伍曉萍 ，代玉玲 ，張 玲 ，王 紅 ，鄒 瓊 ，王進(jìn)吉 ，劉艷紅 ，陳 彤

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科，云南 昆明 650032；3）云南省婦幼保健院藥劑科，云南 昆明 650051）

三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.chen ex C.H.），又名參三七、田七等，為五加科多年生草本植物，是我國名貴中藥材。三七中主要有效成分包括：三七多糖，三七皂苷、黃酮類、氨基酸、揮發(fā)油等[1]。據(jù)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)三七多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能[2]、抗炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]等藥理作用，劉平平等[8]發(fā)現(xiàn)從三七發(fā)酵液提取的三七多糖對(duì)DPPH 自由基、羥自由基等具有一定清除作用?，F(xiàn)已有研究表明，天然多糖如：銀耳多糖、山藥多糖、靈芝多糖等具有良好的吸濕保濕性能，在日化產(chǎn)品中具有良好的應(yīng)用前景[9]，而三七多糖是否具有吸濕、保濕的生物活性尚未見報(bào)道。

三七藥渣是三七在工業(yè)中提取三七總皂苷后的廢渣[10]，其中三七多糖、三七素等成分仍具有藥用價(jià)值卻不能得到有效利用。本課題組前期采用水提醇沉法，從工業(yè)三七藥渣中提取三七粗多糖，通過DEAE Sepharose Fast Flow 成功分離出中性多糖和酸性多糖，已證實(shí)三七藥渣中提取的三七多糖具有多種生理活性[11-12]，且具有良好的安全性[13]。本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，首次考察從藥渣中提取的三七粗多糖及純化后各組分是否具有吸濕、保濕及體外抗氧化活性，為三七多糖用于日化產(chǎn)品、保健食品、藥品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

三七藥渣（云南三七科技提供）；D-無水葡萄糖對(duì)照品、D-半乳糖醛酸對(duì)照品、DPPH、ABTS（上海源葉生物）；甘油、抗壞血酸（VC）、七水合硫酸亞鐵（廣東光華科技）；海藻酸鈉（上海易恩）；DEAE Sepharose Fast Flow 填 料（美 國GE Healthcare）；透析袋（合肥白鯊生物科技）；其余試劑均為國產(chǎn)分析級(jí)純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S 萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；DK-98-II 水浴鍋（天津市泰斯特）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；H1850 高速離心機(jī)（湖南湘儀）；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機(jī)（寧波新芝）；玻璃干燥器（四川蜀玻集團(tuán)）；島津UV-1900 紫外-分光光度計(jì)（日本島津）；Bio-rad MODEL 680 酶標(biāo)儀（美國Bio-rad 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 三七多糖的提取、純化及含量測(cè)定采用水提醇沉法從工業(yè)三七藥渣中提取CPPN，取干燥三七藥渣1 000 g，加入10 倍量超純水，沸水浴提取6 h，過濾；濾渣加入8 倍量超純水，沸水浴提取6 h，過濾；濾渣繼續(xù)加入6 倍量超純水，沸水浴提取6 h，過濾。合并3 次濾液，8 000 r/min 離心5 min，取上清液，80℃減壓濃縮，至原體積的1/10 后，加入濾液3 倍體積的無水乙醇，放4 ℃下醇沉過夜。8 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，收集沉淀。分別用無水乙醇、乙醚洗滌沉淀三次后加入適量超純水復(fù)溶，冷凍干燥，即得CPPN。采用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換填料對(duì)CPPN 進(jìn)行純化，取CPPN 600 mg，溶于20 mL 超純水中，8 000 r/min 離心10 min 去除不溶物，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后上樣，以超純水、0.1、0.2、0.3 M NaCl 溶液對(duì)其進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，5 mL/管。硫酸蒽酮法跟蹤檢測(cè)，繪制洗脫曲線其中管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。依據(jù)洗脫曲線，合并各組分，80℃減壓濃縮至原體積1/10，超純水透析36 h（MwCO 14000Da），每4 h 換一次水。透析結(jié)束后，真空冷凍干燥，分離得到的各組分依次命名為NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ。采用硫酸蒽酮法，測(cè)定三七多糖中性糖含量，間羥基聯(lián)苯法測(cè)定三七多糖糖醛酸含量[14]。

1.3.2 吸濕/保濕能力考察參照蔡婉靜等[15]在研究中采用的方法，以常用的保濕劑甘油和海藻酸鈉對(duì)照，考察CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸濕和保濕能力。（1）吸濕 性。準(zhǔn)確稱 取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中，平行3 份，將其放入置有飽和碳酸鉀溶液（RH43%）和飽和硫酸銨溶液（RH81%）的干燥器內(nèi)，室溫下放置，并在4、8、12、24、36 h 分別稱量樣品放置前重量（W0）和放置后的重量（W1），吸濕能力按照公式（1）計(jì)算：

（2）保濕性。準(zhǔn)確稱 取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中，平行3 份，并分別加入3 倍樣品質(zhì)量的超純水，轉(zhuǎn)動(dòng)稱量瓶直至樣品將水分完全吸收。將稱量瓶放入裝有干燥完全的硅膠的干燥室內(nèi)，于室溫下放置，并在4、8、12、24、36 h 分別稱量樣品放置前重量（H0）和放置后的重量（H1）。保濕能力按照公式（2）計(jì)算:

1.3.3 抗氧化能力測(cè)定（1）DPPH 自由基清除能力。將維生素C 和三七多糖各待測(cè)組分用蒸餾水配置成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL 濃度的樣液測(cè)定時(shí)，在96 孔板中加入2×10-4mol/L的DPPH 乙醇溶液100 μL，然后加入100 μL 待測(cè)液，搖勻后，在室溫，黑暗處放置30 min，并測(cè)定517 nm 處的吸光度值A(chǔ)t，用乙醇代替DPPH溶液測(cè)定本底吸光度值A(chǔ)r，用超純水代替樣品溶液測(cè)得參比溶液吸光度A0[16]。采用Vc 作為陽性對(duì)照，同一測(cè)定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，清除率按公式（3）計(jì)算:

（2）ABTS+自由基清除能力。將5 mL 的7 mmol/L ABTS 和88 μL 的140 mmol/L K2S2O8混 合，常溫避光條件下靜置過夜（12 h），形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。使用前用無水乙醇稀釋成在734 nm 波長下的吸光度為0.7±0.02 工作液[17]。測(cè)定時(shí)，在96 孔板中加入ABTS+工作液100 μL 和100 μL待測(cè)液，振蕩混勻，10 min 后測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值A(chǔ)t，用乙醇代替ABTS+工作液測(cè)定本底吸光度值A(chǔ)r，用超純水代替樣品溶液測(cè)得參比溶液吸光度A0。采用Vc 作為陽性對(duì)照，同一測(cè)定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，清除率由公式（4）計(jì)算：

（3）羥基自由基清除能力。配置2.25 mmol/LFeSO4水溶液、9 mmol/L 水楊酸乙醇溶液，分別取50 μL 加入96 孔板，取50 μL 待測(cè)液加入，再加入50 μL 8.80 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定510 nm 處吸光度At。用超純水代替H2O2測(cè)得對(duì)應(yīng)待測(cè)溶液的本底吸光度值A(chǔ)r，用超純水代替待測(cè)液測(cè)得參比溶液吸光度A0[18]。采用Vc 作為陽性對(duì)照，同一測(cè)定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，清除率由公式（5）計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 三七多糖的提取、純化及含量測(cè)定

1 000 g 三七藥渣采用經(jīng)水提醇沉法，共提取到34.97g CPPN，得率為3.49 %。采用DEAE Sepharose Fast Flow 對(duì)CPPN 進(jìn)行純化，以超純水、0.1、0.2、0.3 M NaCl 溶液洗脫，共得到4 個(gè)洗脫峰（洗脫曲線見圖1），得率分別為27.68%、11.89%、15.41%、21.04%，對(duì)CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的含量測(cè)定結(jié)果如表1 所示。

表1 三七多糖的含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.1 Determined the contents of Panax notoginseng polysaccharide（%）

圖1 DEAE Sepharose Fast Flow 洗脫曲線Fig.1 Elution curve with DEAE Sepharose Fast Flow

2.2 三七多糖的吸濕性

在RH43% 環(huán)境中，水分的含量隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖2 所示，三七多糖及各組分的吸濕率均逐漸上升，吸濕率大小依次為甘油＞APPNⅢ＞海藻酸鈉＞CPPN＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞NPPN，36 h 時(shí)，吸濕率分別為37.21%、25.50%、23.55%、19.10%、18.43%、16.99%、13.20%。從圖3 可以看出，在高濕度（RH81%）環(huán)境中，在0～12 h，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸濕率上升較快，12 h～36 h 變化緩慢，36 h 時(shí)，吸濕率大小為甘油＞APPNⅢ＞海藻酸鈉＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞CPPN＞NPPN，吸濕率大小依次為83.57%、42.58%、39.76%、30.81%、27.80%、24.59%、20.80%。由兩圖對(duì)比顯示，APPNⅢ在高濕度和低濕度下都具有良好的吸濕性，其吸濕性高于海藻酸鈉。

圖2 三七多糖在RH43%環(huán)境中的吸濕率變化情況Fig.2 Relationship between moisture retention rate and time

圖3 三七多糖在RH81%環(huán)境中的吸濕率變化情況Fig.3 Relationship between moisture retention rate and time

2.3 三七多糖的保濕性

保濕性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，在干燥硅膠環(huán)境中，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸鈉保濕率均持續(xù)下降，保濕率大小依次為APPNⅢ＞海藻酸鈉＞CPPN＞APPNⅡ＞甘油＞APPNⅠ＞NPPN，在36 h 時(shí)，保濕率分別為45.64%、40.35%、38.40%、36.15%、35.38%、34.35%、33.59%。

圖4 三七多糖在干硅膠環(huán)境中的保濕率變化情況Fig.4 Relationship between moisture retention rate and time

2.4 三七多糖對(duì)DPPH 的清除能力

由圖5可知，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ對(duì)DPPH 均具有較好的清除能力，且呈明顯的量效關(guān)系，當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，CPPN 對(duì)DPPH 自由基的清除效果最好，達(dá)58.36%，而NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除 率分別 為12.90%、50.66%、37.26%、47.71%。抗氧化活性順序?yàn)镃PPN＞APPNⅠ＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞NPPN。艾于杰等[18]發(fā)現(xiàn)純化后的茶多糖清除DPPH 清除能力純化前強(qiáng)于純化后，推測(cè)粗多糖對(duì)DPPH 的清除作用可能為各組分結(jié)合后協(xié)同作用。本研究中三七粗多糖清除效果最好，推測(cè)其原因?yàn)槠叽侄嗵侵懈鹘M分協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用。

圖5 三七多糖對(duì)DPPH 的清除能力Fig.5 Scavening rate of DPPH of Panax notoginseng polysaccharide

2.5 三七多糖對(duì)ABTS+的清除能力

ABTS 可被活性氧氧化，生成藍(lán)綠色的ABTS+自由基，在734 nm 處有特征吸收，當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，自由基被抗氧化劑清除時(shí)，藍(lán)綠色會(huì)逐漸褪色或消失[19]。三七多糖及純化后各組分對(duì)ABTS+的清除效果圖6 所示，隨著多糖濃度的增大，其清除ABTS+自由基的效果也不斷增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分別為95.91%、36.41%、87.37%、68.34%、83.34%，抗氧化活性順序?yàn)镃PPN＞APPNⅠ＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞NPPN。三七粗多糖對(duì)ABTS+自由基的清除效果最好，分離純化得到的4 個(gè)組分中，APPNⅠ的清除效果較強(qiáng)，NPPN 的清除能力較弱。有研究表明，多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力與DPPH 自由基的清除能力具有一致性[20]，本研究中CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ對(duì)ABTS+的清除能力與對(duì)DPPH 自由基清除能力趨勢(shì)一致。

圖6 三七多糖對(duì)ABTS+的清除能力Fig.6 Scavening rate of ABTS+ of Panax notoginseng polysaccharide

2.6 三七多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

羥基自由基是機(jī)體內(nèi)攻擊性最強(qiáng)的活性氧，多糖是具有多羥基的醛或多羥基的酮，該結(jié)構(gòu)上帶有還原性的半縮醛羥基，使自由基被還原，從而阻止自由基進(jìn)行連鎖反應(yīng)[21]。由圖7 可知，各濃度的VC 對(duì)羥自由基的清除率最高，不同濃度的CPPN 及純化后各組分對(duì)羥自由基均具有一定的清除作用，隨多糖濃度的升高，對(duì)羥自由基的清除能力也不斷升高，當(dāng)CPPN 濃度為8 mg/mL，CPPN 的清除能力為98.95%，與VC 接近。同一濃度下，抗氧化活性順序?yàn)镃PPN＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞NPPN。

圖7 三七多糖對(duì)·OH 的清除能力Fig.7 Scavening rate of ·OH of Panax notoginseng polysaccharide

3 討論

本文采用水提醇沉法成功從三七藥渣中提取出三七多糖，并經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow 對(duì)其純化，成功分離出NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ，并對(duì)CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸濕和保濕性能首次初步探究，發(fā)現(xiàn)APPNⅢ的吸濕性能優(yōu)于海藻酸鈉，其保濕性能也優(yōu)于海藻酸鈉及常用保濕劑甘油，表明APPNⅢ是一種優(yōu)良的保濕劑。

自由基，是生物體新陳代謝的正常產(chǎn)物，在正常的生理狀態(tài)下，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生處于動(dòng)態(tài)平衡中，受體內(nèi)各種內(nèi)源性抗氧化網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)機(jī)體平衡一旦被打破，體內(nèi)自由基過多時(shí)，自由基會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，誘導(dǎo)各種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如炎癥、腫瘤等疾病?，F(xiàn)有研究表明，諸多植物多糖具有抗氧化活性，如：枸杞多糖[22]、茯苓多糖[23]。多糖的抗氧化活性常與多糖分子量、糖基組成、糖苷鍵類型、高級(jí)結(jié)構(gòu)等相關(guān)[18]。三七多糖體外抗氧化活性研究顯示：三七粗多糖與分離純化后的各組分比較，其對(duì)三種自由基的清除效果最佳，抗氧化能力最強(qiáng)，推測(cè)三七粗多糖中各組分多糖的抗氧化性有協(xié)同作用；純化后的三種酸性多糖的抗氧化活性均強(qiáng)于中性多糖，說明三七多糖的抗氧化性與其酸性基團(tuán)密切相關(guān)。綜上，通對(duì)三七多糖具有吸濕、保濕性能及體外抗氧化活性，表明三七多糖具有應(yīng)用于日化行業(yè)、保健食品、藥品的潛力，為工業(yè)三七藥渣的綜合利用提供了新思路，有利于三七資源的綜合利用。