李 倩，趙 穎，喬蘇瑞，謝巖黎

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉菌（，AF）屬子囊菌門、叢梗孢科、曲霉屬，是一種常見(jiàn)的腐生型好氧真菌。AF易侵染多種糧食作物，如小麥、玉米、花生，不僅損害其品質(zhì)，而且影響經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每年因霉菌污染而造成的糧食損失高達(dá)2 100萬(wàn) t，占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的4.2%，是每年新增糧食產(chǎn)量的4 倍多。作為一種病原性真菌，AF極易通過(guò)呼吸道、口耳眼鼻、皮膚等部位進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，引起支氣管炎、肺泡壞死、外耳炎、角膜炎、鼻竇炎等多種疾病，危害人畜身體健康。此外，AF可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物——黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT），其中黃曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）毒性最強(qiáng)，約為氰化鉀的10 倍、砒霜的8 倍、二甲基亞硝胺的75 倍、三聚氰胺的416 倍，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WTO）列為I類致癌物。AFT對(duì)光、熱、酸較穩(wěn)定，280 ℃高溫下才可裂解，因此一般烹調(diào)加工溫度難以破壞。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）又名白蘞素、蛇葡萄素，屬于二氫黃酮類化合物，多存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中，其中在葡萄科藤茶中含量最高。以往研究表明，DMY具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂、保肝護(hù)肝等，因此廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等行業(yè)。例如，目前以DMY為功效添加成分已研制出速溶茶、顯齒蛇葡萄總黃酮含片、DMY解酒保肝膠囊等保健食品。除此之外，DMY可以有效抑制食源性細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、副傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌，DMY對(duì)其最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為0.63、1.25、0.31、0.63、0.31 mg/mL。在熊皓平等的研究中，DMY對(duì)AF、青霉、黑曲霉、毛霉、根霉等真菌也具有顯著抑制效果。

作為一種天然植物提取物，DMY成本低廉、來(lái)源廣泛，具有極大的開(kāi)發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)DMY對(duì)AF的抗真菌活性，在此基礎(chǔ)上通過(guò)測(cè)定細(xì)胞壁/膜完整性、細(xì)胞內(nèi)容物釋放量、呼吸速率、細(xì)胞外相對(duì)電導(dǎo)率和pH值探究DMY潛在的抗真菌機(jī)制，最后評(píng)估其在糧食中的抑菌效果，以期為天然抑菌劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

AF菌株（CGMCC 3.6304） 中國(guó)微生物菌種保藏中心（China General Microbial Culture Collection Center，CGMCC）；DMY（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；卡爾科弗盧爾熒光增白劑（calcofluor white，CW） 上海懋康生物科技有限公司；抗熒光猝滅劑上海生工生物工程股份有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 北京索萊寶科技有限公司；花生、玉米購(gòu)于鄭州永輝超市。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-E電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市光明醫(yī)療儀器廠；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS-40X50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；THZ-98B雙功能汽浴恒溫振蕩器上海誦誠(chéng)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BM-37XBC倒置生物顯微鏡上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；DFC 7000T熒光顯微鏡德國(guó)徠卡公司；UV-6100S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；DZS-706-C多參數(shù)分析儀上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DMY對(duì)AF抑制作用實(shí)驗(yàn)

AF于（28±2）℃下在固體沙氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar，SDA）（含40 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨和20 g/L瓊脂）上培養(yǎng)7 d，然后用打孔器在菌落中央打孔制得AF菌餅（直徑0.6 cm）備用。

孢子懸浮液制備：向AF的SDA表面傾注5 mL生理鹽水并用涂布器刮取孢子，吸取含有孢子的生理鹽水并用濾紙過(guò)濾，所得濾液即為孢子原液。充分吹打混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，加入液體沙氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose broth，SDB）（含40 g/L葡萄糖和10 g/L蛋白胨）稀釋孢子懸浮液使孢子濃度為5×10個(gè)/mL，備用。

用無(wú)水乙醇配制不同質(zhì)量濃度的DMY溶液，避光儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。

1.3.1.1 DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)抑制率的測(cè)定

DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)抑制率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改。在96 孔板加入20 μL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）和20 μL DMY溶液（終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照，后同）、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL）。將96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱（28±2）℃中孵育48 h，每24 h于倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)形態(tài)，顯微鏡拍照后計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率（視野中未萌發(fā)孢子數(shù)占總孢子數(shù)比值），DMY對(duì)AF孢子的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）指DMY完全抑制孢子萌發(fā)的最小質(zhì)量濃度。

1.3.1.2 DMY對(duì)AF菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

在培養(yǎng)皿（直徑6 cm）中加入10 mL含DMY（質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、16 mg/mL）的SDA。培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基中央打孔（直徑0.6 cm），然后嵌入AF菌餅，密封后于恒溫培養(yǎng)箱靜置72 h，每24 h測(cè)量菌落直徑。72 h后菌落直徑無(wú)變化且菌絲生長(zhǎng)抑制率為100%的最小質(zhì)量濃度即為DMY對(duì)AF菌絲的MIC。菌絲生長(zhǎng)抑制率按式（1）計(jì)算。

式中：和分別代表對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在SDA上的平均菌落直徑/cm。

1.3.2 孢子活力檢測(cè)和菌絲生物量分析

1.3.2.1 孢子活力檢測(cè)

采用平板記數(shù)法檢測(cè)孢子活力，結(jié)果以孢子存活率表征。參照1.3.1.1節(jié)方法，制備DMY終質(zhì)量濃度分別為0、4、8、16 mg/mL的孢子懸浮液。然后取100 μL孢子懸浮液稀釋10倍，取200 μL均勻涂布于9 cm培養(yǎng)皿（每個(gè)培養(yǎng)皿含30 mL SDA，每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)重復(fù)），置于恒溫培養(yǎng)箱48 h，根據(jù)菌落數(shù)按式（2）計(jì)算孢子存活率。

式中：為用于涂布的孢子數(shù)量；為培養(yǎng)48 h后記錄的菌落數(shù)。

1.3.2.2 菌絲生物量分析

將100 μL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）加入20 mL SDB中，于（28±2）℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后加入2 mL DMY溶液（終質(zhì)量濃度分別為0、2、4 mg/mL），繼續(xù)振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后用濾紙過(guò)濾培養(yǎng)液收集菌絲，用去離子水沖洗兩次以洗去培養(yǎng)液。0-24組代表培養(yǎng)24 h收集的菌絲，0-48、2-48、4-48組代表在48 h收集的DMY終質(zhì)量濃度分別為0、2、4 mg/mL的菌絲。將各組收集的菌絲在80 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥24 h后分別稱質(zhì)量，以表征菌絲生物量。

1.3.3 細(xì)胞壁完整性測(cè)定

將50 μL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）加入10 mL SDB中，于恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。加入1 mL DMY溶液（終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC和MIC）。再靜置培養(yǎng)24 h，取菌絲或培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的分析與測(cè)定。

細(xì)胞壁完整性分析參考文獻(xiàn)[17]的方法并稍作修改。取少量菌絲置于載玻片上，用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）KOH溶液和CW染色，并滴加抗熒光猝滅劑保護(hù)熒光，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照（放大20 倍）。

1.3.4 細(xì)胞膜完整性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行染色。取少量1.3.3節(jié)培養(yǎng)的菌絲置于載玻片上，滴加10 μL PI染料（1 μL/mL）染色，避光靜置20 min后，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗去未結(jié)合染料。滴加抗熒光猝滅劑并用熒光顯微鏡觀察拍照，采用Image J軟件計(jì)算PI熒光強(qiáng)度，以表征細(xì)胞膜完整性。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)容物釋放量實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[19]的方法并稍作修改。取2 mL 1.3.3節(jié)培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處光密度值（OD），測(cè)定時(shí)用新鮮的空白SDB校準(zhǔn)。

1.3.6 相對(duì)電導(dǎo)率和pH值的測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率和pH值的測(cè)量參考文獻(xiàn)[20]。將500 μL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）加入100 mL SDB中，（28±2）℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。加入10 mL DMY溶液（終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC），然后再振蕩培養(yǎng)24 h。收集0.5 g菌絲懸浮在 20 mL 純水中，使用多參數(shù)分析儀測(cè)定0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min時(shí)混合液的電導(dǎo)率和pH值。檢測(cè)完畢后立即煮沸5 min，冷卻至室溫后測(cè)定混合液的電導(dǎo)率。按式（3）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

式中：和分別代表樣品煮沸前后的電導(dǎo)率/（μS/cm）；和分別代表純水煮沸前后的電導(dǎo)率/（μS/cm）。

1.3.7 呼吸抑制率的測(cè)定

DMY對(duì)AF孢子呼吸代謝影響的測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]。向試管中加入7.2 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）和2 mL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）靜置5 min后，加入0.8 mL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）葡萄糖，混合均勻后靜置10 min，然后加入1 mL DMY溶液（終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC）混勻后靜置10 min，以等體積去離子水作為空白組。待溶液穩(wěn)定后用溶解氧測(cè)定儀測(cè)定溶解氧濃度，30 min后再次測(cè)定培養(yǎng)液的溶解氧濃度，計(jì)算30 min內(nèi)溶解氧濃度變化（＝-）。按式（4）計(jì)算呼吸抑制率。

式中：和分別代表空白組和DMY樣品組在30 min內(nèi)溶解氧濃度變化。

1.3.8 DMY對(duì)花生和玉米籽粒儲(chǔ)存過(guò)程中AF的體外抑菌效果分析

DMY對(duì)花生和玉米籽粒儲(chǔ)存過(guò)程中AF的抑制效果測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]的方法并稍加修改?；ㄉ陀衩鬃蚜Ｓ脽o(wú)菌水洗滌，然后用紫外線照射20 min。在超凈工作臺(tái)短暫干燥后，將10 ?；ㄉ鶆蚍湃胫睆? cm培養(yǎng)皿中。將400 μL孢子懸浮液（5×10個(gè)/mL）與40 μL DMY溶液混合（DMY終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC和MIC），隨后均勻涂抹于花生表面（40 μL/粒）。在恒溫培養(yǎng)箱（28±2）℃中放置72 h，每24 h統(tǒng)計(jì)1 次受污染花生的數(shù)量并拍照。以相同方式測(cè)定DMY對(duì)玉米籽粒的抗真菌作用。按式（5）計(jì)算花生/玉米籽粒污染率。

式中：和分別代表72 h后花生/玉米籽粒的污染個(gè)數(shù)和實(shí)驗(yàn)所用花生/玉米籽粒總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次，采用Origin 2017軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用Illustrator CC 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY對(duì)AF孢子和菌絲的MIC

如圖1A所示，DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)有顯著抑制作用。其中，0、0.5 mg/mL時(shí)，因DMY質(zhì)量濃度過(guò)低，暫無(wú)抑制作用；當(dāng)DMY為1 mg/mL時(shí)，24 h和48 h時(shí)抑制率分別為24.41%和9.05%；2 mg/mL的DMY處理48 h后80.45%的孢子未萌發(fā)；當(dāng)DMY質(zhì)量濃度不低于4 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到100%，即DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)的MIC為4 mg/mL。如圖1B所示，DMY對(duì)AF菌絲生長(zhǎng)同樣有顯著抑制作用。當(dāng)DMY質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，24、48、72 h時(shí)菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為95.00%、29.88%和16.98%；當(dāng)DMY質(zhì)量濃度不低于4 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到100%，即DMY對(duì)AF菌絲生長(zhǎng)的MIC為4 mg/mL，高于香芹酮（MIC＝1.5 mg/mL）、槲皮素（MIC＝1.0 mg/mL）等，但低于羅勒烯（MIC＝8.0 mg/mL），這種差異可能與AF孢子及不同菌株濃度有關(guān)。相同菌株接種濃度相同時(shí)，鄰香蘭素、2-羥基-4-甲氧基苯甲醛（2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde，HMB）、丹皮酚、辛醛、壬醛、癸醛抑制AF菌絲生長(zhǎng)的MIC分別為0.1、0.07、0.625、1.65、1.65、4.15 mg/mL。雖然DMY的MIC接近或高于上述天然化合物，但其作為抑菌劑仍然潛力巨大，這是由于：1）醛類化合物易揮發(fā)，在實(shí)際使用過(guò)程中不可避免存在損失，而DMY穩(wěn)定性較高；2）DMY在37.5 mg/mL和0.01 mg/mL質(zhì)量濃度下能夠分別發(fā)揮保護(hù)肝臟和抗腫瘤活性，說(shuō)明DMY還具有多重功效。這些結(jié)果為后續(xù)抑菌機(jī)理的探究奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖1 DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)（A）和菌絲生長(zhǎng)（B）抑制率Fig. 1 Inhibition rate of DMY on spore germination (A) and mycelial growth (B) of A. flavus

2.2 DMY處理后AF孢子存活率和菌絲生物量

為了檢測(cè)DMY在MIC質(zhì)量濃度及以上處理后的孢子活力，本研究測(cè)定了孢子存活率和菌絲生物量。如圖2A所示，對(duì)照組孢子存活率接近100%，而4、8、16 mg/mL的DMY處理組中孢子活力下降，孢子存活率分別為80%、65%和65%，表明DMY處理從一定程度上削弱了孢子的活力，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。此外，進(jìn)一步對(duì)菌絲的生物量進(jìn)行量化分析，如圖2B所示，對(duì)照組振蕩培養(yǎng)24 h的菌絲生物量為4.95 mg，對(duì)照組振蕩培養(yǎng)48 h菌絲生物量達(dá)57.65 mg。與對(duì)照組振蕩培養(yǎng)48 h相比，經(jīng)2 mg/mL的DMY處理后，菌絲生物量顯著下降，下降比例為55.51%，4 mg/mL的DMY對(duì)菌絲生物量的降低效果最為顯著，下降比例為88.93%。同時(shí)，0-24組和4-48組的菌絲生物量無(wú)顯著差異（＞0.05），由此可知，4 mg/mL的DMY幾乎能夠完全抑制菌絲的生長(zhǎng)。

圖2 DMY處理后AF孢子存活率（A）和菌絲生物量（B）Fig. 2 Spore survival rate (A) and mycelial biomass (B) of A. flavus treated with DMY

2.3 細(xì)胞壁完整性觀察結(jié)果

多糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，為細(xì)胞壁提供強(qiáng)度和硬度，如幾丁質(zhì)和-1,3-葡聚糖。細(xì)胞壁在向心力作用下向菌絲中心局部延伸形成隔膜，把菌絲內(nèi)部分隔為不同的小室，且相鄰的小室之間有細(xì)胞質(zhì)的互通。已知熒光白染料可與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，而幾丁質(zhì)是細(xì)胞壁（隔膜）的主要成分，因此，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞壁完整性有關(guān)。由圖3可知，對(duì)照組菌絲隔膜完整且清晰透亮，表明幾丁質(zhì)含量較高。與對(duì)照組相比，1/2 MIC和MIC組隔膜數(shù)量依次減少，熒光強(qiáng)度依次減弱，表明DMY處理后，AF菌絲中幾丁質(zhì)含量減少，即細(xì)胞壁完整性被破壞。相似地，植物源天然化合物中的鄰香蘭素、HMB、丹皮酚等均能不同程度的溶解隔膜，在具有相似隔膜的酸腐菌中也發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠溶解隔膜，植物精油如紫蘇精油能夠從基因水平調(diào)控葡聚糖合成酶、幾丁質(zhì)酶等的表達(dá)。以上研究表明，細(xì)胞壁可能是植物源天然化合物抑菌的一個(gè)靶標(biāo)，然而，哪些天然化合物能夠被成功開(kāi)發(fā)為靶向抑菌劑仍有待進(jìn)一步研究。

圖3 DMY處理后AF菌絲CW熒光染色圖Fig. 3 CW fluorescence staining images of A. flavus treated with DMY

2.4 細(xì)胞膜完整性與細(xì)胞內(nèi)容物釋放量變化

對(duì)PI染色后的菌絲熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化，結(jié)果如圖4A所示。隨著DMY質(zhì)量濃度的增加，相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著增加，1/2 MIC和MIC組分別是對(duì)照組的36.49 倍和257.69 倍。結(jié)果表明，DMY破壞了AF真菌細(xì)胞膜完整性，且這種破壞作用與DMY質(zhì)量濃度成正比關(guān)系。已有許多研究報(bào)道醛類化合物具有疏水性，能夠破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性升高、完整性破壞。一些黃酮類化合物對(duì)真菌細(xì)胞膜的破壞作用與之相似，如喬松素和白楊素對(duì)意大利青霉以及黃芩素對(duì)煙曲霉的破壞作用。

細(xì)胞膜完整性的破壞可直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲出，因此，通過(guò)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD）分析細(xì)胞內(nèi)容物的釋放情況，結(jié)果如圖4B所示。當(dāng)DMY質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC時(shí)，OD依次增加（分別為0.14、0.58和0.97）。與對(duì)照組相比，1/2 MIC組和MIC組光密度值分別增加了3.14 倍和5.93 倍。細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的顯著增加再次印證了細(xì)胞膜通透性的提高。

圖4 DMY對(duì)AF細(xì)胞膜完整性（A）和細(xì)胞內(nèi)容物釋放量（B）的影響Fig. 4 Effects of DMY on the integrity of cell membrane (A) and the release of cell contents (B) of A. flavus

2.5 AF的相對(duì)電導(dǎo)率和pH值改變情況

由于滲出的細(xì)胞內(nèi)容物具有導(dǎo)電性，因此，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞外相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)研究DMY對(duì)細(xì)胞膜破壞的程度。如圖5A所示，對(duì)照組和DMY處理組均呈現(xiàn)了相對(duì)電導(dǎo)率升高的趨勢(shì)。對(duì)照組的升高可能是細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓導(dǎo)致的，1/2 MIC組的升高趨勢(shì)和對(duì)照組接近，在180 min時(shí)約為43%，MIC組的升高最為顯著，180 min時(shí)約為69.63%。這些結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)電物質(zhì)穿過(guò)完整性遭到破壞的細(xì)胞膜，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，滲出的電解質(zhì)逐漸增多。上述PI染色、OD及相對(duì)電導(dǎo)率的檢測(cè)結(jié)果均間接表明了DMY處理后細(xì)胞膜受到了損傷，且該損傷呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

為了研究這些電解質(zhì)的酸堿度，測(cè)定了不同質(zhì)量濃度DMY處理后AF細(xì)胞外的pH值。如圖5B所示，與對(duì)照組相比，DMY處理組細(xì)胞外pH值均升高，但隨著時(shí)間變化，各組pH值均呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，這可能與酸性物質(zhì)的滲出有關(guān)。在180 min檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，DMY處理組的pH值均明顯高于對(duì)照組，推測(cè)處理組中有更多堿性物質(zhì)滲出。pH值的變化趨勢(shì)在不同天然產(chǎn)物處理的不同菌株中表現(xiàn)不同，如檸檬醛、辛醛和-松油醇3種揮發(fā)性化合物降低了柑桔地霉的pH值，HMB和丹皮酚均提高了AF菌絲胞外pH值。因此，pH值的變化趨勢(shì)可能更多地與菌株類型有關(guān)。細(xì)胞膜位于真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的中間，不僅是細(xì)胞的一層屏障，更能夠參與調(diào)控、介導(dǎo)多種細(xì)胞功能，因此，細(xì)胞膜何種組分（脂質(zhì)、蛋白等）、何種結(jié)構(gòu)受到DMY的破壞仍有待深入研究。

圖5 DMY處理下AF細(xì)胞外相對(duì)電導(dǎo)率和pH值的變化Fig. 5 Changes in extracellular relative conductivity and pH of A. flavus treated with DMY

2.6 DMY對(duì)AF呼吸代謝的影響

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外溶液中的溶解氧，能夠了解AF消耗氧氣的情況，進(jìn)而通過(guò)計(jì)算呼吸抑制率分析DMY對(duì)AF呼吸的抑制作用。如圖6所示，與對(duì)照組相比，DMY對(duì)AF的呼吸抑制率呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，1/2 MIC和MIC組的呼吸抑制率分別為16.99%和25.82%。已有研究報(bào)道部分植物源天然化合物對(duì)真菌的呼吸代謝有抑制作用，如檸檬醛在MIC時(shí)抑制率達(dá)到21.20%，HMB在MIC時(shí)的抑制率達(dá)到33.33%，癸醛在MIC時(shí)抑制率達(dá)到58.94%。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖尚無(wú)法全面揭示呼吸抑制原理，但由先前研究推測(cè)，該抑制作用可能與三羧酸循環(huán)途徑或線粒體功能的破壞有關(guān)。

圖6 DMY對(duì)AF的呼吸抑制率Fig. 6 Inhibition rate of DMY on A. flavus respiration

2.7 DMY對(duì)花生和玉米籽粒體外抑菌作用

花生和玉米易受AF侵染，因此，在上述人工培養(yǎng)液抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步評(píng)估了DMY對(duì)于防控AF污染的效果。AF的生長(zhǎng)情況如圖7所示，培養(yǎng)24 h時(shí)，除了兩個(gè)MIC組，剩余花生和玉米籽粒上均觀察到孢子的萌發(fā)。培養(yǎng)48 h時(shí)，對(duì)照組花生和玉米籽粒上均可觀察到AF菌絲。培養(yǎng)72 h時(shí)，即便花生和玉米籽粒表面涂布有1/2 MIC的DMY，AF的生長(zhǎng)情況也和48 h的對(duì)照組相似，而涂布MIC的DMY后花生和玉米籽粒表面則均無(wú)孢子萌發(fā)。對(duì)圖7污染情況的量化結(jié)果如圖8所示，培養(yǎng)72 h時(shí)，花生和玉米籽粒AF抑制率達(dá)到100%的均為DMY的MIC處理組。與培養(yǎng)液抑菌結(jié)果相同，4 mg/mL的DMY能夠完全抑制AF侵染花生和玉米籽粒，因此，DMY具有開(kāi)發(fā)為新型抑菌劑的潛力。

圖7 DMY對(duì)花生（A）和玉米（B）籽粒的體外抑菌作用Fig. 7 In vitro antifungal effect of DMY on peanut (A) and corn (B) kernels

圖8 DMY處理下花生（A）和玉米（B）籽粒的污染率Fig. 8 Contamination rates of peanut (A) and corn (B) kernels treated with DMY

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)旨在研究DMY對(duì)AF的抗真菌效果及其作用機(jī)理，首先進(jìn)行AF孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的最小抑菌實(shí)驗(yàn)，然后通過(guò)CW和PI染色、細(xì)胞內(nèi)容物釋放以及細(xì)胞外pH值和相對(duì)電導(dǎo)率變化檢測(cè)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性，并進(jìn)行呼吸速率檢測(cè)及花生和玉米籽粒體外抑菌實(shí)驗(yàn)。研究獲得的初步結(jié)論如下：DMY對(duì)AF孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的MIC均為4 mg/mL，其通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮抑菌作用。DMY處理后線粒體是否遭到破壞仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。此外，DMY能夠有效抑制AF侵染花生和玉米籽粒，未來(lái)有望將其開(kāi)發(fā)為新型抑菌劑應(yīng)用于糧食及農(nóng)產(chǎn)品的儲(chǔ)藏。