李柄霖，丁德東，何 靜 ，李彥湘，趙吉桃，候彩霞，趙 倩

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

枸杞(Lycium bararum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生落葉灌木，具有抗衰老、抗癌癥、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種功能[1]。中國有7個(gè)種和3個(gè)變種，主要分布在寧夏、甘肅和青海等地[2]。據(jù)報(bào)道，真菌性病害對枸杞植株的危害最大，主要有根腐病、葉枯病和灰斑病等，其中枸杞根腐病是最主要的病害之一[3]。

根腐病作為世界性作物病害，是一種危害極大的維管束系統(tǒng)病害，主要危害植株莖部和根部，其致病因素復(fù)雜，潛伏期長，不易被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其防治藥劑的選擇存在一定困難。發(fā)病初期植株葉片發(fā)黃，枝條萎縮，根部呈褐色，隨后根系腐爛；后期外皮脫落，只剩木質(zhì)部，剖開病莖可見維管束變?yōu)楹稚?，?yán)重時(shí)枝條或全株枯死[4-5]。目前，植物根腐病的防治主要以化學(xué)防治為主，但常造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及危害人類健康等問題；此外，還易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，嚴(yán)重影響枸杞品質(zhì)。因此，如何安全、高效地防治根腐病，已成為枸杞生產(chǎn)中亟待解決的問題之一。

近年來，采用生防微生物促進(jìn)植物生長并提高其抗病性的研究備受關(guān)注，如叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌[6]。AM真菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要成員之一，存在于不同類型生態(tài)環(huán)境中，能夠與80%的陸生植物根系形成互惠共生體，通過其強(qiáng)大的菌根、菌絲網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)宿主植物根系對土壤水分和養(yǎng)分的吸收，提高植物抗病性，促進(jìn)植物生長，在一定程度上緩解逆境脅迫帶來的損傷，對生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)有重要作用[7-8]。同時(shí)，AM真菌具有廣泛的生物活性，能夠抑制真菌、細(xì)菌和病毒等植物病原微生物的侵染或生長，從而發(fā)揮提高植物抗病性的作用[9]。當(dāng)前，利用AM真菌開展根腐病等土傳病害的生物防治已成為植物與微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)是AM真菌家族的重要成員，已有報(bào)道其具有顯著提高蘆筍根系相關(guān)防御酶活性、增強(qiáng)植株對病原菌抗性的作用[10]，但其作為生防微生物能否對枸杞根腐病產(chǎn)生抗性尚不明確。本研究以枸杞實(shí)生苗為試材，通過盆栽試驗(yàn)，設(shè)置不同接種處理，探究根內(nèi)根孢囊霉對枸杞植株的促生作用及抗根腐病能力的影響，旨在為利用根內(nèi)根孢囊霉開展枸杞根腐病的生物防治提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試AM真菌：根內(nèi)根孢囊霉(R.intraradices)，編號為BGC-BG09，原始菌種購自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所。經(jīng)玉米擴(kuò)繁后，制成含有沙土、可侵染根段和孢子(每克菌劑約30個(gè))的混合物作為接種材料。

供試病原菌：根腐病主要致病菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)分離自枸杞根腐病病株，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)前7 d在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)活化處理后備用。參考王倡憲等[11]的方法制備菌懸液。

育苗基質(zhì)：沙壤土和營養(yǎng)土按1∶1 (質(zhì)量比)混合，并在121 ℃下滅菌2 h，冷卻后備用。

供試植株：供試枸杞植株為寧杞1號3年生實(shí)生苗，購自甘肅省景泰縣枸杞主產(chǎn)區(qū)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

采用盆栽試驗(yàn)，將滅菌后的土壤裝入36 cm×22 cm×15 cm (高×外徑×內(nèi)徑)的花盆內(nèi)，每盆8.5 kg。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理：(1) 不接種微生物(對照組，CK)；(2) 單接種病原菌腐皮鐮刀菌 (FS)；(3) 單接種根內(nèi)根孢囊霉 (RI)；(4)接種根內(nèi)根孢囊霉后再接種腐皮鐮刀菌 (RI+FS)。RI和RI+FS處理在3月上旬移栽的同時(shí)將根內(nèi)根孢囊霉菌劑均勻地撒在枸杞植株須根部，與須根充分接觸，施用量為每株10 g；CK處理按同樣的方法接入10 g滅活菌劑作為對照，移栽后保持水分正常供應(yīng)。4月下旬根內(nèi)根孢囊在枸杞根系成功定殖，而后采用傷根法，用100 mL腐皮鐮刀菌孢子懸浮液(105CFU/mL)進(jìn)行灌根處理，CK組以等量無菌水進(jìn)行灌根處理。分別于菌根菌接種成功后30 d (花期)、60 d (初果期)、90 d (盛果期)和120 d(末果期)測定枸杞根系侵染率。每處理9盆，每3盆為1個(gè)重復(fù)，共36盆，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試驗(yàn)期間，保持各植株正常水肥管理。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 發(fā)病率和病情指數(shù)

接種病原菌后對枸杞植株進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)查，待枸杞表現(xiàn)出發(fā)病癥狀后，每天調(diào)查1次枸杞葉片的發(fā)病情況，記錄發(fā)病葉片數(shù)，計(jì)算發(fā)病率：發(fā)病率=(發(fā)病植株的株數(shù)/總株數(shù))×100%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對病情進(jìn)行分級。0級：葉片無癥狀，根莖部無病斑，無腐爛癥狀；1級：葉片黃化面積不超過葉片總面積的5%，根莖部出現(xiàn)病斑，莖基部表皮有褐變，褐變面積小于5%，根部腐爛程度不超過15%；2級：葉片黃化面積占葉片總面積的5%～20%，根部病斑擴(kuò)大，根莖部表皮褐變、組織腐爛壞死，褐變面積為6%～30%，根部腐爛程度為15%～30%；3級：葉片黃化面積占葉片總面積的20%～50%，根部病斑繼續(xù)擴(kuò)大，根莖部表皮明顯褐變，褐變面積為30%～50%，根部腐爛程度在30%～50%之間；4級：葉片黃化面積占葉片總面積的50%～75%，根部明顯腐爛，莖基部完全變褐，褐變面積大于50%；5級：葉片黃化面積大于75%，植株枯死。按以下公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[12]：

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×相對應(yīng)級數(shù)值)/(總?cè)~數(shù)×最高級值)]×100；

防治效果=(FS處理病情指數(shù)-RI+FS處理病情指數(shù))/FS處理病情指數(shù)×100%。

1.3.2 枸杞形態(tài)指標(biāo)、葉綠素含量和菌根侵染率的測定

接種根內(nèi)根孢囊霉90 d后發(fā)現(xiàn)枸杞植株的侵染率達(dá)到最大值，故此時(shí)收獲枸杞植株用于測定形態(tài)指標(biāo)。用卷尺和游標(biāo)卡尺分別測量苗木株高和基徑；收獲后稱其鮮質(zhì)量，121 ℃殺青后于烘箱中65 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量后為其干質(zhì)量；葉綠素含量采用丙酮浸提法測定[13]；采用醋酸墨水法[14]對菌根染色，并在生物顯微鏡(奧特光學(xué)BK6000)下觀察菌根定殖情況，計(jì)算菌根侵染率：侵染率=(侵染的根段數(shù)/檢測根段數(shù))×100%；根內(nèi)根孢囊霉孢子密度采用濕篩傾析法測定[15]。

1.3.3 抗病相關(guān)酶活性的測定

接種根內(nèi)根孢囊霉90 d后，稱取鮮葉0.2 g，用錫箔紙包裝后經(jīng)液氮速凍置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測定抗病相關(guān)酶活性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定；過氧化物酶(peroxidase，POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[16]；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammomia lyase，PAL)采用紫外分光光度法測定；多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)采用鄰苯二酚氧化法測定[17]；過氧化氫酶(catalase，CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)參考NAKANO等[18]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2019進(jìn)行整理和作圖，用IBM SPSS 26.0進(jìn)行單因素one-way ANOVA方差分析，用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種根內(nèi)根孢囊霉對枸杞根腐病發(fā)病率及病情指數(shù)的影響

由表1可知：與FS處理相比，RI+FS處理的發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低55.56%和62.79%，防治效果達(dá)到63%。說明接種根內(nèi)根孢囊霉可降低根腐病的發(fā)病率，增加枸杞的抗病性，減輕根腐病危害程度。

表1 不同接種處理下枸杞根腐病發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果Tab.1 Incidence rate,disease index and control effect of Lycium barbarum root rot under different inoculation treatments

2.2 接種根內(nèi)根孢囊霉對枸杞形態(tài)指標(biāo)的影響

由表2可知：與FS處理相比，除CK外其他處理的枸杞株高、莖粗、干質(zhì)量及鮮質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)。與CK相比，RI處理的株高增加54.86%、莖粗增加35.94%、鮮質(zhì)量增加126.91%、干質(zhì)量增加148.18% (P<0.05)。說明接種根內(nèi)根孢囊霉可增加枸杞生物量，促進(jìn)枸杞生長。

表2 不同接種處理對枸杞生長參數(shù)的影響Tab.2 Effects of different inoculation treatments on the growth parameters of L.barbarum

2.3 接種根內(nèi)根孢囊霉對枸杞葉綠素含量的影響

由表3可知：與CK相比，RI處理的枸杞葉綠素a和總?cè)~素含量分別顯著提高80.15%和57.14%(P<0.05)，葉綠素b含量提高30.77%。相較于FS處理，RI+FS處理的葉片葉綠素a和總?cè)~綠素含量分別顯著提高155.56%和85.01% (P<0.05)，葉綠素b含量增加27.27%。說明接種根內(nèi)根孢囊霉可提高枸杞植株對光能的利用。

表3 不同接種處理對枸杞葉綠素含量的影響Tab.3 Effects of different inoculation treatments on chlorophyll content of L.barbarum mg/g

2.4 枸杞根系菌根定殖情況

由圖1可知：根內(nèi)根孢囊霉成功侵染枸杞根系并形成泡囊、菌絲、孢子和叢枝，說明根內(nèi)根孢囊霉能與枸杞根系形成良好的共生關(guān)系。

圖1 根內(nèi)根孢囊霉在枸杞根系中的定殖狀況Fig.1 Colonization of Rhizophagus intraradices in roots of Lycium barbarum

2.5 枸杞根系叢枝菌根侵染率

由圖2可知：菌根真菌對枸杞根系的侵染率隨接種時(shí)間增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且RI和RI+FS處理組之間差異顯著(P<0.05)。30 d時(shí)，RI和RI+FS處理的侵染率分別為10.80%和8.95%；60 d時(shí)，RI和RI+FS處理的侵染率分別為15.33%和13.89%；90 d時(shí)，侵染率達(dá)最大值，RI和RI+FS處理分別為45.61%和40.42%；120 d時(shí)侵染率降低，RI和RI+FS處理分別為43.73%和38.71%。CK組未檢測到侵染。

圖2 不同生長階段枸杞根系菌根侵染率Fig.2 Mycorrhizal infection rate of L.barbarum root at different growth stages

2.6 接種根內(nèi)根孢囊霉對枸杞相關(guān)防御酶活性的影響

由圖3可知：RI處理可提高枸杞植株防御酶(PPO、POD、SOD、PAL、APX和CAT)的活性。相較于CK，接種90 d后RI處理的PPO、POD、SOD、PAL、APX和CAT活性分別增加66.21%、67.36%、36.28%、24.25%、47.13%和66.05%；FS處理的枸杞植株P(guān)PO、POD、SOD、APX和CAT活性相較于CK也有不同程度的上升，但差異不顯著(P>0.05)；RI+FS處理后，枸杞植株葉片防御酶(PPO、SOD、PAL、APX和CAT)活性分別比FS處理顯著增加60.81%、51.72%、88.31%、57.54%和48.13% (P<0.05)。說明根內(nèi)根孢囊霉與植株根系建立共生關(guān)系的過程中能激活枸杞抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，從而提高根腐病抗性。

圖3 不同接種處理對枸杞抗病相關(guān)防御酶活性的影響Fig.3 Effects of different inoculation treatments on the activities of disease-resistance related defense enzymes of L.Barbarum

3 討論

劉潤進(jìn)等[19]研究發(fā)現(xiàn)：AM真菌可促進(jìn)植物營養(yǎng)元素和水分吸收，使植株生長更旺盛，有助于植株抗病性的提高，其作為生防菌調(diào)控植物病害的生理機(jī)制具有重要作用。AM真菌通過發(fā)達(dá)的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)大根系吸收范圍，提升宿主植物對土壤養(yǎng)分的吸收與利用能力[20]，與非菌根化植株相比，高營養(yǎng)水平的菌根化植株會表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵御病原菌侵染能力。植物受到病原菌侵害造成的生物量損失和功能損傷可通過與AM真菌建立的共生體得到補(bǔ)償[21-22]。本研究通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在自然條件下，接種AM真菌能夠侵染枸杞植株根系，形成菌根共生體。在接種根內(nèi)根孢囊霉 90 d時(shí)侵染率達(dá)到峰值，在120 d時(shí)侵染率呈下降趨勢，其原因可能是病原菌的致病性所致，但是否還存在其他因素的影響有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還探明了AM真菌對枸杞生長和根腐病病原物的抑制作用、相關(guān)生理變化及AM真菌—宿主植物—病原物之間的組合效應(yīng)。本研究表明：接種根內(nèi)根孢囊霉葉綠素含量均高于其他處理且發(fā)病率和病情指數(shù)同對照相當(dāng)，維持在較低水平。與CK相比，RI處理下株高增加54.86%，莖粗增加35.94%，鮮質(zhì)量增加126.91%，干質(zhì)量增加148.18%，這與前人在景天三七(Sedum aizoon)[23]上研究的結(jié)果類似。該結(jié)果表明：在病原菌脅迫下，菌根化枸杞的生物量和葉綠素含量均有不同幅度的增加。接種根內(nèi)根孢囊霉可促進(jìn)植株根系發(fā)育和營養(yǎng)元素吸收，減輕病原菌對根系造成的傷害，間接增強(qiáng)枸杞的抗根腐病能力。

AM真菌與植物根系建立共生關(guān)系的過程中能誘導(dǎo)植物啟動防御反應(yīng)[24]，病原菌侵染植物時(shí)AM真菌能及時(shí)誘發(fā)一系列生理生化變化以增強(qiáng)植物多套防御體系，提高植物系統(tǒng)抗性。有研究發(fā)現(xiàn)：接種摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)可顯著提高鏈孢霉(Neurosporacrasasp.)侵染的紫蘇根系CAT、POD和SOD活性，減輕病原菌對植物根系造成的損害，提高植物根系對病原菌的抵抗能力[25]。已有研究表明：接種根內(nèi)根孢囊霉可顯著提高蘆筍根系SOD和APX活性，增強(qiáng)植株對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的抗性[26-28]。本研究也發(fā)現(xiàn)：RI+FS處理下枸杞植株防御酶(PPO、SOD、PAL、APX和CAT)活性均顯著高于FS處理 (P<0.05)。出現(xiàn)這種情況的原因一方面可能是根內(nèi)根孢囊霉與植株根系建立共生關(guān)系的過程中能激活枸杞抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，從而提高根腐病抗性；另一方面可能是根內(nèi)根孢囊霉侵染枸杞根系，使根系皮層細(xì)胞壁變厚以構(gòu)筑抵抗病原菌侵入形成機(jī)械保護(hù)屏障，激活植株防御體系，調(diào)節(jié)根系分泌物，并維持較高的酶活性從而提高宿主植株抗病性。通過本研究可以初步確定接種根內(nèi)根孢囊霉對枸杞生長和抗根腐病過程具有重要作用，但在基因水平上是如何調(diào)控防御酶活性的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)植物抗病性還有待進(jìn)一步研究。今后應(yīng)加強(qiáng)枸杞病害相關(guān)酶、物質(zhì)代謝和調(diào)控信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)根腐病系統(tǒng)抗性的作用及調(diào)控基因表達(dá)的研究，從分子機(jī)理進(jìn)一步闡釋AM真菌調(diào)控植物病害的應(yīng)答效應(yīng)。

4 結(jié)論

接種根內(nèi)根孢囊霉可促進(jìn)枸杞生物量的積累，提高葉綠素含量，降低根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)，增加相關(guān)防御酶的活性從而增強(qiáng)植株對根腐病的抗性，減輕根腐病的發(fā)生和危害。本研究結(jié)果有助于理解AM真菌作為生防微生物對枸杞植株產(chǎn)生的促生作用和抗病生理機(jī)理，對枸杞生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。