危柳柳 賴(lài)月亮 朱方擎 林曄 謝俊峰

(贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000)

早期胃癌被定義為腺癌局限于胃黏膜或黏膜下層淋巴結(jié)存在或不存在轉(zhuǎn)移，其生物學(xué)行為與進(jìn)展期胃癌相比相對(duì)良性，目前尚不清楚在2個(gè)腫瘤之間是否存在不同的致癌途徑，是否與癌癥發(fā)生的早期和晚期有關(guān)〔1，2〕。在胃的發(fā)育過(guò)程中，胃上皮細(xì)胞凋亡的平衡增殖受到干擾，過(guò)度的B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2原癌基因和突變P53蛋白積累〔3〕，兩者都在胃癌前病變向癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)中起著至關(guān)重要的作用〔4〕。大多數(shù)早期和晚期胃上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化癌癥數(shù)據(jù)來(lái)自日本和東亞，來(lái)自西方的人口是有限的〔5〕。本研究探討miR-21通過(guò)Bcl-2和P53對(duì)早期胃癌病理形態(tài)學(xué)的影響。

1 資料與方法

1.1臨床標(biāo)本 江西省贛州市人民醫(yī)2018年1月至2019年7月期間接受治療的早期胃癌患者60例。早期胃癌納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)為病理，確診為早期胃癌；②尚未發(fā)生早期胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；③年齡48～60歲；④所有患者知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于復(fù)發(fā)性早期胃癌；②術(shù)前檢查有感染和轉(zhuǎn)移；③有其他惡性腫瘤合并；④有肝腎、心血管系統(tǒng)等重大疾病。從每例患者身上取得的癌組織于半小時(shí)內(nèi)分別放入10%甲醛溶液中固定并且石蠟包埋。

1.2主要材料 免疫組化皆使用單克隆抗體，Envision染色系統(tǒng)、抗Bcl-2、抗P53(美國(guó)BMI公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色，無(wú)水乙醇，稀氨水，二甲苯。

1.3分組 60例早期胃癌患者取得的癌組織通過(guò)增加和減少miR-21表達(dá)水平分為過(guò)表達(dá)miR-21組和敲低miR-21組各30例，并隨機(jī)選取兩組各15例患者的癌旁正常組織作為對(duì)照組(30例)。

1.4Western印跡 使用RIPA緩沖液(Solarbio，R0010，上海)和抑制劑混合物(Sigma，P8340-5ML，St.Louis，MO，USA)提取細(xì)胞和組織的總蛋白質(zhì)并測(cè)定通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(SBJ-1001；Beyotime，SENBEIJIA Bio，南京)〔6〕。加入上樣緩沖液以調(diào)節(jié)濃度。變性后，向每個(gè)樣品孔中加入20 μg。使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS、PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品，然后在電泳和跨膜后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)移相應(yīng)的蛋白質(zhì)，用脫脂乳密封2 h〔7〕。將膜與抗-Smurf1(PB0937，1∶1 000；武漢博士德生物技術(shù)有限公司，武漢)和抗β-微管蛋白(2146，1∶1 000；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA)一起孵育初級(jí)抗體〔8〕。β-微管蛋白用作上樣對(duì)照。在4℃下過(guò)夜孵育。將PVDF膜洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔抗體(抗兔IgG，HRP連接抗體6402-05，1∶5 000；Amylet Scientific Inc，武漢)，并在37℃溫育。持續(xù)1～2 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)著色劑(Haigene，M2301，哈爾濱)使條帶可視化〔9〕。分析靶蛋白β-微管蛋白的灰度比，表明目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。

1.5免疫組化 針對(duì)結(jié)直腸癌組織的免疫組化，樣本取自癌癥最具侵襲性的區(qū)域〔9〕。將標(biāo)本固定在10%甲醛溶液中，包埋在石蠟中，并切成4 μm厚的切片。4 μm厚的切片在二甲苯中脫蠟，并在分級(jí)系列乙醇中再水合。切片用2%脫脂乳和5%牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水中孵育，以阻斷免疫試劑的非特異性結(jié)合。隨后，在室溫下與單克隆抗MMPs抗體作為一級(jí)抗體。然后，用0.3% H2O2處理，抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性30 min，并進(jìn)行標(biāo)記鏈霉親和素生物素技術(shù)。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為顯色劑，對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

1.6組織學(xué)評(píng)估 基于德國(guó)免疫反應(yīng)評(píng)分〔10〕。染色強(qiáng)度的等級(jí)從0到3，0、1、2或3分別表示無(wú)染色、弱染色、中等染色或強(qiáng)染色。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分如下：無(wú)染色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。通過(guò)將染色強(qiáng)度所得的分?jǐn)?shù)乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分比所得的分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算最終分?jǐn)?shù)，結(jié)果范圍為0～12分。為了將強(qiáng)度評(píng)分與臨床病理因素進(jìn)行比較，最終評(píng)分0～5分被認(rèn)為是低表達(dá)，6～12分被為高表達(dá)。組織學(xué)和免疫組化評(píng)估由2名不知道患者臨床特征的觀(guān)察者獨(dú)立進(jìn)行。在觀(guān)察者意見(jiàn)不一致的情況下，評(píng)估由額外的觀(guān)察者進(jìn)行。

1.7HE染色 將早期胃癌組織切片，二甲苯Ⅰ脫蠟進(jìn)行10 min，此后用二甲苯Ⅱ脫蠟5 min，完成之后用無(wú)水乙醇洗去二甲苯，重復(fù)清洗3遍，用95%乙醇清洗1 min，90%乙醇清洗1 min，最后用蒸餾水清洗掉乙醇。用蘇木素進(jìn)行染色，保持1 min，再用清水洗滌1 min，1%鹽酸酒精分化20 s，清水洗滌3 min，再用1%氨水反藍(lán)30 s，清水洗滌1 min，伊紅染色20 s，清水洗滌1 min，然后用85%乙醇脫水20 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇Ⅰ脫水1 min，95%乙醇Ⅱ 1 min，無(wú)水乙醇Ⅰ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅱ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅲ脫水2 min，最后分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理2 min，用中性樹(shù)膠封片完成即可。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-21通過(guò)Bcl-2和P53對(duì)癌組織HE染色的影響 過(guò)表達(dá)miR-21組胃體和胃竇部黏膜炎癥較輕，輕微水腫，上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜淺層有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，固有腺體完整；敲低miR-21組病變黏膜固有層內(nèi)慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，深達(dá)黏膜肌層，血管增生，基底部腺體上皮增生，出現(xiàn)共壁現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。過(guò)表達(dá)miR-21組的病理組織學(xué)情況顯著優(yōu)于敲低miR-21組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2miR-21通過(guò)Bcl-2和P53對(duì)癌組織免疫組化的影響 過(guò)表達(dá)miR-21組中小部分細(xì)胞的胞質(zhì)染色，呈黃色、棕黃色、棕色、褐色；敲低miR-21組中大部分細(xì)胞染色，呈棕色和褐色，在不典型增生、腸化生細(xì)胞中呈深褐色。見(jiàn)圖2。

圖1 miR-21通過(guò)Bcl-2、P53對(duì)癌組織HE染色的影響(×200)

表1 兩組病理組織學(xué)情況對(duì)比(n=30)

圖2 miR-21通過(guò)Bcl-2、P53對(duì)癌組織免疫組化的影響(×200)

2.3各組Bcl-2、P53的蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組Bcl-2、P53蛋白表達(dá)(0.48±0.03、0.38±0.07)相比，過(guò)表達(dá)miR-21組Bcl-2蛋白表達(dá)(0.17±0.02)顯著降低，P53蛋白表達(dá)(0.96±0.13)顯著上升(P<0.05)；敲低miR-21組Bcl-2蛋白表達(dá)(0.63±0.04)顯著上升，P53蛋白表達(dá)(0.27±0.04)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組Bcl-2和P53蛋白表達(dá)

3 討 論

早期胃癌患者進(jìn)行手術(shù)后的生存率可超過(guò)90%〔11〕，而轉(zhuǎn)移性早期胃癌患者的淋巴結(jié)有1%～3%的局限于胃黏膜，11%～20%局限于胃黏膜下層〔12〕。 診斷是指經(jīng)驗(yàn)豐富的中心使用高靈敏度和特異性的內(nèi)鏡對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)估〔13〕，判斷癌癥的發(fā)展進(jìn)程。對(duì)胃癌患者進(jìn)行早診斷、早治療能夠大大提高胃癌患者的生存率、預(yù)后水平，因此研究相關(guān)診斷指標(biāo)對(duì)胃癌臨床治療具有重要意義〔14〕。

目前只有少數(shù)指標(biāo)被報(bào)道可用于胃癌早期診斷，最近有報(bào)道表明，細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因?qū)ξ赴┑陌l(fā)展及預(yù)后有影響〔15〕。Bcl-2蛋白被報(bào)道能夠通過(guò)阻斷程序性細(xì)胞死亡延長(zhǎng)各種細(xì)胞的存活時(shí)間，有研究表明，Bcl-2過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃上皮異常增生，導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化〔16〕。另外，P53是正常細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子，野生型P53基因是一種抑癌基因，能夠修復(fù)損傷的DNA、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔17〕，但突變型P53基因是一種癌基因，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，突變型P53 蛋白質(zhì)常被免疫組化檢測(cè)〔18〕，有西方學(xué)者研究表明，P53蛋白在晚期胃癌的表達(dá)中高于早期胃癌〔19，20〕，提示P53蛋白在胃癌發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。目前已知，miR-21在多種腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且能夠作用于Bcl-2與P53等靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，miR-21在早期胃癌組織內(nèi)的過(guò)表達(dá)會(huì)顯著升高腫瘤組織內(nèi)P53蛋白的表達(dá)量、降低Bcl-2蛋白的表達(dá)量，而高表達(dá)P53蛋白和低表達(dá)的Bcl-2蛋白都能起到促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用，二者共同發(fā)揮抑癌作用優(yōu)化了胃癌組織的病理學(xué)形態(tài)，延緩了早期胃癌的發(fā)展進(jìn)程，說(shuō)明在臨床能夠通過(guò)檢測(cè)或調(diào)控miR-21水平對(duì)早期胃癌患者進(jìn)行診斷治療。

綜上，miR-21能夠通過(guò)升高P53表達(dá)、降低Bcl-2表達(dá)改善早期胃癌患者胃內(nèi)理化環(huán)境，減少理化損傷，miR-21也可以作為早期胃癌檢查的指標(biāo)，對(duì)患者的臨床治療有一定意義，但本研究設(shè)計(jì)并未涉及對(duì)于Bcl-2與P53作用機(jī)制的研究，關(guān)于miR-21通過(guò)Bcl-2和P53對(duì)早期胃癌的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。