史曉晶，王華杰，石 瑞，趙麗娟

(忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000)

由茄鏈格孢菌(Alternaria solaniSorauer)侵染所致的早疫病(early blight)是番茄的重要病害之一[1-3]，其典型病癥是在葉片上造成黑斑，黑斑上帶有同心圓狀的輪紋[4]。該病害普遍發(fā)生于番茄的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期，嚴(yán)重時(shí)造成落葉、落果和斷枝，減產(chǎn)35%～80%[5-8]。目前仍以加強(qiáng)田間管理和噴施殺菌劑為主要防治手段[9]，且噴施殺菌劑是在病害發(fā)生后最快速、有效的解決方式[10]。

啶菌噁唑(pyrisoxazole，SYP-Z048)是中國(guó)沈陽(yáng)化工研究院開(kāi)發(fā)的新型甾醇脫甲基抑制劑類(lèi)(DMIs)殺菌劑[11]，其作用位點(diǎn)是C14-脫甲基化酶，通過(guò)抑制該酶的活性而抑制細(xì)胞膜中甾醇的生物合成[12]，對(duì)茄鏈格孢菌(A.solani)[11]、灰霉病菌(Botrytis cinerea)[13-14]、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)[15]、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)[16]、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)[17]和辣椒炭疽病菌(Colletotrichum scoville)[18]等的生長(zhǎng)均具有強(qiáng)烈的抑制作用。DMIs殺菌劑是易產(chǎn)生抗藥性的殺菌劑之一，存在中度抗性風(fēng)險(xiǎn)[12]，長(zhǎng)期頻繁使用會(huì)使該類(lèi)藥劑的藥效下降，出現(xiàn)抗藥性問(wèn)題，因此，需應(yīng)加強(qiáng)該殺菌劑的抗藥性檢測(cè)及抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以便于制訂抗藥性治理策略，延緩抗藥性發(fā)展。

抗性菌株的適合度是評(píng)價(jià)其抗性風(fēng)險(xiǎn)的重要參數(shù)[19]，代表其生存能力。CHEN等[16]通過(guò)誘導(dǎo)獲得桃褐腐病菌抗啶菌噁唑菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)啶菌噁唑的抗性可穩(wěn)定遺傳，但適合度下降，如生長(zhǎng)速率減慢、產(chǎn)孢量下降和致病性降低。何磊鳴[20]檢測(cè)了2017—2019年灰霉病菌對(duì)啶菌噁唑的敏感性，認(rèn)為啶菌噁唑?qū)ι綎|地區(qū)的灰霉病菌仍有很強(qiáng)的抑制作用，但也檢測(cè)到一些敏感性下降的菌株；這些不敏感菌株的產(chǎn)孢量和菌核量增多，但生長(zhǎng)速率和致病性沒(méi)有發(fā)生變化。可見(jiàn)，不同病原菌對(duì)啶菌噁唑產(chǎn)生抗性后，適合度的變化并不一致。2019年，在山西省忻州市分離檢測(cè)到4株對(duì)啶菌噁唑存在一定抗性的菌株。目前，只有番茄早疫病菌對(duì)啶菌噁唑敏感性的報(bào)道[11]，還未見(jiàn)抗性菌株適合度的研究。本研究以2019年檢測(cè)出的抗性菌株為材料，通過(guò)探討抗性菌株的適合度變化(遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、孢子競(jìng)爭(zhēng)力、產(chǎn)毒量及致病性)評(píng)估其抗性風(fēng)險(xiǎn)，為啶菌噁唑的科學(xué)使用和防治番茄早疫病用藥策略的制訂提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：番茄早疫病菌敏感菌株W-11由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供；XW-1、XW-2、XW-3和XW-4菌株于2019年從山西省忻州市番茄設(shè)施大棚中患有番茄早疫病的葉片上分離得到，現(xiàn)保藏于忻州師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

供試藥劑：91.2%啶菌噁唑(pyrisoxazole)原藥(沈陽(yáng)化工研究院有限公司生產(chǎn))。

供試馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：將馬鈴薯200 g切塊、煮熟，過(guò)濾、去渣后留濾液，依次加入葡萄糖20 g和瓊脂粉20 g，煮沸，定容至1 L備用；供試馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PD)：按照上述PDA配制方法制備，但不加瓊脂粉；供試馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA)：將馬鈴薯20 g和胡蘿卜20 g切塊、煮熟，過(guò)濾后留濾液，隨后加入瓊脂粉20 g，煮沸，定容至1 L備用。

供試儀器：HD-29型凈化操作臺(tái)(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))。

1.2 抗性菌株對(duì)啶菌噁唑的敏感性及抗性水平測(cè)定

取啶菌噁唑10.964 9 mg溶于10 mL丙酮溶液中，配成10 000 mg/L的母液；然后用丙酮將母液分別稀釋成5 000、1 000、500和100 mg/L的啶菌噁唑溶液；將不同質(zhì)量濃度的啶菌噁唑溶液與PDA按照體積比1∶1 000混勻，并倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，最終制成質(zhì)量濃度分別為10.0、5.0、1.0、0.5和0.1 mg/L的含藥平板。將供試菌株在PDA上活化，25 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，在菌落邊緣近1/3處用無(wú)菌打孔器制備直徑為5 mm的菌餅；將菌餅接種在含藥平板中心，每皿1塊。以加入相同體積丙酮的PDA平板為對(duì)照。每個(gè)菌株、每藥劑質(zhì)量濃度重復(fù)3次。

25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算各質(zhì)量濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率：抑制率＝[(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。采用DPS軟件處理數(shù)據(jù)，求出毒力回歸方程和EC50值；番茄早疫病菌對(duì)啶菌噁唑的敏感基線(xiàn)為0.56 mg/L[11]，根據(jù)公式計(jì)算菌株的抗性倍數(shù)(A)：A＝抗性菌株EC50/敏感基線(xiàn)，當(dāng)A<5時(shí)為敏感類(lèi)型，5≤A<20時(shí)為低抗類(lèi)型，20≤A<100時(shí)為中抗類(lèi)型，A≥100時(shí)為高抗類(lèi)型[10]。

1.3 抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將抗性菌株在PDA上連續(xù)繼代培養(yǎng)20代。采用1.2節(jié)的方法，分別測(cè)定第1、5、10、15和20代抗性菌株對(duì)啶菌噁唑的敏感性，計(jì)算抗性倍數(shù)和敏感性變化倍數(shù)：敏感性變化倍數(shù)=第n代抗性倍數(shù)/原代抗性倍數(shù)。

1.4 抗性菌株的生長(zhǎng)速率測(cè)定

將敏感菌株與抗性菌株的5 mm菌餅接種于PDA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，于第1、2、3和4天時(shí)測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌株的生長(zhǎng)速率。每株菌重復(fù)3次。

1.5 抗性菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率測(cè)定

將敏感菌株與抗性菌株的5 mm菌餅接種于PCA平板上，置于34 W冷白熒光燈下40 cm處，22 ℃黑暗(16 h)/冷白熒光(8 h)條件下培養(yǎng)7 d，取出皿內(nèi)培養(yǎng)物置于三角瓶中，加入無(wú)菌水50 mL，充分振蕩洗下孢子，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后留濾液，采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定濾液中的孢子數(shù)(個(gè)/mL)。每株菌重復(fù)3次。

將濾液稀釋至1×105個(gè)/mL。取100 μL滴于凹玻片中央，25 ℃保濕培養(yǎng)8 h，顯微鏡下觀(guān)察不低于300個(gè)孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率：孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/觀(guān)察總數(shù)×100%。每株菌重復(fù)3次。

1.6 抗性菌株的孢子競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定

參照任璐等[21]的方法將敏感菌株與抗性菌株的孢子液按照體積比1∶1配置成不同的組合：C1為W-11+XW-1，C2為W-11+XW-2，C3為W-11+XW-3，C4為W-11+XW-4。用毛筆將孢子混合液涂抹于經(jīng)過(guò)表面消毒的番茄葉片，25 ℃保濕培養(yǎng)，待發(fā)病后用1 cm打孔器將病斑部位打下，并懸浮于5 mg/L啶菌噁唑中繼續(xù)培養(yǎng)，記錄病斑數(shù)量并觀(guān)察其是否擴(kuò)大，每個(gè)處理檢測(cè)病斑數(shù)50個(gè)。根據(jù)公式計(jì)算抗性菌株頻率：抗性菌株頻率=病斑擴(kuò)大數(shù)量/病斑總數(shù)×100%。

1.7 抗性菌株的致病性測(cè)定

采用SCHERPERS等[22]的方法。用含0.2%吐溫-80的無(wú)菌水將啶菌噁唑母液稀釋成5 mg/L的溶液，將番茄的健康葉片進(jìn)行表面消毒，浸入5 mg/L啶菌噁唑藥液中10 s，晾干，以浸入無(wú)菌水為對(duì)照；將番茄葉片制成直徑為3 cm的葉盤(pán)，將1.5節(jié)中制備的濾液孢子數(shù)稀釋至1×104個(gè)/mL，均勻噴灑在葉盤(pán)表面，放入有濕濾紙的空皿中，每皿2片葉盤(pán)，每菌株3皿。25 ℃培養(yǎng)5 d，用透明坐標(biāo)紙統(tǒng)計(jì)葉盤(pán)的發(fā)病面積以評(píng)價(jià)其致病性強(qiáng)弱。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.8 抗性菌株的產(chǎn)毒量測(cè)定

將敏感菌株與抗性菌株的5 mm菌餅分別接種于200 mL PD中，每株菌、每瓶培養(yǎng)液接種10塊菌餅，于25 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)20 d。過(guò)濾培養(yǎng)液并去除菌絲，3 000 r/min離心15 min取上清液，滅菌，即為粗毒素。分別用體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%、25.0%、50.0%和100.0%的粗毒素浸泡30粒番茄種子24 h，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后測(cè)定種子萌發(fā)數(shù)，以無(wú)菌水浸泡種子為對(duì)照，計(jì)算種子萌發(fā)抑制率：種子萌發(fā)抑制率=(1-毒素處理種子萌發(fā)數(shù)/對(duì)照種子萌發(fā)數(shù))×100%。采用DPS軟件，以種子萌發(fā)抑制率為y值，粗毒素體積分?jǐn)?shù)l g值為x值，求出萌發(fā)抑制中濃度，通過(guò)分析萌發(fā)抑制中濃度比較菌株的產(chǎn)毒量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均由DPS 6.0和Excel 2010分析，顯著性差異采用Duncan氏新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性菌株對(duì)啶菌噁唑的敏感性及抗性水平

由表1可知：啶菌噁唑?qū)-11菌株的EC50值為0.51 mg/L，抗性倍數(shù)為0.91，故將其分為敏感類(lèi)型。啶菌噁唑?qū)W-1、XW-2、XW-3和XW-4的EC50值分別為7.73、12.08、12.00和11.52 mg/L，抗性倍數(shù)分別為13.80、21.57、21.43和20.57，可見(jiàn)，XW-1菌株屬于低抗類(lèi)型，XW-2、XW-3和XW-4菌株為中抗類(lèi)型。

表1 抗性菌株對(duì)啶菌噁唑的敏感性Tab.1 Sensitivity of pyrisoxazole-resistant isolates

2.2 抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性

由表2可知：在無(wú)藥培養(yǎng)基上隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，抗性菌株的EC50變化不大，且各菌株的敏感性變化倍數(shù)均大于0.95。第0、10和20代低抗菌株XW-1的抗性倍數(shù)分別為13.80、14.27和13.66，在20代時(shí)菌株仍處于低抗水平，抗性倍數(shù)未發(fā)生較大變化；同樣，中抗菌株XW-2、XW-3和XW-4在第20代后抗性倍數(shù)仍處于中抗水平。可見(jiàn)，抗性菌株對(duì)啶菌噁唑的抗性可穩(wěn)定遺傳。

表2 抗性菌株對(duì)啶菌噁唑抗性的遺傳穩(wěn)定性Tab.2 Stability of resistance of pyrisoxazole-resistant isolates

2.3 抗性菌株的生長(zhǎng)速率

由圖1可知：不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率有所差異，敏感菌株W-11的生長(zhǎng)速率最快，抗性菌株XW-1、XW-2、XW-3和XW-4的生長(zhǎng)速率顯著慢于W-11 (P<0.05)。各菌株第4天的生長(zhǎng)速率與對(duì)應(yīng)EC50值的線(xiàn)性相關(guān)分析(圖2)可知：相關(guān)系數(shù)r=0.906 3，r0.054(0.874 3)

圖1 抗藥菌株與敏感菌株菌落生長(zhǎng)速率Fig.1 Growth rates of pyrisoxazole-resistant and sensitive isolates

圖2 菌絲生長(zhǎng)速率和菌株EC50的相關(guān)性Fig.2 Linear correlation between EC50 values and growth rates

2.4 抗性菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率

由表3可知：敏感菌株W-11的產(chǎn)孢量顯著低于抗性菌株的產(chǎn)孢量 (P<0.05)，但它們之間的孢子萌發(fā)率無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明抗性菌株的產(chǎn)孢量雖有所增多，但孢子萌發(fā)率未發(fā)生變化。

2.5 抗性菌株的孢子競(jìng)爭(zhēng)力

由圖3可知：在C1～C4組合中，敏感菌株侵染所致的病斑頻率均高于抗性菌株的病斑。在組合C1中抗性菌株的競(jìng)爭(zhēng)力最大，達(dá)到40.00%；在組合C3中抗性菌株的競(jìng)爭(zhēng)力最小，為26.00%。說(shuō)明抗性菌株孢子的競(jìng)爭(zhēng)力比敏感菌株弱。

圖3 抗、感菌株孢子的競(jìng)爭(zhēng)力Fig.3 Spore competitiveness between pyrisoxazole-resistant isolate and sensitive isolate

2.6 抗性菌株的致病性

由表3還可知：敏感菌株W-11的發(fā)病面積為4.60 mm2，顯著大于抗性菌株的發(fā)病面積 (P<0.05)；在經(jīng)過(guò)啶菌噁唑處理后，敏感菌株W-11的發(fā)病面積僅為0.85 mm2，顯著小于抗性菌株的發(fā)病面積(P<0.05)。可見(jiàn)，在無(wú)藥劑壓力下抗性菌株的致病性顯著降低，但當(dāng)環(huán)境中存在啶菌噁唑時(shí)則有利于抗性菌株的侵染。

2.7 抗性菌株的產(chǎn)毒量

由表3可知：敏感菌株W-11所產(chǎn)毒素的種子萌發(fā)抑制中濃度為4.89%，抗性菌株所產(chǎn)毒素的種子萌發(fā)抑制中濃度介于14.36%～23.22%，顯著高于敏感菌株(P<0.05)，表明抗性菌株的產(chǎn)毒量均有所下降。

表3 抗性菌株的產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病性及產(chǎn)毒量Tab.3 Sporulation,germination rate,pathogenicity,and toxin production of pyrisoxazole-resistant isolates

3 討論

在植物病害防治中，對(duì)殺菌劑進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有助于針對(duì)不同的抗性風(fēng)險(xiǎn)制訂殺菌劑施用策略，以延緩抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，延長(zhǎng)殺菌劑的使用壽命[22]。在抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，抗性菌株的適合度指標(biāo)是重要的參數(shù)，如遺傳穩(wěn)定性、致病性和競(jìng)爭(zhēng)力等[19]。當(dāng)對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性后，病原菌的適合度變化最終會(huì)通過(guò)群體在田間的反應(yīng)有所體現(xiàn)。因此，評(píng)估適合度對(duì)預(yù)測(cè)未來(lái)整個(gè)抗性群體的行為和控制病害具有決定性作用[23]。本研究從田間獲得的野生抗性菌株對(duì)啶菌噁唑處于低抗至中抗水平，且這種抗性可穩(wěn)定遺傳，但這些抗性菌株的抗性越強(qiáng)，生長(zhǎng)速率越慢，與CHEN等[16]的報(bào)道結(jié)果相符?？剐跃暝阪咦用劝l(fā)率不變的情況下，加大了產(chǎn)孢量，說(shuō)明抗性菌株產(chǎn)生的活性孢子量增多，這可能是其在自然環(huán)境中生存的適應(yīng)性進(jìn)化，或許也是抗性菌株在環(huán)境中較易被檢測(cè)的原因。然而，這些有活性的孢子競(jìng)爭(zhēng)力和產(chǎn)毒量均下降，致病性降低，但在啶菌噁唑壓力下其致病性強(qiáng)于敏感菌株，可推測(cè)當(dāng)番茄早疫病菌對(duì)啶菌噁唑產(chǎn)生抗性后，抗性雖可穩(wěn)定遺傳，但除產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率外，其他適合度指標(biāo)均下降，生存能力和寄生能力也下降，在與敏感群體的生存競(jìng)爭(zhēng)中可能會(huì)處于劣勢(shì)；但為了能在競(jìng)爭(zhēng)中存活，抗性菌株增大產(chǎn)孢量，繁殖能力增強(qiáng)，以期通過(guò)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)獲取更多的生存機(jī)會(huì)，且當(dāng)環(huán)境中存在啶菌噁唑時(shí)，抗性菌株可借助藥劑對(duì)敏感群體的壓制進(jìn)而壯大抗性菌群。后續(xù)還需加強(qiáng)田間抗性監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步深入探究番茄早疫病菌對(duì)啶菌噁唑的抗性機(jī)制，為延緩啶菌噁唑抗性的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

番茄早疫病菌在對(duì)啶菌噁唑產(chǎn)生抗性后，抗性可穩(wěn)定遺傳，雖然繁殖能力增強(qiáng)，但是孢子的競(jìng)爭(zhēng)力變?nèi)酰暧糜谥虏〉亩舅禺a(chǎn)量也下降，致病力變?nèi)?；?dāng)環(huán)境中存在啶菌噁唑壓力時(shí)，其致病力強(qiáng)于敏感菌株。