.0%～60.0%，有6份的茶氨酸占比在60.0%以上。一般來說，茶葉中的茶氨酸含量在1.0%～2.0%，大于3.0%的為特異高茶氨酸茶樹資源。趙洋等從75份黃金茶資源中篩選出1份高茶氨酸資源HJ-hT(茶氨酸含量3.1%)；方開星等從218份茶樹資源中篩選出13份高茶氨酸茶樹資源；楊春等從22份黎平地方茶樹資源中篩選出2份高茶氨酸茶樹資源，其中LP-12于2019年取樣檢測茶氨酸含量為3.32%。本研究測定LP-12的茶氨酸含量為2.68%，仍表現(xiàn)出一定的高茶氨酸特性。今后，可將其作為高茶氨酸茶樹資源加以關(guān)注。

貴州茶樹栽培利用歷史悠久，地方茶樹資源豐富多樣。不同地方茶樹資源的氨基酸總量和茶氨酸含量差異明顯，其中，貴定、黎平、石阡資源中存在多個特異高氨基酸和特異高茶氨酸資源，后續(xù)可考慮在這些地區(qū)擴大茶樹資源收集鑒選力度，從中挖掘高氨基酸和高茶氨酸茶樹種質(zhì)。

茶樹中的氨基酸和茶氨酸含量易受施肥、修剪等栽培管理措施的影響。在本研究收集的115份資源中，除三都和普安的為野生茶組植物外，其余均為茶()，來自湄潭、貴定、石阡和沿河的地方茶樹資源保存于資源圃內(nèi)，處于正常水平的施肥、修剪管理模式下，黎平、望謨?yōu)樵夭杉牡胤饺后w品種資源，生長過程中除春季采摘鮮葉外，施肥、修剪等人工干預較少。本研究顯示，資源圃保存資源與原地采集資源在氨基酸和茶氨酸含量上并無顯著差異，說明其含量更多地受遺傳特性的影響。后續(xù)，可采用春季取生化樣、秋季取扦插穗條的方式，加快對地方群體品種資源的精準收集與異地保護。

本研究中，三都和普安的資源均為野生茶組植物，三都為突肋茶()，普安為大廠茶()。報道顯示，這2類野生茶組植物的氨基酸總量與茶氨酸含量明顯低于茶，本研究進一步證實了這一結(jié)論。其中，來自三都的突肋茶資源在茶氨酸方面表現(xiàn)獨特，16份資源均未檢測到茶氨酸，表現(xiàn)出更原始的生化性狀。這可能是因為，與來自普安的大廠茶相比，突肋茶與茶種的遺傳距離更遠，因而保留了更多的祖先茶組植物性狀。