鄭麗鋆，葉燕燕，吳美婷，倪 林，3*

（1.福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001；2.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；3.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

香樟（Cinnamomum camphoravar.Linaloolifera）為樟科樟屬植物［1］，有較高的藥用價值，具有祛風(fēng)濕、行氣血、利關(guān)節(jié)的功效［2-4］。香樟主要分布在我國福建、臺灣、江西、廣東等地區(qū)［5］。近年來，福建多數(shù)地區(qū)廣泛種植香樟，植物資源豐富，據(jù)作者統(tǒng)計，僅泉州安溪、南安、德化等地就已有萬畝香樟林［6］。香樟葉生長量大，全年可采，揮發(fā)油含量高，是提取香樟精油的優(yōu)質(zhì)原料［7-8］。而在實際的生產(chǎn)過程中，香樟葉僅用于精油生產(chǎn)，隨之作為燃料焚燒，而精油含量≤5%，植物利用率低，資源浪費(fèi)嚴(yán)重［9］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香樟除揮發(fā)油類成分外，還富含黃酮、酚酸類物質(zhì)，且該類成分顯示較好的抗氧化活性［10］。為進(jìn)一步深度開發(fā)香樟植物資源，提高香樟葉利用率和價值，本研究建立響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型以優(yōu)化香樟葉總黃酮加熱回流的提取工藝。試驗中選取提取時間、料液比以及乙醇濃度作為影響因素，并對最佳提取工藝條件下的總黃酮提取物進(jìn)行抗氧化活性研究，旨在為香樟葉總黃酮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年7月采自福建泉州市安溪半林國有林場的3 年生香樟葉，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全研究員鑒定為樟科樟屬香樟（Cinnamomum camphoravar.linaloolifera），品系為“牡丹1 號”，自然晾干，粉碎后備用。

1.2 試劑與儀器

DPPH 試劑購自福州Phygene 生物公司；維生素C（純度≥98%）、水楊酸（純度≥99.5%）、ABTS（純度≥98%）均購自合肥博美生物公司；H2O2溶液（分析純，體積分?jǐn)?shù)30%）購自江蘇凱基生物公司；七水合硫酸亞鐵、無水乙醇等試劑均購自國藥集團(tuán)公司。

PR224ZH/E 型電子分析天平：OHAUS 公司（美國）；TU-1810 紫外分光光度計：普析通用儀器公司（北京）；RV3 V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA 公司（德國）；HHW600 電熱恒溫水浴鍋：歐萊博生物公司（濟(jì)南）；RC 2 Control 冷卻循環(huán)器：IKA公司（德國）。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制25 mL 濃度為0.8 mg·mL-1的蘆丁乙醇溶液，分別取一定體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL 容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL 和10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；加1（mol·L-1）氫氧化鈉溶液5 mL，用無水乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min，在510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液X和吸光度Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 提取工藝

1.4.1 提取工藝的基本方法

精密稱取1.00 0 g（m）香樟葉粉末于圓底燒瓶中，在不同的條件下進(jìn)行回流提取，總黃酮提取液經(jīng)過濾后定容至100 mL（V）。取1 mL 定容后的濾液于50 mL 容量瓶中，按照“1.3”的方法測定吸光度，按以下公式計算總黃酮提取收率。

其中，n為稀釋倍數(shù)，C為線性計算出的濃度。

1.4.2 單因素試驗

以總黃酮提取收率為評價指標(biāo)，研究3 個因素對香樟總黃酮提取收率的影響，每個因素設(shè)置5 個水平（表1），從而獲得各條件下最佳提取工藝條件。

表1 單因素試驗Tab.1 Single factor test

1.4.3 響應(yīng)面法確定最佳工藝條件

根據(jù)單因素試驗篩選出單因素的最佳工藝條件，應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件對提取時間（A）、料液比（B）和乙醇濃度（C）設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken 試驗（表2），以總黃酮提取收率（Y）為響應(yīng)值，確定香樟總黃酮提取的最佳工藝條件。

表2 響應(yīng)面試驗的因素與水平表Tab.2 Factors and levels of response surface experiment

1.5 體外抗氧化活性的測定

1.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參 照 文 獻(xiàn)［11-12］的 方 法 略 作 修 改，取5 mg 的DPPH 溶于無水乙醇并定容至100 mL，超聲5 min，得到DPPH 乙醇溶液，避光保存，并在5 h 內(nèi)用完。準(zhǔn)確稱取總黃酮樣品25 mg，溶于無水乙醇并定容至25 mL，得到1.0 mg·mL-1的母液，母液按照高濃度到低濃度的順序，準(zhǔn)確配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的總黃酮溶液。取DPPH 乙醇溶液1 mL，加入1 mL 不同濃度的總黃酮溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min 后在517 nm 下測得吸光度A1；對照組以1 mL 無水乙醇替代DPPH 溶液，測得混合液的吸光度A2；空白組以1 mL 無水乙醇替代不同濃度的總黃酮溶液，測得混合液的吸光度A0。以維生素C 為陽性對照，按照上述同樣方法進(jìn)行試驗。

DPPH自由基清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.5.2 ·OH的清除能力的測定

參照文獻(xiàn)［13-14］的方法略作修改，用最優(yōu)工藝條件提取的總黃酮提取物配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1的總黃酮乙醇溶液。吸取1.0 mL 不同濃度的總黃酮乙醇溶液，加入9 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液、9 mmol·L-1硫酸亞鐵水溶液和1 mmol·L-1的H2O2水溶液各0.5 mL，混勻，在37℃下反應(yīng)30 min，在510 nm 下測定吸光度A1。對照組以水楊酸乙醇溶液、硫酸亞鐵水溶液、蒸餾水各0.5 mL 與總黃酮乙醇溶液1.0 mL的混合液測定吸光度A2?？瞻捉M以水楊酸乙醇溶液、硫酸亞鐵水溶液、H2O2水溶液各0.5 mL與蒸餾水1.0 mL的混合液測定吸光度A0。以維生素C為陽性對照，按照上述同樣方法進(jìn)行試驗。

·OH清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.5.3 ABTS自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)［15-16］的方法略作修改，配制濃度為7 mmol·L-1的ABTS 溶液和2.45 mmol·L-1的K2S2O8溶液，各取5 mL 混合產(chǎn)生ABTS+自由基，室溫避光反應(yīng)16 h，使用前需用無水乙醇對該溶液進(jìn)行稀釋。用最優(yōu)工藝條件提取的總黃酮提取物配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的溶液，分別取0.5 mL，加入2.0 mL ABTS 稀釋液，搖勻?；旌弦涸?7℃下反應(yīng)6 min，在734 nm 下測定吸光度A1?？瞻捉M以無水乙醇代替總黃酮溶液，測得吸光度A0。以維生素C為陽性對照，按照上述同樣方法進(jìn)行試驗。

ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液X和吸光度Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6.348X-0.032 20（R2=0.999 6）。如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同提取時間對香樟葉總黃酮提取工藝的影響

由圖2可知，隨著提取時間的增加，香樟葉提取的總黃酮提取收率增加，在60 min 時達(dá)到最大值為12.68%；而當(dāng)提取時間大于60 min 時，總黃酮提取收率呈下降的趨勢。這可能是因為提取時間越長，香樟葉中的總黃酮提取得越充分，但是時間過長也會導(dǎo)致部分不耐熱的黃酮類化合物分解［17］。因此，選擇提取時間為50、60、70 min 作為設(shè)計響應(yīng)面試驗的因素。

圖2 提取時間對總黃酮提取收率的影響Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoid content

2.2.2 不同料液比對香樟葉總黃酮提取工藝的影響

由圖3可知，隨著料液比的增大，香樟葉提取的總黃酮提取收率增加，但當(dāng)料液比大于1：50 時，增幅明顯變小，總黃酮提取收率趨于穩(wěn)定。這是因為提取溶劑越多，香樟葉粉末與溶劑之間的接觸面積越大，香樟葉的黃酮類化合物更容易轉(zhuǎn)移到溶劑中，從而提取得越充分［18］。但是在工業(yè)上過高的料液比會造成溶劑的浪費(fèi)和成本的升高，因此可把1：50 作為最佳的料液比，此時的總黃酮提取收率為13.71%。故選擇料液比為1：40、1：50 和1：60 作為設(shè)計響應(yīng)面試驗的因素。

圖3 料液比對總黃酮提取收率的影響Fig.3 Effect of soil-liquid ratio on total flavonoid content

2.2.3 不同乙醇濃度對香樟葉總黃酮提取工藝的影響

由圖4可知，隨著乙醇濃度的升高，香樟葉提取的總黃酮提取收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；在乙醇濃度為60%時達(dá)到最大值，為14.21%。這可能是因為在乙醇濃度較低時，乙醇可以促進(jìn)黃酮類化合物溶解［19］，但當(dāng)濃度過高時，植物細(xì)胞外的滲透壓過高，不利于總黃酮的浸出［20］。因此，選擇乙醇濃度為50%、60%、70%作為設(shè)計響應(yīng)面試驗的因素。

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取收率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on total flavonoid content

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計的結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計的結(jié)果如表3。應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件以自變量提取時間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）對香樟葉總黃酮提取收率（Y）的影響進(jìn)行回歸擬合，得多元回歸方程：

表3 響應(yīng)面設(shè)計與試驗結(jié)果Tab.3 Response surface design and experimental results

由表4 可知，該模型方程有顯著意義（P＜0.05），失擬項不顯著（P=0.083 8＞0.05），說明該回歸模型可以充分反映出香樟葉總黃酮的提取效果，并做出良好預(yù)測。二次項A2和B2對總黃酮的提取效果顯著（P＜0.05），二次項C2對總黃酮的提取效果極顯著（P＜0.01），一次項A、B、C和交互項AB、AC、BC對總黃酮的提取效果不顯著（P＞0.05），各因素影響程度依次為C（乙醇濃度）＞A（提取時間）＞B（料液比）。

表4 方差分析Tab.4 analysis of variance

從圖5可見，各響應(yīng)面圖的曲面均為開口向下，都有最高點(diǎn)，而且等高線圖的最小橢圓中心處于所取試驗因素條件范圍內(nèi)，說明香樟葉總黃酮提取收率在各因素設(shè)置的范圍內(nèi)具有最大值。此外，AC（提取時間和乙醇濃度交互作用）的響應(yīng)面曲面的坡度最大、等高線最密，說明提取時間和乙醇濃度的交互作用對響應(yīng)值（總黃酮提取收率）的影響最為顯著，而且總黃酮提取收率在提取時間為60 min附近出現(xiàn)峰值，在乙醇濃度為60%附近出現(xiàn)峰值。而BC（料液比和乙醇濃度的交互作用）的響應(yīng)面曲面坡度的陡峭程度和等高線密集程度次于AC，故料液比和乙醇濃度的交互作用影響響應(yīng)值的顯著性程度次之，而且總黃酮提取收率在料液比1：50附近出現(xiàn)峰值，在乙醇濃度為60%附近出現(xiàn)峰值?？梢?，各因素間交互作用對響應(yīng)值影響的顯著性程度順序依次為AC＞BC＞AB，分析結(jié)果與上述回歸模型系數(shù)的顯著性分析結(jié)果吻合。

圖5 交互效應(yīng)響應(yīng)面圖Fig.5 Interaction effect response surface

2.4 最佳提取工藝驗證

通過Design Expert 8.0.6 軟件對回歸方程模型進(jìn)行擬合分析，得到了香樟葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時間58.71 min，料液比1：50.70（g·mL-1），乙醇濃度61.01%，總黃酮提取收率預(yù)測值為14.370 5%?？紤]試驗的可操作性，調(diào)整為提取時間59 min，料液比1：51（g·mL-1）和乙醇濃度61%，進(jìn)行三次重復(fù)驗證試驗。結(jié)果顯示，香樟葉總黃酮提取收率為（14.39±0.48）%，符合預(yù)期結(jié)果。

2.5 香樟總黃酮體外抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基的清除能力

從圖6可見，隨著總黃酮濃度的增加，其DPPH·清除能力逐漸增強(qiáng)。在總黃酮濃度為0.8 mg·mL-1時，DPPH·清除率的增幅趨于平緩并接近維生素C，而在總黃酮濃度為1.0 mg·mL-1時清除率達(dá)到最大值，為87.03%。

圖6 香樟總黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on DPPH free radicals

2.5.2 ·OH的清除能力

如圖7所示，增加總黃酮的質(zhì)量濃度，其·OH 的清除能力逐漸增強(qiáng)。在濃度為0.4～1.6 mg·mL-1時，總黃酮的·OH 的清除率均大于與維生素C。在總黃酮濃度為1.6 mg·mL-1時，·OH 的清除率增幅趨于平衡，而在濃度為2.0 mg·mL-1時達(dá)到最大值，為97.05%?？梢?，香樟總黃酮具有較強(qiáng)的·OH 清除能力。

圖7 香樟總黃酮和維生素C對·OH的清除能力Fig.7 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on·OH free radicals

2.5.3 ABTS+自由基的清除能力

香樟總黃酮清除ABTS+自由基的能力與濃度的關(guān)系如圖8 所示。在濃度為0.2～0.8 mg·mL-1時，總黃酮ABTS+自由基的清除率以較大的幅度升高。當(dāng)濃度大于0.8 mg·mL-1時，ABTS+自由基的清除率達(dá)到98.10%以上，非常接近維生素C 的清除能力?？梢?，香樟總黃酮具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，并在大于0.8 mg·mL-1濃度時與維生素C 的清除能力相當(dāng)。

圖8 香樟總黃酮和維生素C對ABTS自由基的清除能力Fig.8 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on ABTS free radicals

3 討論與結(jié)論

為進(jìn)一步挖掘香樟葉的利用價值和提高其利用率，本研究利用Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗對香樟葉總黃酮的回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對香樟總黃酮進(jìn)行體外抗氧化活性測定。結(jié)果表明，香樟總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時間59 min，料液比1：51（g·mL-1）和乙醇濃度61%，總黃酮提取收率達(dá)到（14.39±0.48）%，與預(yù)測值接近，說明該工藝優(yōu)化條件穩(wěn)定可行。對最佳提取條件下的總黃酮提取物進(jìn)行體外抗氧化活性探究，發(fā)現(xiàn)對DPPH 自由基、OH·自由基和ABTS 自由基都有較強(qiáng)的清除作用。在濃度大于0.8 mg·mL-1時，ABTS+自由基的清除率達(dá)到98.10%以上，與維生素C 的清除能力相當(dāng)。而在濃度為0.4～1.6 mg·mL-1時，總黃酮的·OH 的清除率均大于維生素C，在濃度為2.0 mg·mL-1時達(dá)到最大值，為97.05%?？梢?，香樟葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是一種潛在的抗氧化劑。本研究為進(jìn)一步深度開發(fā)香樟植物資源提供了一種新思路，為提高香樟葉利用率和價值提供了科學(xué)依據(jù)。