張練，王茂娟，周榮，江帆

（1.四川省德陽市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，德陽 618000；2.四川省德陽市人民醫(yī)院中醫(yī)科，德陽 618000）

膿毒癥是極為常見、致命和治療代價昂貴的疾病之一，其為由細菌、病毒或真菌感染引起，導致全身性炎性反應綜合征及器官功能障礙甚至死亡[1]。膿毒癥經(jīng)常導致彌漫性腦功能障礙，即膿毒癥性腦病（SAE）。越來越多的證據(jù)表明，膿毒癥患者的長期認知障礙與病死率增加之間存在關聯(lián)[2]。膿毒癥的病理生理機制仍未能完全闡述清楚，提示需要探尋更加具體有效的治療膿毒癥的方法。

木犀草素屬于天然黃酮類化合物，主要存在于水果、蔬菜和多種中草藥中[3]。臨床研究表明，木犀草素具有多種生物學和藥理活性，如抗腫瘤、抗肝臟毒性、抗過敏和抗氧化作用[4-5]。已有研究表明，木犀草可以通過抗炎和抗氧化作用改善膿毒癥誘導的急性肺損傷[6]。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種常見的炎性因子，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到關鍵作用[7]，它在膿毒癥患者中表達升高。

目前關于木犀草素對膿毒癥的具體作用機制未見報道，故本研究擬建立SAE 小鼠模型，探究木犀草素通過調控HMGB1 對SAE 小鼠模型認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠120 只，8 周齡，體質量（22±2）g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司[許可證號：SCXK（浙）2019-0004]。小鼠飼養(yǎng)于四川省醫(yī)學科學院動物房中[許可證號：SYXK（川）2018-058]，室溫（20±2）℃，12 h 光照/12 h黑暗循環(huán)，自由飲水和進食。本動物實驗經(jīng)德陽市人民醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 實驗藥物和主要試劑 木犀草素（批號：111520-202006）購自中國食品藥品檢定研究院，化學式：C15H10O6，相對分子量：286.24，純度≥94.4%；甘草酸（批號：1295888）購自美國Sigma-Aldrich 公司；白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號：JLC6422）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（批號：JLC7047）、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA 檢測試劑盒（批號：JLC6382）購自上海晶抗生物工程有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：QN1075）購自北京百奧萊博科技有限公司；原位末端標記技術（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1091）購自上海碧云天生物技術研究所；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號：SY2022）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號：SY6458）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）檢測試劑盒（批號：SY6452）、丙二醛（MDA） 檢測試劑盒（批號：SY6486）購自北京伊塔生物科技有限公司；兔抗HMGB1（批號：ab18256）、Actin（批號：ab8227）均購自英國Abcam 公司。

1.3 動物模型的建立及分組 將小鼠隨機分為6 組：假手術（Sham）組、模型（Model）組、木犀草素低劑量（Lut 50 mg/kg）組、木犀草素中劑量（Lut 100 mg/kg）組、木犀草素高劑量（Lut 200 mg/kg）組和地塞米松（Dex 1 mg/kg）組（作為陽性對照），每組12 只。參照Lima 等[8]方法采用盲腸結扎穿刺（CLP）建立膿毒癥小鼠模型：腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，仰臥位固定，消毒后腹中線切口開腹，游離腸系膜和盲腸，除Sham 組外其余各組用絲線在回盲瓣以下環(huán)形結扎，針頭在結扎部位遠端進行貫通穿口，擠出少量糞便，縫合切口。模型建立成功后，Lut 50、100、200 mg/kg 組分別灌胃給予50、100、200 mg/kg的木犀草素[9]，Dex 1 mg/kg 組腹腔注射地塞米松1 mg/kg[10]，Sham 組和Model 組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)4 d，每日1 次。模型建立后每隔12 h 檢測小鼠存活情況，連續(xù)96 h，進行生存分析。

1.4 曠場實驗 采用曠場反應箱收集各組小鼠10min運動距離和中央?yún)^(qū)域停留時間。實驗在安靜環(huán)境下進行，將小鼠放入箱底部中央，同時進行攝像與計時，每只小鼠單獨進行實驗。

1.5 Morris 水迷宮實驗檢測小鼠逃避潛伏期、目標象限時間和穿越區(qū)域次數(shù) Morris 水迷宮裝置由高60 cm、直徑150 cm 的黑色圓形池組成，分為4 個視覺象限，池中注滿水。將直徑10 cm 的圓形平臺放置在第三象限中心、水面下方2 cm 處。連續(xù)4 d，將小鼠放入面向池壁的池中，每只小鼠依次從4 個象限進入，并以相同的順序進入水中。在60 s 內未能找到平臺的小鼠被引導并允許在平臺上停留10 s。將小鼠用于尋找平臺的時間記錄為潛伏期。第5 天，在沒有平臺的情況下，記錄在目標象限中花費的時間以及小鼠越過目標象限的次數(shù)。

1.6 標本采集 于末次給藥12 h 后，將各組小鼠于冰臺斷頭，取海馬組織，部分10%甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，蠟塊包埋，切片厚度為5 mm。部分海馬組織4 ℃加入生理鹽水制成1∶9 勻漿液。

1.7 HE 染色觀察小鼠大腦海馬區(qū)組織病理損傷 采用HE 染液，取各組大鼠海馬組織切片，進行脫水、包埋、制片、HE 染色，在光學顯微鏡下觀察并拍攝。1.8 TUNEL 染色檢測細胞凋亡 按照TUNEL 細胞凋亡試劑盒提供的方法，對切片進行染色封片，光學顯微鏡觀察組織細胞凋亡狀況。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.9 ELISA 法檢測海馬組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平 取“1.6”項收集的各組大鼠海馬組織勻漿液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測海馬組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平。

1.10 試劑盒檢測海馬組織中SOD、MDA、GSH 含量 按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定SOD 含量，采用可見分光光度計測定MDA、GSH 含量。SOD在450 nm 處檢測A 值，MDA 在532 nm 處測A 值，GSH 在412 nm 處測A 值。

1.11 WesternBlot 法檢測HMGB1 蛋白表達水平 取各組小鼠腦組織加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，進行總蛋白提取，BCA 試劑盒測定蛋白質含量。提取等量蛋白質樣品，100 ℃變性5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉移至PVDF 膜，5%的牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h 后加入HMGB1 一抗，4 ℃過夜孵育，次日TBST 清洗后加入辣根過氧物酶（HRP）-免疫球蛋白G（IgG）室溫孵育1 h，清洗后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J 軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.12 考察加入HMGB1 抑制劑對膿毒癥小鼠模型的影響 將48 只小鼠隨機分為4 組：Model 組、木犀草素（Lut 200 mg/kg）組、甘草酸（GL）組、木犀草素+甘草酸（Lut 200 mg/kg+GL）組，參照“1.3”建立膿毒癥小鼠模型，Lut 200 mg/kg 組灌胃給予200 mg/kg木犀草素，GL 組腹腔內注射25.9 mL/kg（0.5 mL 生理鹽水中溶解10 mg 甘草酸）甘草酸[11]，Lut 200 mg/kg+GL 組同時灌胃木犀草素和腹腔注射甘草酸。檢測各組小鼠HMGB1 蛋白表達水平、活動探索及學習認知能力、神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激指標（SOD、GSH、MDA）水平和炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）水平。

1.13 統(tǒng)計學分析 本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素升高SAE 小鼠存活率 與Sham 組比較，Model 組小鼠存活率降低（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg 組小鼠存活率升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 木犀草素對SAE 小鼠存活率的影響（n=12）

2.2 木犀草素改善SAE 小鼠認知障礙 通過曠場實驗檢測各組小鼠10 min 內總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間，結果顯示與Sham 組比較，Model 組總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間縮短（P＜0.05）；與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg組總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間提高（P＜0.05）。通過Morris 水迷宮實驗檢測各組小鼠逃避潛伏期、目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)，結果顯示與Sham 組比較，Model 組逃避潛伏期時間升高（P＜0.05），目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)降低（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg 組逃避潛伏期時間降低（P＜0.05），目標象限時間以及穿越區(qū)域次數(shù)升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 木犀草素對SAE 小鼠認知障礙的影響（±s，n=12）

2.3 木犀草素減輕SAE 小鼠腦損傷 通過HE 染色檢測各組小鼠大腦海馬區(qū)組織病理損傷，結果顯示Sham 組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結構完整，排列規(guī)整，細胞質均勻，細胞核清晰。Model 組海馬區(qū)神經(jīng)細胞體積變小，排列紊亂，炎性因子浸潤。Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg 組較Model 組病理損傷程度改善，細胞排列較規(guī)整，炎性因子浸潤減少。見圖3。

圖3 木犀草素對SAE 小鼠腦損傷的影響（HE，×200，n=12）

2.4 木犀草素抑制SAE小鼠神經(jīng)細胞凋亡 TUNEL染色檢測各組小鼠神經(jīng)細胞凋亡，結果顯示與Sham 組比較，Model 組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 木犀草素對SAE 小鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響（±s，n=12）

2.5 木犀草素對SAE 小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響 通過ELISA 法檢測各組小鼠海馬組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，結果顯示與Sham 組比較，Model 組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 木犀草素對SAE 小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響（±s，n=12）

2.6 木犀草素對SAE 小鼠SOD、GSH、MDA 含量的影響 通過試劑盒檢測各組小鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH 含量，結果顯示與Sham 組比較，Model 組SOD、GSH 含量降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg組SOD、GSH 含量升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 木犀草素對SAE 小鼠SOD、MDA、GSH 含量的影響（±s，n=12）

2.7 木犀草素對SAE 小鼠HMGB1 蛋白表達水平的影響 通過Western Blot 法檢測各組小鼠HMGB1 蛋白表達水平，結果顯示與Sham 組比較，Model 組小鼠HMGB1 蛋白水平升高（P＜0.05）。與Model 組比較，Lut 100、200 mg/kg 組和Dex 1 mg/kg組小鼠HMGB1 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 木犀草素對SAE 小鼠HMGB1 蛋白表達水平的影響（±s，n=12）

2.8 木犀草素通過調控HMGB1 改善SAE 小鼠模型的認知障礙 通過Western Blot 法檢測各組小鼠HMGB1 蛋白表達水平，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組HMGB1 蛋白水平降低（P＜0.05），GL 組HMGB1 蛋白水平升高（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組HMGB1 蛋白水平降低（P＜0.05）。通過曠場實驗考察各組小鼠10 min 內總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間升高（P＜0.05），GL 組總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間降低（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組總行駛距離和中央?yún)^(qū)域停留時間升高（P＜0.05）。通過Morris 水迷宮實驗檢測各組小鼠逃避潛伏期、目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組逃避潛伏期時間降低（P＜0.05），目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)升高（P＜0.05），GL 組逃避潛伏期時間升高（P＜0.05），目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)降低（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組逃避潛伏期時間降低（P＜0.05），目標象限時間、穿越區(qū)域次數(shù)升高（P＜0.05）。見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

2.9 木犀草素通過調控HMGB1 對SAE 小鼠模型神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激和炎癥的影響 通過TUNEL 染色檢測各組小鼠神經(jīng)細胞凋亡，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組細胞凋亡率降低（P＜0.05），GL 組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。通過ELISA 法檢測各組小鼠海馬組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05），GL 組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。通過試劑盒檢測各組小鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH 含量，結果顯示與Model 組比較，Lut 200 mg/kg 組SOD、GSH 含量升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05），GL 組SOD、GSH 含量降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）；與GL 組比較，Lut 200 mg/kg+GL 組SOD、GSH 含量升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見OSID。

3 討論

膿毒癥患者常存在睡眠與覺醒周期紊亂、意識受損、認知障礙、明顯的精神錯亂和昏迷等大腦局灶性或彌漫性功能障礙，早期應用抗感染藥物、多器官功能保護、抑制氧化應激、減輕全身炎性反應、對意識狀態(tài)改變的早期識別等均有助于延緩膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[12-13]。本研究通過曠場實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木犀草素處理后，SAE 小鼠的活動和探索能力增強。Morris 水迷宮實驗可以反映小鼠的學習和認知能力，實驗發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠的學習和認知能力減弱，木犀草素能夠改善小鼠的學習和認知能力，提示木犀草素對SAE 小鼠的認知功能障礙具有改善作用。

失控性全身炎性反應和免疫功能障礙是膿毒癥發(fā)生的主要病理生理過程[14]。IL-6 是評估和檢測膿毒癥的常用指標，其水平高低與膿毒癥呈正相關。研究表明，高水平的促炎細胞因子IL-1β 和TNF-α與術后認知障礙有關[15-16]。余潔等[17]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以抑制哮喘患兒外周血單個核細胞（PBMCs）促炎性細胞因子TNF-α、IL-6 的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有降低SAE 小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的作用，提示木犀草素抑制了SAE 小鼠模型炎性因子的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木犀草素處理后，SAE 小鼠SOD、GSH 含量升高，MDA 含量降低。在膿毒癥患者發(fā)病的過程中，其腦部可以產(chǎn)生大量氧化應激因子及炎性細胞因子并導致腦損傷，特別是在海馬和皮質區(qū)域容易出現(xiàn)早期氧化應激反應[18]。氧化應激是膿毒癥多系統(tǒng)損傷的根本機制，抗氧化治療可能成為膿毒癥治療的新策略[19]。MDA 是細胞膜脂質被活性氧氧化的副產(chǎn)物，是氧化應激損傷的生物標志物。SOD是細胞中主要的抗氧化酶，是清除氧自由基的主要物質，能夠抵抗氧自由基對細胞的損害[20]。李娜[21]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以緩解糖尿病腦梗死大鼠氧化應激反應，提示木犀草素通過抗氧化應激對SAE 小鼠模型起到腦組織保護作用。

HMGB1 是真核細胞廣泛表達的一種高度保守的細胞核非組蛋白，當細胞壞死或被激活時可釋放大量HMGB1，可促進炎性因子的釋放，進而促進膿毒癥進展和器官損傷[22]。HMGB1 與膿毒癥的病情嚴重程度及預后相關，相關研究表明血漿、血清HMGB1濃度與病情嚴重程度呈正相關[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有降低SAE 小鼠HMGB1 蛋白表達水平的作用，加入HMGB1 抑制劑甘草酸后，逆轉了木犀草素對SAE 小鼠模型認知障礙、炎癥因子、神經(jīng)細胞凋亡和氧化應激的影響，提示木犀草素能夠通過調控HMGB1 改善SAE 小鼠模型的認知功能障礙。

綜上所述，木犀草素能夠通過調控HMGB1 升高SAE 小鼠模型存活率，增強膿毒癥小鼠模型活動探索能力和學習認知能力，降低神經(jīng)細胞凋亡率，減輕炎性反應和氧化應激水平。本研究為木犀草素臨床治療膿毒癥提供了參考。