吳紅雁，顧亞琴，周紅成，陳 欣，張立虎（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究院，江蘇鹽城 224005）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由多種原因致慢性肝損害所引發(fā)的病理改變，任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都存在纖維化的過程；如果損傷因素長期存在，纖維化的過程將長期持續(xù)，最終可能會發(fā)展為肝硬化[1]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）主要位于肝臟的狄氏腔內(nèi)，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)；在外界損傷刺激下，HSCs將被激活，其活化和快速增殖被普遍認(rèn)為是HF形成的中心環(huán)節(jié)，因此現(xiàn)階段研究將HSCs作為HF疾病治療的關(guān)鍵靶標(biāo)[2]。有研究表明，在肝損傷過程中，活化的HSCs 受到HF 微環(huán)境的影響，其能量代謝方式將發(fā)生轉(zhuǎn)變，由氧化磷酸化供能途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馔緩?，后者具有葡萄糖攝取率高、糖酵解活躍、代謝產(chǎn)物乳酸（lactic acid，LD）含量高的優(yōu)勢[3]。這樣的能量代謝方式能為HSCs持續(xù)供能，有利于其持續(xù)活化，從而推動HF的不斷進(jìn)展[3]?？梢?，HSCs糖酵解在HF中具有重要作用，抑制糖酵解途徑可抑制HSCs 增殖、阻斷HSCs 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抑制并改善HF，可作為治療HF 的潛在策略。

黃芪初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘，性微溫，“主癰疽，久敗瘡，排膿止痛，大風(fēng)癩疾，五痔，鼠瘺，補(bǔ)虛，小兒百病”[4]。作為一種補(bǔ)益中藥，黃芪被廣泛應(yīng)用于臨床治療及日常保健。環(huán)黃芪醇（cycloastragenol，CAG）是從黃芪中分離出的一種次生代謝產(chǎn)物，是由黃芪藥理活性成分黃芪甲苷經(jīng)水解而得。與黃芪甲苷相比，CAG的脂溶性更強(qiáng)，更容易通過細(xì)胞膜而被吸收入體[5]。近年來研究表明，CAG具有廣泛的藥理作用，如抗衰老、抗炎、減輕腦損傷、抑制肺纖維化、抗抑郁等[6]。此外有研究指出，黃芪、黃芪甲苷有抗HF的作用，CAG能有效改善非酒精性脂肪性肝病[7]，還能抑制阿霉素致小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化物水平的升高[8]。同時亦有證據(jù)表明，CAG可通過激活糖代謝相關(guān)受體（如法尼醇X 受體）來顯著降低高脂飲食所致的肝臟脂質(zhì)堆積，從而改善肝臟脂肪病變[7]。由此可見，CAG可能通過調(diào)控能量代謝過程來發(fā)揮肝臟保護(hù)作用?；诖耍狙芯繑M采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的HF 小鼠模型來探究CAG 對其HF 及糖酵解的影響，旨在為闡釋該成分抗HF作用（尤其是通過影響糖酵解過程來發(fā)揮能量代謝調(diào)控作用）的機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

SpectraMax型多功能酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；Ⅸ53 型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司；RM2235 型石蠟切片機(jī)購自德國Leica 公司；5424R型臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；YD-6D 型組織包埋機(jī)、YD-A 型組織攤片機(jī)、YD-B 型組織烤片機(jī)均購自金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；YP502N型電子天平購自上海菁海儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

CAG對照品（批號C14J9Q65733，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；CCl4（分析純，批號20180320）購自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒（貨號C010-2）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒（貨號C009-2）、LD測試盒（貨號A019-2）、己糖激酶（hexokinase，HK）測試盒（貨號A077-1）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）測試盒（貨號A129）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）測試盒（貨號A076-1）均購自南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號abs120451）、兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ）抗體（批號abs131984）均購自愛必信（上海）生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號SA00003-2-20000121）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號F0111021）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木精-伊紅（HE）等染色試劑均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；磷鉬酸（批號51429-74-4-20191017）購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純化水。

1.3 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為20～25 g，由南京青龍山實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2017-0011。所有小鼠均飼養(yǎng)在24 ℃恒溫、12 h 黑暗/光照循環(huán)的動物房內(nèi)，并自由攝食、飲水。本實驗方案符合我院相關(guān)動物倫理要求，倫理批件號為SYLL-2021-005。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取ICR 小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組和CAG 低、中、高劑量組（60、120、240 mg/kg，以5%CMC-Na 溶液為溶劑[9－12]），每組6 只。禁食過夜后，模型組和各藥物組小鼠均腹腔注射10%CCl4-橄欖油溶液（5 mL/kg），每周3 次，持續(xù)8 周以復(fù)制HF 模型；空白組小鼠腹腔注射等體積橄欖油。自造模第4周起，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，空白組和模型組小鼠灌胃0.5%CMC-Na溶液，灌胃量均為10 mL/kg，每天1次，持續(xù)4周。

2.2 小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的測定和樣本采集

實驗過程中，稱定并記錄小鼠體質(zhì)量。末次灌胃后，小鼠禁食、不禁水過夜，于第2 天摘眼球取血。血樣靜置2 h 后，以3 000×g離心15 min，取上層血清，于－20 ℃下保存。隨后，將小鼠頸椎脫臼處死，剖取肝臟，稱定質(zhì)量并計算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量（含末次灌胃前）×100%。迅速切取部分肝組織，置于10%甲醛溶液中固定；剩余肝組織切塊，于－80 ℃下保存。

2.3 小鼠肝損傷指標(biāo)檢測

取“2.2”項下各組小鼠血清樣品適量，使用酶標(biāo)儀以化學(xué)比色法檢測其血清中AST、ALT 水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)檢查及相關(guān)指標(biāo)檢測

2.4.1 肝組織病理學(xué)檢查 取“2.2”項下固定于10%甲醛溶液中的各組小鼠肝組織適量，用水沖洗，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切片（厚度4～8 μm）。參照文獻(xiàn)方法[10]，分別進(jìn)行HE 染色、Masson 染色、天狼星紅染色，置于顯微鏡下觀察小鼠的肝組織病理情況并拍照。HE染色結(jié)果采用Ishak評分法進(jìn)行定量分析，HE染色評分越高，表明肝損傷越明顯；Masson 染色和天狼星紅染色結(jié)果采用Image J 軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果以膠原容積分?jǐn)?shù)表示，膠原容積分?jǐn)?shù)越高，即膠原陽性區(qū)域越大，表明纖維化程度越高[10]。

2.4.2 collagen Ⅰ、α-SMA 表達(dá)檢測 采用免疫組化法進(jìn)行檢測。取“2.2”項下固定于10%甲醛溶液中的各組小鼠肝組織適量，用水沖洗，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切片（厚度5 μm）。切片用3%H2O2溶液室溫孵育5～10 min以消除過氧化物酶活性，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 min×3次，用5%正常山羊血清封閉孵育以減少非特定結(jié)合。室溫孵育60 min后，棄去血清；分別滴加collagen Ⅰ、α-SMA一抗（稀釋比例分別為1∶200、1∶500），4 ℃孵育過夜；用PBS 清洗2 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例1∶200），孵育30 min；用PBS 清洗2 min×3 次后，在室溫下以DAB 顯色劑顯色，用水沖洗后，用蘇木精復(fù)染、二甲苯透明，以中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件對陽性區(qū)域（棕褐色）的灰度值進(jìn)行檢測，并將其作為相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 小鼠糖酵解相關(guān)指標(biāo)檢測

取“2.2”項下各組小鼠血清和凍存的肝組織（肝組織需勻漿）適量，使用酶標(biāo)儀，以化學(xué)比色法檢測其血清中LD 含量，以酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測其血清及肝組織勻漿上清液中糖酵解關(guān)鍵酶（HK、PFK、PK）水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 7 軟件作圖。實驗數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用雙因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 CAG 對CCl4誘導(dǎo)的HF 模型小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響

空白組小鼠體質(zhì)量增長明顯。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量整體呈下降趨勢（P＜0.05）。與模型組比較，CAG中、高劑量組小鼠體質(zhì)量均有所增加（P＜0.05）并接近于空白組，其中CAG中、高劑量組的作用更為明顯。結(jié)果見圖1A。

與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，CAG各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1B。

3.2 CAG對CCl4誘導(dǎo)的HF模型小鼠肝損傷指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 水平均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，CAG各劑量組小鼠血清中ALT、AST 水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST 水平的檢測結(jié)果（，n＝6，U/L）

表1 各組小鼠血清中ALT、AST 水平的檢測結(jié)果（，n＝6，U/L）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.3 CAG對CCl4誘導(dǎo)的HF模型小鼠HF的影響

HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織中可見肝細(xì)胞散在分布，索狀排列不明顯且間隙大，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化病變，且HE染色評分顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)不同劑量的CAG干預(yù)后，各劑量組小鼠的肝損傷程度均較模型組有所減輕，其HE 染色評分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、圖3A。

Masson染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠的纖維化結(jié)構(gòu)特征清晰，明顯可見膠原沉積自匯管區(qū)周圍向外延伸，纖維條索較粗且著色較深，兩者的膠原容積分?jǐn)?shù)均顯著升高（P＜0.05），提示存在明顯的纖維化病變；經(jīng)不同劑量的CAG干預(yù)后，各劑量組小鼠的膠原沉積和纖維化病變程度均較模型組有所減輕，其膠原容積分?jǐn)?shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2，圖3B、3C。

圖2 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察的顯微圖（×400）

圖3 各組小鼠肝組織病理學(xué)染色定量分析結(jié)果（，n＝6）

免疫組化法檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織中collagen Ⅰ、α-SMA蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，CAG各劑量組小鼠肝組織中collagen Ⅰ、α-SMA蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠肝組織中collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)的免疫組化顯微圖（×400）

圖5 各組小鼠肝組織中collagen Ⅰ、α-SMA 蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果（，n＝6）

3.4 CAG對CCl4誘導(dǎo)的HF模型小鼠糖酵解的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中LD含量和血清、肝組織中HK、PFK、PK水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，CAG 各劑量組小鼠血清中LD 含量和血清、肝組織中HK、PFK、PK 水平（CAG 低劑量組肝組織除外）均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2、表3。

表2 各組小鼠血清中LD含量和HK、PFK、PK水平的檢測結(jié)果（，n＝6）

表2 各組小鼠血清中LD含量和HK、PFK、PK水平的檢測結(jié)果（，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

表3 各組小鼠肝組織中HK、PFK、PK 水平的檢測結(jié)果（，n＝6）

表3 各組小鼠肝組織中HK、PFK、PK 水平的檢測結(jié)果（，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

4 討論

HF 是一種由多種因素刺激致肝損傷的慢性疾病，致病因素包括過量飲酒、病毒（包括乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒）感染、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎等[13]。若治療不及時，HF將會進(jìn)一步進(jìn)展為肝細(xì)胞癌[14]。HF可引發(fā)多種肝損傷和相關(guān)疾病，且在我國和世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率均較高[15]。HSCs 活化被認(rèn)為是HF 發(fā)生和發(fā)展的主要原因：肝損傷可導(dǎo)致HSCs 活化，靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs 將轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和積累，最終進(jìn)展為HF[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在HSCs活化過程中，細(xì)胞內(nèi)能量代謝方式會發(fā)生轉(zhuǎn)變，即由以線粒體氧化磷酸化途徑為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐詿o氧糖酵解途徑為主，其中糖酵解關(guān)鍵酶HK、PFK、PK 的表達(dá)均顯著增高，類似于在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Warburg 效應(yīng)[3，16]。這種快速的能量代謝過程在正常生理條件下少量存在；但在HSCs活化過程中，該途徑能為HSCs 持續(xù)供能，因此通過阻斷糖酵解途徑來切斷HSCs 的能量供應(yīng)，從而抑制HSCs 活化可成為抗HF 的新策略。

CAG是從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的一種有效成分，具有抗衰老、抗炎、抗肺纖維化、抗抑郁等諸多藥理作用[5]，但關(guān)于CAG抗HF的作用尚未有報道。為此，本研究以CCl4誘導(dǎo)構(gòu)建經(jīng)典的HF動物模型，觀察CAG對小鼠HF的影響。組織病理學(xué)和相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)CAG干預(yù)后，HF模型小鼠的體質(zhì)量明顯增加，肝臟指數(shù)顯著降低，肝組織病理學(xué)損傷得到明顯改善；同時，小鼠血清中AST、ALT 水平，肝組織病理學(xué)HE 染色評分、Masson和天狼星紅染色膠原容積分?jǐn)?shù)，以及coallgen Ⅰ、α-SMA蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，且上述作用均有一定的劑量依賴趨勢。這提示CAG 可在一定程度上減輕肝損傷，具有一定的抗HF作用。

如前所述，抑制糖酵解可作為治療HF 的潛在策略之一。HK、PFK、PK 是糖酵解過程中關(guān)鍵的限速酶，其中HK 可催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，PFK 可催化6-磷酸果糖磷酸化生成1，6-二磷酸果糖，磷酸烯醇式丙酮酸可在PK 的作用下轉(zhuǎn)變成丙酮酸，從而為相關(guān)生物過程持續(xù)供能[3，17]。因此，本研究通過檢測糖酵解終產(chǎn)物L(fēng)D 的含量和糖酵解過程中關(guān)鍵酶HK、PFK、PK 的水平來考察CAG 是否會影響HF 發(fā)生發(fā)展過程中的糖酵解水平。結(jié)果表明，模型組小鼠血清中LD含量明顯增加，血清和肝組織中糖酵解關(guān)鍵酶水平均顯著升高，提示糖酵解水平上升；經(jīng)CAG 干預(yù)后，各劑量組小鼠血清中LD 含量明顯減少，且血清和肝組織中的糖酵解關(guān)鍵酶水平（低劑量組肝組織除外）均顯著降低，提示糖酵解水平下降。可見，CAG 對CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF 有改善作用，同時降低了HF 發(fā)生發(fā)展過程中的糖酵解水平。但是，CAG 改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF 是否與抑制HSCs 的糖酵解有關(guān)還需進(jìn)一步的實驗驗證。

綜上所述，CAG 對CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF 有改善作用，同時降低了其體內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶和產(chǎn)物水平。可為CAG 相關(guān)抗HF 藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)，也可為靶向HSCs 活化過程中糖酵解途徑的相關(guān)藥物研發(fā)提供參考。