荊湛 魏巍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

2020年全球肺癌新發(fā)病例數(shù)約為220萬，死亡病例數(shù)約為180萬，肺癌是全球癌癥致死的首位原因，占癌癥致死總數(shù)的18%〔1〕。按照病理特征的不同肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率高，占90%以上，小細(xì)胞肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例更高，預(yù)后更差〔2〕。目前可用于治療肺癌的方式很多，包括放化療、手術(shù)治療、靶向治療等，但是其5年生存率仍然低于20%〔3〕。因此尋找肺癌骨轉(zhuǎn)移早期診斷的生物標(biāo)志物對早期診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移尤為重要。小分子非編碼RNA(miRNA)，長度為17～25 bp，其異常表達(dá)與許多癌癥相關(guān)，如肺癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等〔4～7〕。miRNA的作用主要是調(diào)節(jié)靶基因，是相應(yīng)靶基因的上游因子，故它有可能成為早期癌癥診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GEO2R數(shù)據(jù)分析GSE47056芯片結(jié)果，篩選出特異性高表達(dá)的miR-550a-5p，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在老年性肺癌骨轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取佳木斯市腫瘤結(jié)核醫(yī)院與佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2019年10月至2021年10月臨床病理確診為肺癌的中老年患者101例。納入標(biāo)準(zhǔn):①均經(jīng)病理證實(shí)為肺癌，年齡不低于50歲；②術(shù)前未行放、化療等抗腫瘤治療；③臨床資料、隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有其他原發(fā)性惡性腫瘤；②伴心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重衰竭者;③伴自身免疫性疾病者;④伴精神疾病者。年齡50～89歲，中位年齡67歲；病理類型:小細(xì)胞肺癌26例，腺癌50例，鱗癌24例，其他1例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期59例，Ⅲ～Ⅳ期42例。另外以本實(shí)驗(yàn)室同學(xué)作為健康對照，其中女6例，男6例，年齡21～35歲，中位年齡25歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。

1.2研究方法與檢測指標(biāo) 采用血常規(guī)收集管取患者外周血2 ml，1 000 r/min離心15 min，分離血清250 μl置于1.5 ml無RNA酶離心管內(nèi)，標(biāo)記并置于-80℃低溫保存，采用試劑盒成批提取miRNA。采用柱式 miRNA 抽提試劑盒(購自上海生工生物公司)提取，使用加尾法反轉(zhuǎn)錄miRNA，通過miRNA增強(qiáng)型第一鏈合成cDNA試劑盒(購自北京天根生物公司)合成cDNA。按染料法熒光定量PCR試劑盒(購自北京天根生物公司)擴(kuò)增檢測。miR-550a-5p引物序列為：上游引物：5′-AGTGCCTGAGGGAGTAAGAGCCC-3′；U6作為內(nèi)參，引物序列為：上游引物：5′-ATGGACTATCATA TGCTTACCGTA -3′，下游引物為反轉(zhuǎn)錄試劑盒下游通用引物。反應(yīng)體系：2×miRNA qPCR master mix 10 μl；上下游引物各0.5 μl；cDNA 2 μl；ROX Reference Dye(H)1 μl；無RNA酶水6 μl；熒光定量 PCR儀檢測。每樣本平行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。根據(jù)CT值進(jìn)行對數(shù)(2-△△Ct) 計(jì)算。

1.3體外驗(yàn)證miR-550a-5p作用 A549細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。37℃，5%CO2條件下90%DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清(購自碧云天生物公司)培養(yǎng)細(xì)胞，收集指數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌離心，試劑盒提取miRNA。檢測方法同上。

1.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將指數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，脂質(zhì)體包被miR-550a-5p與NC分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞(A549-miR-550a-5p組及A549-NC組)待細(xì)胞長滿時(shí)，用槍頭劃痕，PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0 h與12 h測量細(xì)胞劃痕愈合情況并拍照。以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力(0 h的細(xì)胞劃痕愈合為0%)。

1.5Transwell 檢測細(xì)胞遷移能力 將指數(shù)生長期的A549-miR-550a-5p組及A549-NC組細(xì)胞常規(guī)消化，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml，上室加入細(xì)胞懸液200 μl，下室加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基900 μl，14 h后取出小室，干棉簽拭去內(nèi)表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，清洗，晾干，每組3個(gè)小室，每個(gè)小室選5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合方差齊的正態(tài)分布采用非配對獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；符合方差不齊的正態(tài)分布采用韋爾奇t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布運(yùn)用曼-惠特尼軼和檢驗(yàn)。應(yīng)用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-550a-5p對肺癌及肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值進(jìn)行評估。

2 結(jié) 果

2.1肺原位癌與骨轉(zhuǎn)移血清中miR-550a-5p的差異分析與驗(yàn)證 將GSE47056數(shù)據(jù)集中的表達(dá)矩陣導(dǎo)入GEO2R工具，分組后進(jìn)行差異分析。差異分析結(jié)果顯示，全部基因差異分析的火山圖。見圖1。其中，以miR-550a-5p為首的18個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，選擇差異顯著的miR-550a-5p進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證及研究。

綠色代表下調(diào)差異基因，紅色代表上調(diào)差異基因圖1 肺癌高轉(zhuǎn)移A549細(xì)胞株與低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株miRNA差異分析火山

2.2肺原位癌與骨轉(zhuǎn)移血清miR-550a-5p與臨床病理特征 肺原位癌患者外周血miR-550a-5p表達(dá)(0.157 2±0.021)高于正常人(0.140 3±0.011)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺癌骨轉(zhuǎn)移患者(n=49)miR-550a-5p(0.201 9±0.015)顯著高于原位癌(n=52,P<0.05)。miR-550a-5p與性別、吸煙史、腫瘤直徑不相關(guān)，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與腫瘤病理分型相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特性患者miR-550a-5p表達(dá)比較

2.3肺原位癌與骨轉(zhuǎn)移血清中miR-550a-5p臨床診斷骨轉(zhuǎn)移價(jià)值分析 miR-550a-5p用于診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移患者，曲線下面積為0.684，95%置信區(qū)間為：(0.540～0.829)，靈敏度為76.19%，特異性為60.00%。見圖2。

2.4miR-550a-5p促進(jìn)A549遷移能力驗(yàn)證 與A549-NC組比較，A549-miR-550a-5p組劃痕愈合率顯著降低，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05,P<0.01)。見圖3，表2、圖4。

圖2 血清miR-550a-5p診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移ROC曲線

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-550a-5p對A549細(xì)胞遷移能力影響(結(jié)晶紫染色，×100)

表2 兩組劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)比較

圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測miR-550a-5p對A549細(xì)胞遷移能力影響(×100)

3 討 論

肺癌的治療手段雖然日漸完善，但由于早期癥狀不明顯，肺癌確診時(shí)部分腫瘤已有區(qū)域轉(zhuǎn)移擴(kuò)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肺癌與前列腺癌、乳腺癌并稱三大最易發(fā)骨轉(zhuǎn)移癌癥，會(huì)出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴(yán)重影響患者生存率與生活質(zhì)量。老年性肺癌在肺癌患者中比例較高，是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移是選擇治療方案的重要考慮因素。目前診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移通常采用放射性核素骨掃描、發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描(ECT)、磁共振成像(MRI)等，但由于敏感度與特異度原因，難以實(shí)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移早期診斷目的。骨組織活檢是診斷骨轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于身體狀態(tài)等客觀原因，有很多患者不會(huì)選擇組織活檢診斷。因此尋找肺癌骨轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志物是目前研究熱點(diǎn)。雖然診斷骨轉(zhuǎn)移的特異性miRNA尚未有臨床應(yīng)用，但由于miRNA對腫瘤轉(zhuǎn)化、良性和惡性腫瘤進(jìn)展的特異性調(diào)節(jié)具有重要意義，并且miRNA存在于所有組織及血液中，在外周血中的miRNA由于有外泌體的包裹，其表達(dá)量穩(wěn)定，不易降解，是具有廣泛應(yīng)用前景的生物標(biāo)志物。

本文通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p在高轉(zhuǎn)移能力與低轉(zhuǎn)移能力肺癌之間表達(dá)差異明顯。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將miR-550a-5p轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞株A549中觀察其對細(xì)胞的影響，也發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-550a-5p導(dǎo)致細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)，具有促癌轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為能力。Guo等〔8〕、Meng等〔9〕發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p作為促癌因子在肺腺癌患者中高表達(dá)，與患者的生存率呈反比，在乳腺癌中也表現(xiàn)出相同趨勢，說明其作用明確穩(wěn)定，檢測重復(fù)性好。Heilmeier等〔10〕發(fā)現(xiàn)在糖尿病病理骨折與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折的患者中miR-550a-5p表達(dá)明顯升高，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p可以抑制成骨，說明miR-550a-5p在病理性骨折中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

綜上，miR-550a-5p既具有促腫瘤細(xì)胞遷移能力又具有抑制成骨反應(yīng)能力，是腫瘤骨轉(zhuǎn)移的潛在生物因子。如果可作為診斷腫瘤骨轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，將會(huì)為骨轉(zhuǎn)移癌患者早期診斷提供極大方便。