李卓蔚，楊青山，江春陽，黃小蘭，石汝杰，周 濃

（重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）是百合科重樓屬中著名的藥用植物，為中藥重樓藥材項下的基源植物之一，其根莖具有清熱解毒、消腫止痛、息風(fēng)定驚的功效，常用于治療癰腫瘡毒、毒蛇咬傷、跌打損傷、小兒驚風(fēng)等疾病［1］。由于過去重樓藥材以野生采挖為主，過度采集和生境破壞導(dǎo)致滇重樓日趨瀕危，發(fā)展人工栽培已成為滿足市場需求和保護野生資源的最有效途徑［2］。目前，重樓栽培種源比較混亂、藥材質(zhì)量參差不齊、各種病蟲害發(fā)病率持續(xù)上升，嚴(yán)重制約了其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［3］。因此，將微生物栽培技術(shù)應(yīng)用于實際生產(chǎn)，以期提高藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)是當(dāng)前工作的重中之重。課題組研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌在室溫盆栽或大田栽培條件下能有效提高滇重樓產(chǎn)量和品質(zhì)，顯著影響滇重樓的次生代謝產(chǎn)物［3-4］。AM 真菌種類對植物的酚類、生物堿等次生代謝產(chǎn)物的影響不同［5］，而酚酸類是眾多植物根系土壤中常見的自毒物質(zhì)，由其導(dǎo)致的自毒作用制約著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)增收［6］。張敏瑜等［7］在溫室盆栽6個月后接種AM 真菌，顯著提高了柑橘酚酸類物質(zhì)的積累，但是酚酸組分在根和根分泌物中存在差異；馬通等［8］在溫室盆栽條件下接種AM 真菌，能夠有效的減少土壤中酚酸類物質(zhì)的積累，不論連作年限的長短，均具有較強的抑制作用。但AM 真菌與滇重樓共生栽培后，其根際土壤中酚酸類物質(zhì)的變化如何不得而知。滇重樓是一種名貴的藥材，其土壤中的酚酸含量將直接影響滇重樓的產(chǎn)量，故對接種AM 真菌后，滇重樓根際土壤酚酸類物質(zhì)含量影響的研究，有利于探知影響滇重樓產(chǎn)量的本質(zhì)。課題組前期已將施加AM 真菌混合菌劑，對滇重樓根際土壤理化性質(zhì)的影響進行了初步研究。本試驗在重慶、貴州、云南3省市模擬大田條件下滇重樓與AM 真菌的共生栽培，研究AM 真菌對不同栽培地點根際土壤中酚類等次生代謝物的影響，以期為合理評價AM 真菌對緩解滇重樓人工栽培中自毒作用提供可靠的依據(jù)，為大規(guī)模推廣大田栽培滇重樓提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

為評價接種AM 真菌對滇重樓生長發(fā)育的影響，通過美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心（INVAM）購得相應(yīng)的AM 真菌純凈菌劑，接種菌劑均為帶有孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質(zhì)，利用TROUVELOT A 等［9］方法構(gòu)建不同組合菌種的試驗方案，篩選出2 個AM 真菌混合處理（AM1 和AM2）和1 個對照處理（CK）：（1）AM1 生物肥料中含有豐富的（Scutellospora calospora、Cetraspora pellucida、Racocetra coralloidea、Racocetra fulgida）；（2）AM2生物肥料中含有豐富的（Scutellospora calospora、Cetraspora pellucida、Gigaspora margarita、Gigaspora gigantea、Septoglomus deserticola、Claroideoglomus claroideum）；（3）對照植株以不接種（CK）處理。栽培土壤均為未栽培過滇重樓的本地山基土，分別采集于重慶市萬州區(qū)、貴州省安順市、云南省保山市3個栽培地點的2 個AM 真菌處理組和CK 組的滇重樓根際土壤［10］，采用抖土法收集各處理組根際土壤，室內(nèi)風(fēng)干后過100 目（0.150 mm）篩，密封干燥保存，待用。

1.1.2 儀器

ME204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；VORTEX-3 型漩渦混合器（德國IKA 公司）；氣浴恒溫振蕩器（金壇市精達儀器制造有限公司）；SB-5200DTN 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BUCHI R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京海富達科技有限公司）；GT10-1 型高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（日本shimadzu株式會社）。

1.1.3 試藥

丹參素對照品（批號：DST170420-015，純度：HPLC≥98.0%）、對羥基苯甲酸對照品（批號：DST170506-114，純度：HPLC≥99.0%）、香草酸對照品（批號：DST180516-088，純度：HPLC≥98.0%）、對香豆酸對照品（批號：DST171206-057，純度：HPLC≥99.0%），均由成都德斯特生物技術(shù)有限公司提供，用于含量測定。乙腈和甲醇為德國默克公司生產(chǎn)的色譜純，鹽酸為優(yōu)級純，乙酸乙酯等試劑為分析純，水為怡寶純凈水。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸對照品適量，其中丹參素用50%甲醇溶液溶解，其余對照品用純甲醇溶解，并制成質(zhì)量濃度分別為916.0、517.0、507.0、502.0 ug/mL的對照品貯備液。

1.2.2 供試品溶液的制備

取土樣（過100目篩）10.0 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入2 mol/L NaOH 溶液25 mL，漩渦混勻，置于25℃搖床中，以200 r/min 震蕩12 h，取出，放至室溫，靜置2 h，于4 000 r/min 離心15 min，分離后上清液用12 mol/L HCl 調(diào)pH 至2.5，沉淀出胡敏酸，超聲震蕩10 min 后靜置2 h，過濾。取上清液，采用乙酸乙酯萃取5次，收集上層萃取液，合并，置于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，將殘渣溶解并用甲醇定容于2 mL 棕色量瓶中，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為A 相為乙腈，B 相為1%冰醋酸溶液，等度洗脫A：B=25：75；檢測波長為280 nm；流速為0.8 mL/min；進樣量為15 μL；柱溫為30℃。樣品及對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）及樣品（B）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of mixed reference substance（A）and sample（B）

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密量取1.2.1 節(jié)下4 種酚酸對照品貯備液適量，逐級稀釋，搖勻，制得不同質(zhì)量濃度的混合對照品工作液，按照1.2.3 節(jié)色譜條件下進樣分析，計算峰面積。以4 種酚酸對照品的峰面積（Y）與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度實驗

取1.2.4 節(jié)下同一混合對照品溶液，按1.2.3 節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算4 種酚酸類成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。

1.2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取土壤（貴州安順，AM2）10.0 g，依據(jù)1.2.2節(jié)供試品溶液制備方法制得滇重樓根際土壤酚類化合物待測液，平行制備6份，依據(jù)1.2.3節(jié)色譜條件進樣測定，計算4種酚酸類成分峰面積的RSD。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取土壤（貴州安順，AM2）10.0 g，依據(jù)1.2.2 節(jié)供試品溶液制備方法制得滇重樓根際土壤酚類化合物待測液，依據(jù)1.2.3節(jié)色譜條件對同一樣品分別在0、4、8、12、16、24 h 進樣測定，計算4 種酚酸類成分峰面積的RSD。

1.2.8 加樣回收率試驗

根據(jù)本實驗方法，分別精密稱取6 份已知含量的滇重樓根際土壤5.0 g（貴州安順，AM2），精密加入4 種酚酸對照品適量，依據(jù)1.2.2 節(jié)供試品溶液制備方法制得滇重樓根際土壤酚類化合物待測液，依據(jù)1.2.3 節(jié)色譜條件下進樣測定，分別計算4 種酚酸類成分的加標(biāo)回收率和RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003 軟件對測定數(shù)據(jù)進行處理，4 種酚酸的含量以±s表示，并基于SPSS 22.0軟件對9 份滇重樓根際土壤的4 種酚酸含量進行主成分分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法優(yōu)選

本研究結(jié)合文獻［11-13］對土壤樣品的提取方式、提取溶劑、萃取方式分別進行了優(yōu)選，以丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸的含量為指標(biāo)，首先進行提取方式（振蕩、超聲）的考察，結(jié)果顯示振蕩提取法的提取率高于超聲提取法；而后進行不同類型提取溶劑（不同體積比甲醇、不同質(zhì)量濃度氫氧化鈉）比較，結(jié)果顯示2 mol/L NaOH 溶液提取率最佳且色譜基線較為平穩(wěn)；最后對萃取溶劑（乙酸乙酯、石油醚）及次數(shù)進行比較，結(jié)果顯示采用乙酸乙酯萃取5次能保證樣品萃取完全。

2.2 色譜條件優(yōu)選

本研究對色譜條件的檢測波長、流動相、色譜柱分別進行了優(yōu)選。首先通過紫外吸收光譜全波長掃描，發(fā)現(xiàn)丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸4 個酚酸在280 nm 處有最大吸收，最終確定“1.2.3”節(jié)下的色譜條件；而后考察了乙腈-1%冰醋酸水溶液、乙腈-2%冰醋酸水溶液、乙腈-1%甲酸水溶液及甲醇-1%冰醋酸水溶液4 種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示在乙腈-1%冰醋酸水溶液系統(tǒng)下，4 種酚酸均得到較好的分離且基線平穩(wěn)、峰形對稱；最后對 色 譜 柱Diamonsil C18（2）（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Durashell C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Venusil ASB C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）等進行考察，最終確定Diamonsil C18（2）色譜柱，各色譜峰可達到理想的分離效果。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸等4種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：Y=9 961.5X+85 076，R2=0.999 2；Y=34 024X+15 846，R2=0.999 7；Y=37 360X-13 231，R2=0.999 7；Y=93 109X+48 749，R2=0.999 8。4 種酚酸的質(zhì)量濃度分別在15.3～458.0、3.4～103.4、3.4～101.8、6.7～200.8 μg/mL 線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密試驗

丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸等4種酚酸色譜峰峰面積的RSD 值分別為0.39%、0.28%、0.72%和0.22%，表明本實驗的測定方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)試驗

丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸等4種酚酸色譜峰峰面積的RSD 值分別為0.65%、2.83%、0.12%和2.80%，表明本實驗所用測定方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定試驗

丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸等4種酚酸色譜峰峰面積的RSD 值分別為2.49%、2.01%、0.62%和2.40%，表明4 種酚酸在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加標(biāo)回收試驗

如表1所示，4種酚酸組分的加標(biāo)平均回收率在98.12%～100.03%之間，RSD 為1.65%～2.97%，均小于3.0%，表明本實驗所用測定方法回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于滇重樓根際土壤中酚酸的含量測定。

表1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of standard addition recovery test （n=6）

2.4 大田接種不同AM 真菌混合處理對滇重樓根際土壤中酚酸類成分分析

精密稱取3 個不同產(chǎn)地、不同處理組滇重樓根際土壤10.0 g，依據(jù)1.2.2 節(jié)供試品溶液制備方法制得根際土壤酚類化合物待測液，平行制備6份，依據(jù)1.2.3 節(jié)色譜條件進樣測定，計算4 種酚酸類成分的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，不同栽培地點下不同處理組中的滇重樓根際土壤酚酸含量具有顯著性差異（P＜0.05），其中丹參素含量最高，為41.50～64.08 μg/g，平均值為50.74 μg/g；其次是對香豆酸，含量為2.46～21.70 μg/g，平均值為10.71 μg/g；對羥基苯甲酸含量為6.73～12.23 μg/g，平均值為9.17 μg/g；香草酸含量為4.55～10.81 μg/g，平均值為7.25 μg/g。

表2 不同栽培條件下滇重樓根際土壤中酚酸含量Tab.2 Content of phenolic acid in rhizosphere soil of P. polyphylla var. yunnanensis under different cultivation condition（±s，n=3，μg/g）

表2 不同栽培條件下滇重樓根際土壤中酚酸含量Tab.2 Content of phenolic acid in rhizosphere soil of P. polyphylla var. yunnanensis under different cultivation condition（±s，n=3，μg/g）

處理組AM1 AM2 CK試驗基地重慶萬州貴州安順云南保山重慶萬州貴州安順云南保山重慶萬州貴州安順云南保山丹參素53.03±2.38c 57.42±2.23b 41.70±0.10e 54.71±2.82bc 52.40±0.74cd 41.50±0.80e 64.08±2.28a 49.33±2.30d 42.50±0.81e對羥基苯甲酸7.43±0.28ef 12.23±0.85a 6.73±0.35f 8.00±0.23de 11.00±0.05b 8.91±0.12c 8.56±0.59cd 10.54±0.46b 9.12±0.09c香草酸6.49±0.22d 10.81±0.66a 4.55±0.25f 6.58±0.22d 9.86±0.29b 4.91±0.14ef 7.43±0.36c 9.46±0.20b 5.18±0.06e對香豆酸2.46±0.04g 19.14±0.18b 9.38±0.17f 2.46±0.03g 21.70±0.45a 10.09±0.34e 2.51±0.19g 17.86±0.19c 10.80±0.12d總計69.41±1.62ef 99.60±2.57a 62.36±0.52g 71.75±2.54e 94.96±0.84b 65.41±0.63fg 82.58±3.37d 87.19±2.54c 67.60±0.76f

2.5 主成分分析

通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析，如表3 所示，從4 個酚酸組分中提取出2 個主成分（特征值＞1），第1 個主成分的特征值為2.66，貢獻率為66.58%，其中特征向量值最大的是對羥基苯甲酸，其次是香草酸。第2 個主成分的特征值是1.22，貢獻率為30.44%，其中特征向量值最大的是丹參素。2 個主成分累積貢獻率為97.02%，表明這2 個主成分能反映AM 真菌對滇重樓根際土壤不同處理組的基本特征。

表3 不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤中酚酸的主成分分析Tab.3 Principal component analysis of phenolic acids in rhizosphere soils of P. polyphylla var. yunnanensis from different producing areas

2.6 相關(guān)性分析

對不同栽培地點不同處理組滇重樓根際土壤中酚酸含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，根際土壤中4種酚酸存在一定的相關(guān)性，主要表現(xiàn)為對羥基苯甲酸與香草酸和對香豆酸呈極顯著正相關(guān)（r=0.853、0.826，P＜0.01），丹參素和香草酸呈顯著正相關(guān)（r=0.601，P＜0.05），香草酸和對香豆酸呈顯著正相關(guān)（r=0.650，P＜0.05），表明滇重樓根際土壤中4種酚酸的次生代謝相互之間具有一定的促進作用。

表4 不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤中酚酸的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient of phenolic acid in rhizosphere soil of P. polyphylla var. yunnanensis from different producing areas

3 討論

藥用植物在目前的栽培生產(chǎn)模式下，自毒物質(zhì)可能是造成其連作障礙的主要原因之一，自毒物質(zhì)是藥用植物的次生代謝產(chǎn)物，主要為水溶性的酚酸類物質(zhì)等，可造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降［14］。酚類物質(zhì)是藥用植物最廣泛的次生代謝產(chǎn)物之一，AM 真菌能誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生酚類物質(zhì)并調(diào)節(jié)其生物合成，且受生境條件的影響較大［5，8］。本研究結(jié)果顯示，不同栽培地點的不同AM 真菌處理組與CK 組相比，在模擬大田栽培條件過程中，重慶萬州和云南保山滇重樓根際土壤中丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸含量及其總含量呈現(xiàn)下降趨勢，根際土壤中酚酸物質(zhì)的積累表現(xiàn)出較強的抑制作用，而貴州安順則呈現(xiàn)增加趨勢，表現(xiàn)出較強的促進作用，這與張華等［5］研究結(jié)果類似。

據(jù)報道，土壤微生物數(shù)量與酚酸成分含量存在密切的相互影響關(guān)系［15］。課題組前期報道了在接種AM真菌后，滇重樓根際土壤中3類微生物的數(shù)量均顯著高于CK 組，貴州安順栽培滇重樓根際土壤相同處理組的真菌數(shù)量高于其余2 個栽培地點，而細(xì)菌、放線菌則相反，因此降低了貴州安順栽培地點的微生物豐度［10］，因此，貴州安順栽培地點的滇重樓可能受到根際土壤微生物種群的改變，從而導(dǎo)致本栽培地點呈現(xiàn)出根際土壤酚酸物質(zhì)增加的趨勢，其相互之間的作用機制有待下一步深入探究。

值得一提的是，滇重樓需要7 年以上生長才能收獲成藥材，其生長發(fā)育及其土壤環(huán)境變化是個漫長的動態(tài)過程。由于本研究是對3 個栽培地點1 年的觀察結(jié)果，栽培的環(huán)境條件每年均有所差異，僅在滇重樓適生區(qū)局部試驗，只能代表調(diào)查結(jié)果，因此，還需要在盆栽和模擬大田條件下進行更長時間、更多栽培區(qū)域的考察，以及在盆栽條件下對外源酚酸功能進行驗證，在“滇重樓-土壤-環(huán)境”系統(tǒng)才能得出更為確切的結(jié)論。

4 結(jié)論

本研究在前人基礎(chǔ)上，同時對提取方法、色譜條件進行了試驗，篩選出能夠快速檢測滇重樓根際土壤中4種酚酸（丹參素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸）含量的方法，且方法簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性高、分離效果好，能夠準(zhǔn)確、快速地測定土壤中4種酚酸含量。同時比較了3 個栽培地點的不同AM 真菌處理組滇重樓根際土壤中酚酸成分的差異性，有待進一步將AM 真菌與土壤酚酸之間的相關(guān)性做深入研究，更好地為開展緩解滇重樓化感自毒作用和消減連作障礙提供理論依據(jù)。