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促成骨細(xì)胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選及活性分析

2022-07-29 02:40陳永凱郭玉杰張鴻儒張春暉
食品科學(xué) 2022年13期
關(guān)鍵詞:配體氫鍵成骨細(xì)胞

陳永凱,郭玉杰,2,張鴻儒,劉 泓,張春暉,*,姜 珊

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.新疆泰昆集團(tuán)有限責(zé)任公司,新疆 昌吉 831100;3.內(nèi)蒙古阿榮旗牧原康肽實(shí)業(yè)有限公司,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162750)

酶解法制備的骨膠原蛋白肽為混合肽,通常具有抗高血壓、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化和促進(jìn)傷口愈合等多種潛在的生理功能。影響肽生物活性的主要因素包括一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸的排列和組成)和肽鏈長(zhǎng)度等,例如牦牛骨膠原蛋白肽GPAGPPGPIGPV(GP-12)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,而GPAGPAGPR(GP-9)和GEKGETGLR(GE-9)對(duì)成骨細(xì)胞增殖起抑制作用。在骨膠原蛋白分子的三股螺旋(2 條α肽、1 條α鏈)結(jié)構(gòu)中,甘氨酸(Gly)是其特征氨基酸,與其他兩個(gè)氨基酸殘基(多為Pro和Hyp)共同構(gòu)成(Gly-X-Y)的特征序列結(jié)構(gòu),可能是解析其生物活性的潛在“策略區(qū)”。因此,有必要進(jìn)一步挖掘骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)信息與促成骨細(xì)胞增殖活性之間的關(guān)系,為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的定向制備提供參考。

活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究方法涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)和虛擬篩選三大領(lǐng)域。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要依靠建立動(dòng)物模型,但成本高、周期長(zhǎng),常用作活性研究的最后一步。Yamada等前期研究發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白肽MKP具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性,進(jìn)一步通過(guò)建立自發(fā)性高血壓大鼠模型發(fā)現(xiàn),三肽MKP能經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血漿,顯著降低高血壓大鼠的收縮壓。體外實(shí)驗(yàn)主要包括化學(xué)實(shí)驗(yàn)、酶相關(guān)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等,可直接驗(yàn)證肽的生物活性,但不適合初期大規(guī)模篩選,多與其他分離純化技術(shù)聯(lián)用。顏阿娜等采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除實(shí)驗(yàn),結(jié)合高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法成功鑒定出了黑鯊魚(yú)皮抗氧化肽PGGTM。計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)可有效彌補(bǔ)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)的不足,提高篩選效率,常見(jiàn)的虛擬篩選方法包括定量-構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)建模、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和分子對(duì)接等。在篩選促成骨細(xì)胞增殖活性肽的相關(guān)研究中,可將肽與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)進(jìn)行半柔性對(duì)接,以對(duì)接能(CDOCKER energy,CE)評(píng)價(jià)其潛在的促增殖活性,此法在促成骨細(xì)胞增殖牛骨膠原蛋白肽和乳鐵蛋白肽的篩選中均取得了良好的效果。

牦牛是我國(guó)珍貴的畜牧資源,牦牛屠宰產(chǎn)生的骨副產(chǎn)物質(zhì)量約占胴體質(zhì)量的20%~30%,但綜合利用卻嚴(yán)重不足,現(xiàn)已證實(shí)牦牛骨膠原蛋白肽具有良好的成骨活性,能顯著改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型癥狀。本研究采用酶法制備牦牛骨膠原蛋白肽,通過(guò)CDOCKER分子對(duì)接技術(shù)靶向篩選作用于EGFR的促成骨細(xì)胞增殖活性肽段,基于體外細(xì)胞增殖培養(yǎng)驗(yàn)證其活性并闡釋與EGFR的結(jié)合機(jī)制,以期為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的靶向篩選和工業(yè)化制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛腿骨由西藏農(nóng)牧學(xué)院提供;牦牛骨膠原蛋白肽由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成,經(jīng)鑒定純度均大于98%;小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

乙腈(質(zhì)譜級(jí)) 美國(guó)Fisher Chemical公司;甲酸(質(zhì)譜級(jí))、三氟乙酸(色譜級(jí)) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;CCK-8溶液 北京索萊寶科技有限公司;復(fù)合蛋白酶 丹麥Novozymes公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中試生產(chǎn)裝備(包括破骨機(jī)、工業(yè)純水機(jī)、蒸煮罐、靜置罐管式冷卻器、管式分離機(jī)、碟式分離機(jī)、脫色罐、單效蒸發(fā)器、噴霧干燥機(jī)) 上海本優(yōu)機(jī)械有限公司;1260-II型HPLC儀 美國(guó)Agilent公司;Ultimate 3000型毛細(xì)管HPLC儀、電噴霧-組合型離子阱質(zhì)譜儀、Multiskan FC型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;Infinite M200型恒溫培養(yǎng)箱 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨膠原蛋白肽制備流程

牦牛骨破碎→沖洗血污→熱壓提取(135 ℃、3 h)→靜置分層(1.5 h)→酶解脫色(1.5 AU/g復(fù)合蛋白酶,56 ℃、4.5 h)→噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度190 ℃、出風(fēng)溫度80 ℃)

1.3.2 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布測(cè)定

參考Ye Mengliang等的方法并稍作修改,采用HPLC法測(cè)定牦牛骨混合肽分子質(zhì)量分布,配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品甘氨酰肌氨酸(146 Da)、甘氨酰甘氨酰酪氨酰-精氨酸(451 Da)、桿菌肽(1 422 Da)、抑肽酶(6 511 Da)、細(xì)胞色素c(12 327 Da)以及牦牛骨混合肽溶液,經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾,待用。色譜條件:TSK gel G2000 SWXL柱(7.8 mm×300 mm),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,進(jìn)樣3 次,流速1.0 mL/min,流動(dòng)相為含45%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈和0.1%三氟乙酸的超純水溶液,采用等梯度洗脫,洗脫時(shí)間為20 min,于214 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(lg)為縱坐標(biāo),保留時(shí)間()為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),采用手動(dòng)積分的方式測(cè)定不同分子質(zhì)量活性肽的占比。

1.3.3 牦牛骨膠原蛋白肽序列測(cè)定

采用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nano liquid chromatogram-tandem mass spectrometry,nano LC-MS/MS)測(cè)定牦牛骨膠原蛋白肽序列。

1.3.3.1 液相分離條件

預(yù)柱:Acclaim PepMap RPLC C柱(5 mm×300 μm,5 μm);分析柱:Acclaim PepMap RPLC C柱(150 mm×150 μm,5 μm);流動(dòng)相A:0.1%甲酸+2%乙腈;流動(dòng)相B:0.1%甲酸+80%乙腈;流速:600 nL/min;梯度洗脫條件:0~5 min,6%~9% B;5~20 min,9%~14% B;20~50 min,14%~30% B;50~58 min,30%~40% B;58~60 min,40%~95% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜分析條件

采用正離子掃描模式;設(shè)定毛細(xì)管溫度320 ℃、毛細(xì)管?chē)娚潆妷? 300 V。一級(jí)質(zhì)譜參數(shù):分辨率:70 000;AGCtarget:3×10;MaximumIT:40 ms;掃描范圍:350~1 800/。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù):分辨率:75 000;AGCtarget:1×10;MaximumIT:60 ms;Top N:20;NCE/stepped NCE:27。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

使用Maxquant 1.6.2.10平臺(tái)分別檢索目標(biāo)多肽。

1.3.4 EGFR和多肽前處理

從Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)下載EGFR-表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)(PDB編號(hào):1IVO)復(fù)合物結(jié)構(gòu),采用Discovery Studio 2019軟件刪去原配體EGF和水分子,添加氫原子,補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基并模擬缺失的loop區(qū)域;分別繪制牦牛骨肽的一級(jí)序列,添加CHARMm力場(chǎng),采用Smart Minimizer算法對(duì)其進(jìn)行能量最小化處理,最大步數(shù)設(shè)定為2 000 步,RMS梯度值設(shè)為0.01。

1.3.5 活性口袋確定

以EGF和EGFR的結(jié)合位點(diǎn)為對(duì)接位點(diǎn),設(shè)定活性口袋半徑為22,將原配體結(jié)合區(qū)域完全包裹。

1.3.6 分子對(duì)接

定義經(jīng)過(guò)前處理的多肽為配體,EGFR為受體,使用Discovery Studio 2019軟件的CDOCKER半柔性對(duì)接方式進(jìn)行分子對(duì)接,僅保留一個(gè)CE最低的構(gòu)象。以具有促成骨細(xì)胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GDRGETGPAGPAGPIGPV(GD-18)和GPSGPAGKDGRIGQPG(GP-16)為陽(yáng)性對(duì)照,選取CE較陽(yáng)性肽CE差值大于20 kcal/mol的多肽用于后續(xù)研究。

1.3.7 多肽合成

參考Xu Zhe等的方法,采用固相合成技術(shù)合成牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22,HPLC-MS檢驗(yàn)純度,均大于98%。

1.3.8 多肽促成骨細(xì)胞增殖活性驗(yàn)證

參考 Zhu Lingyu等的方法并稍作修改,將小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞以2×10個(gè)/mL、每孔100 μL接種于96 孔板中,恒溫培養(yǎng)24 h后移去原培養(yǎng)基,隨后配制系列質(zhì)量濃度梯度的多肽溶液,以每孔200 μL加入96 孔板中,在溫度為37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h,空白組加入等體積培養(yǎng)基,采用CCK-8法測(cè)定增殖率,每組實(shí)驗(yàn)做4 次平行。按下式計(jì)算前成骨細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

式中:為樣品溶液的吸光度;為空白組溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Duncan方差分析,設(shè)定顯著性水平<0.05或<0.01,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示;繪圖軟件為Origin 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布

標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lg與保留時(shí)間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(=0.979 4),說(shuō)明測(cè)定結(jié)果具有較高的可信性。根據(jù)GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》的定義,膠原蛋白肽是指以富含膠原蛋白的新鮮動(dòng)物組織(包括皮、骨、筋、腱、鱗等)為原料,經(jīng)過(guò)提取、水解、精制生產(chǎn)的,分子質(zhì)量低于10 000 Da(質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于90%)的產(chǎn)品。如圖1所示,分子質(zhì)量小于3 000 Da的肽段占91.8%,其中小于1 000 Da的占69.2%,說(shuō)明該批肽粉符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

研究發(fā)現(xiàn),低分子質(zhì)量的牛骨膠原蛋白肽(<3 000 Da)、牦牛骨膠原蛋白肽(<3 000 Da)以及豬骨膠原蛋白肽(<1 000 Da)均能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖,發(fā)揮成骨活性。因此,本實(shí)驗(yàn)制備的牦牛骨膠原蛋白肽可能具有開(kāi)發(fā)成為抗骨質(zhì)疏松功能食品的潛在價(jià)值,故進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of yak bone collagen peptides

2.2 牦牛骨膠原蛋白肽序列分析

膠原蛋白呈現(xiàn)典型的三股螺旋結(jié)構(gòu),具有良好的生物相容性且易于加工利用。自然界中共存在28種膠原蛋白,其中I型膠原蛋白含量最高,廣泛分布于動(dòng)物的皮膚、骨骼和肌腱等部位。如表1所示,本實(shí)驗(yàn)中從牦牛骨膠原蛋白肽中共鑒定得到78 條肽段,其中I型膠原蛋白肽占比為82.0%,來(lái)源于α鏈和α鏈的肽分別占I型膠原蛋白肽總量的45.3%和54.7%,并且其序列均與膠原蛋白的(Gly-X-Y)特征序列相吻合,表明鑒定結(jié)果具有較高的可靠性。

表1 牦牛骨膠原蛋白肽序列及分子對(duì)接結(jié)果Table 1 Yak bone peptide sequences and their -CDOCKER energy(-CE) values

續(xù)表1

值得注意的是,分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果表明混合肽中有大約45.1%的肽分子質(zhì)量小于500 Da,根據(jù)里賓斯基五規(guī)則,分子質(zhì)量小于500 Da的化合物往往具有較高的生物利用度和較好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì),更易開(kāi)發(fā)成為口服藥物,但本實(shí)驗(yàn)鑒定的分子質(zhì)量小于500 Da的肽只有一條——FSGL(422.224 Da)。導(dǎo)致質(zhì)譜對(duì)小肽鑒定能力差的原因可能是太小的片段在分離中不容易獲取,或者組分間性質(zhì)差異小,無(wú)法區(qū)分。

2.3 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EGFR是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族的成員,在無(wú)配體時(shí),EGFR胞外域的第II亞結(jié)構(gòu)域和第IV亞結(jié)構(gòu)域會(huì)形成分子內(nèi)“鉸鏈”,形成自抑制狀態(tài);當(dāng)配體與胞外域結(jié)合后,EGFR構(gòu)象改變并發(fā)生二聚化,啟動(dòng)下游信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖或分化。研究表明,以EGFR為受體,通過(guò)CDOCKER對(duì)接獲得的乳鐵蛋白肽ENLPEKADRDQYE、牛骨膠原蛋白肽HHGDQGAPGAVGPAGPRGPAGPSGPAGKDGR和GPAGANGDRGEAGPAGPAGPAGPR具有顯著的促成骨細(xì)胞增殖活性。在小分子配體與大分子受體對(duì)接研究中,可用-CE表示受體和配體親和力的大小,-CE越大,受體與配體結(jié)合越穩(wěn)定。如表1所示,將鑒定的多肽與EGFR對(duì)接后,-CE的變化范圍從21.493 kcal/mol到170.507 kcal/mol,其中陽(yáng)性肽GD-18和GP-16的-CE分別為134.759 kcal/mol和132.988 kcal/mol。-CE比陽(yáng)性肽高20 kcal/mol以上的多肽共有5 條,分別為GP-18(162.390 kcal/mol)、TP-14(167.276 kcal/mol)、GK-21(170.507 kcal/mol)、GK-22(162.093 kcal/mol)和GP-17(156.133 kcal/mol),除TP-14來(lái)源于-乳球蛋白以外,其余均來(lái)自于I型膠原蛋白的α鏈。

2.4 促成骨細(xì)胞增殖活性分析

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)增殖率,CCK-8法較其他常見(jiàn)的檢測(cè)方法具有結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。如圖2所示,將細(xì)胞在多肽質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/L和3.0 mg/mL條件下分別培養(yǎng)48 h,發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度不低于1.0 mg/mL時(shí),所有多肽均無(wú)顯著的促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖活性,GP-17、GP-18和TP-14甚至能抑制細(xì)胞增殖;當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí),GK-22能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖(相對(duì)增殖率為106%),并且表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明GK-22序列可能是促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的特征性序列,具有潛在的研究?jī)r(jià)值。值得注意的是,GK-21的序列僅與GK-22相差一個(gè)末端Gly殘基,卻無(wú)顯著的促增殖活性,因此末端Gly殘基對(duì)GK-22的促成骨細(xì)胞增殖具有重要意義。

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果Fig. 2 Determination of MC3T3-E1 cell proliferation

2.5 不同多肽與EGFR的結(jié)合機(jī)制

配體與EGFR親和力的差異會(huì)導(dǎo)致EGFR產(chǎn)生不同的二聚化構(gòu)象,繼而引發(fā)細(xì)胞增殖或分化。上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin,EREG)等弱親和力配體會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化而抑制增殖;EGF等強(qiáng)親和力配體作用效果相反,某些拮抗劑可以與EGFR胞外域結(jié)合,進(jìn)而掩蓋配體的結(jié)合位點(diǎn),致使EGFR內(nèi)部酪氨酸激酶激活過(guò)程受阻,細(xì)胞增殖受到抑制。如圖3和表2所示,GK-22與EGFR的非鍵相互作用主要為氫鍵和疏水相互作用,可與EGFR的Lys13、Leu14和Thr15形成5個(gè)氫鍵(包括常規(guī)氫鍵和碳?xì)滏I,與Lys13和Thr15各形成2個(gè)氫鍵),與Leu17和His409分別形成烷基相互作用和π-烷基相互作用。同時(shí),陽(yáng)性肽GP-16也與EGFR的Lys13和Thr15形成氫鍵;GD-18與Thr15形成氫鍵,與Leu17和His409形成烷基相互作用,提示GK-22可能與兩者存在相似的促成骨細(xì)胞增殖機(jī)制。而分子對(duì)接結(jié)果表明GK-21與EGFR的親和力高于GK-22,并且可與Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Tyr45和Gln384形成氫鍵,與Leu17、Leu325、His346和His409形成疏水相互作用,除Lys13外,涵蓋了GK-22與EGFR的所有結(jié)合位點(diǎn),卻未與GK-22一樣表現(xiàn)出促增殖活性,原因有待進(jìn)一步研究。GP-17、GP-18和TP-14與EGFR的非鍵相互作用除氫鍵和疏水相互作用外,還包括靜電相互作用。GP-17與EGFR形成8個(gè)氫鍵、1個(gè)電荷相互作用、1個(gè)烷基相互作用;其中EGFR的Asp355殘基與之形成4個(gè)氫鍵(含2個(gè)碳?xì)滏I、1個(gè)常規(guī)氫鍵、1個(gè)鹽橋)、1個(gè)電荷相互作用,是兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。GP-18與EGFR形成9個(gè)氫鍵、1個(gè)π-烷基相互作用、1個(gè)電荷相互作用;TP-14與EGFR形成10個(gè)氫鍵,1個(gè)π-陽(yáng)離子相互作用、1個(gè)烷基相互作用。因此,GK-22可能是EGFR的強(qiáng)親和力配體,而對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用的GP-17、GP-18和TP-14可能是EGFR的弱親和力配體,或者其作為EGFR的拮抗劑,使正常配體的結(jié)合過(guò)程受阻。綜上,不同多肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同效應(yīng)的原因可能是與EGFR的結(jié)合機(jī)制存在差異。

圖3 不同多肽與EGFR的非鍵相互作用Fig. 3 Non-bond interactions between different polypeptides and EGFR

表2 多肽與EGFR的結(jié)合位點(diǎn)Table 2 Interaction sites between polypeptides and EGFR

續(xù)表2

3 結(jié) 論

骨膠原蛋白經(jīng)復(fù)合酶酶解可獲得低分子質(zhì)量(<3 000 Da)的混合肽,但發(fā)揮促成骨細(xì)胞增殖活性的肽序列尚不明確。本研究采用nano LC-MS/MS技術(shù)測(cè)定混合肽序列,以牦牛骨膠原蛋白肽GD-18和GP-16為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)CDOCKER半柔性對(duì)接技術(shù)篩選獲得具有潛在促成骨細(xì)胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22,體外細(xì)胞增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,GK-22可通過(guò)與EGFR結(jié)合,發(fā)揮促成骨細(xì)胞增殖活性。綜上,基于以EGFR為受體的CDOCKER半柔性對(duì)接技術(shù),可實(shí)現(xiàn)促成骨細(xì)胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選。

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