何超平，陳 煜，彭 莎，石 哲，李亞梅*，廖端芳*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

神經(jīng)免疫反應(yīng)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）的發(fā)育、清除以及各項(xiàng)正常生理功能的維持都具有十分重要的作用。 而小膠質(zhì)細(xì)胞作為一個(gè)主要的神經(jīng)免疫細(xì)胞，能夠迅速感知腦部免疫微環(huán)境的改變并作出響應(yīng)，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)免疫環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用[1]。 但另一方面，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過增加炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)的釋放從而產(chǎn)生并加劇神經(jīng)炎癥，小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥也與各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，例如抑郁癥、藥物成癮等，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制與炎癥相關(guān)[2-3]，因此，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)成為抑郁癥等一系列精神疾病的重要治療靶點(diǎn)[4]。

乙酰水楊酸是最普通也是應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，其藥理作用包括解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等，藥效迅速且穩(wěn)定。而姜黃素的抗炎效果已經(jīng)在很多研究中得以證實(shí)，近年來對(duì)于姜黃素抑制核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）活性的研究也比較深入[5]，但其缺點(diǎn)在于機(jī)體對(duì)姜黃素的吸收少、代謝快，并且生物利用度較低，這些缺點(diǎn)限制了姜黃素的臨床應(yīng)用。而本課題組將乙酰水楊酸基團(tuán)與姜黃素結(jié)合，人工半合成新型藥物乙酰水楊酸姜黃素酯（curcumin acetylsalicylate,CA；專利申請(qǐng)?zhí)?01210365392.2）[6]，在一定程度上克服了姜黃素吸收少的缺點(diǎn)，且本課題組前期研究已證實(shí)CA 可能通過抑制NF-κB p65蛋白水平，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)從而抑制高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠所致的動(dòng)脈硬化斑塊的形成[7]。因此，本研究通過分析CA 與相關(guān)炎性分子對(duì)接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CA 與NF-κB 和Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4, TLR4）對(duì)接良好，進(jìn)一步采用體外LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，探究CA 抗神經(jīng)細(xì)胞炎癥的效果及其潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞與藥物

小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞株來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；CA 由本課題合成并純化，純度為99.99%，溶于DMSO 中（DMSO 終濃度小于0.1%）。

1.2 試劑與儀器

LPS（貨號(hào)：L2880-10MG，美國Sigma 公司）；CCK-8（貨號(hào)：E-CK-A362，美國Bio-Sharp 公司）；NO 檢測試劑盒（貨號(hào)：S0021S，碧云天公司）；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（貨號(hào)：70-EK201B/3-96）、TNF-α ELISA 檢測試劑盒（貨號(hào)：70-EK282/3-96 均購自）聯(lián)科生物公司；NF-κB p65（貨號(hào)：ab16502）、p-NFκB p65（貨號(hào)：ab86299）、TLR4（貨號(hào)：ab13556）、MYD88（貨號(hào)：ab133739）、iNOS（貨號(hào)：ab178945）均購自英國Abcam 公司；IκB-α（貨號(hào)：L35A5）、p-IκB-α（貨號(hào)：14D4）均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：IX83，美國Olympus 公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：ELX800，美國Bio-tek 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：HERAcell 150i，美國Thermo Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分子對(duì)接方案

本課題組基于前期研究基礎(chǔ)，并通過查閱與炎癥相關(guān)靶標(biāo)的文獻(xiàn)，篩選出NF-κB、TLR4、Toll 樣受體2（Toll-like receptors 2, TLR2）、胰島素誘導(dǎo)基因2（nsulin inducible gene 2, Insig2）、尼曼匹克C1 型L1（Niemann-Pick C1 like 1, NPC1-L1）、Wnt 信號(hào)蛋白（Wnt），對(duì)目標(biāo)蛋白活性位點(diǎn)進(jìn)行分析（三維結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、PDB 數(shù)據(jù)庫），后應(yīng)用LibDock 模塊（來源于Discovery Studio 3.0）將配體CA 與受體蛋白分子對(duì)接[8]。 選取與CA 對(duì)接吻合度前2 名的蛋白分子，并在BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞在DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%無菌胎牛血清和1%雙抗）置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代，隔日更換培養(yǎng)基。 待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰蛋白酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集（r=8.5 cm，1000 r/min，8～10 min），去除上清液，加入90% FBS+10% DMSO 吹勻后保存于凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 藥物干預(yù)及分組

根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8, CCK-8）檢測結(jié)果計(jì)算細(xì)胞存活率，選取安全用藥范圍內(nèi)濃度20、40、60 μmol/L 作用2 h 后，10 mg/L LPS 作用24 h 進(jìn)行造模。 將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組（細(xì)胞培養(yǎng)液）、模型組（10 mg/L LPS 細(xì)胞培養(yǎng)液）、CA 干預(yù)組（20、40、60 μmol/L CA 細(xì)胞培養(yǎng)液作用2 h+10 mg/L LPS 細(xì)胞培養(yǎng)液）。

2.4 藥物處理

當(dāng)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，預(yù)先用不同濃度的CA 處理細(xì)胞2 h，再加入400 ng/mL 的LPS 刺激24 h，收集細(xì)胞上清液或提取細(xì)胞蛋白作為檢測樣本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆為此藥物處理方案。

2.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔8×103細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，次日按“2.4”項(xiàng)方法處理后，棄去上清液， 每孔重新加入含10% CCK-8 的DMEM培養(yǎng)基，孵育1 h 后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

2.6 ELISA 法檢測細(xì)胞TNF-α、IL-1β 水平

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔8×103細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，次日按“2.4”項(xiàng)方法處理后收集細(xì)胞上清液，離心去除細(xì)胞碎片后將上清液作為檢測樣本，按照試劑盒說明書采用ELISA 法檢測TNF-α 和IL-1β 水平。

2.7 Griess 法檢測細(xì)胞NO 水平

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔8×103細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，次日按“2.4”項(xiàng)方法處理后收集細(xì)胞上清液，離心去除細(xì)胞碎片后將上清液作為檢測樣本，按照試劑盒說明書采用Griess 法測定NO 濃度。

2.8 Western blot 檢測NF-κB 通路及TLR-4/MYD88通路表達(dá)

取各組實(shí)驗(yàn)處理后細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗3次，加入RIPA 裂解液和PMSF 的混合液100 μL（比例為100∶1）置于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刮下蛋白，4 ℃離心（r=8.5 cm，1 2000 r/min，15 min），收集上清液。 BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。 每個(gè)樣品取30 μg 并加入5×SDS 凝膠上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，使其變性。 配制5%濃縮膠、8%分離膠，進(jìn)行電泳分離（濃縮膠80 V，分離膠120 V），0.22 μm PVDF 膜200 mA 濕轉(zhuǎn)120 min，5%脫脂牛奶慢搖封閉1 h，加入一抗NF-κB p65（1∶1000）、IκB-α（1∶1000）、p-IκB-α （1∶1000）、p-NF-κB p65 （1∶2000）、TLR-4（1∶1000）、MYD88（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗5 次，每次5 min，按1∶5000 的比例加入稀釋過的二抗室溫孵育1 h，然后用TBST 洗膜5次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光顯影法進(jìn)行顯影，結(jié)果用Image J 測量灰度值，以目的蛋白與β-actin 的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 以及SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，兩組樣本均數(shù)間比較采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組之間比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CA 結(jié)構(gòu)以及分子對(duì)接結(jié)果

通過CA 結(jié)構(gòu)式可以看出，乙酰水楊酸與姜黃素通過酯健結(jié)合形成CA（圖1）。 如表1 所示，在蛋白對(duì)接結(jié)果中，NF-κB 和TLR4 與CA 的對(duì)接吻合度值高達(dá)99.58%和92.71%，而其他幾個(gè)蛋白與CA對(duì)接吻合度值相對(duì)較低，故之后的研究僅針對(duì)吻合度高的NF-κB 和TLR4 在BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 CA 與受體蛋白對(duì)接結(jié)果

圖1 CA 與炎癥通路相互作用分子對(duì)接分析

3.2 不同濃度CA 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

經(jīng)不同濃度CA 干預(yù)24 h 后，在0～80 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，CA 沒有顯示明顯的細(xì)胞毒性，當(dāng)CA濃度大于80 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活性受到抑制（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 CA 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響（±s，n=3）

3.3 各組IL-1β、TNF-α、NO 表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，LPS 刺激后的細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α 和NO 水平明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預(yù)組上清液中的TNF-α、IL-1β、NO炎癥分子水平下降（P＜0.05）。在CA 濃度為60 μmol/L時(shí)，CA 對(duì)IL-1β 對(duì)抑制率達(dá)74.89%、對(duì)TNF-α 抑制率達(dá)56.73%、對(duì)NO 抑制率達(dá)72.64%。 說明CA 能夠抑制LPS 所引起的炎癥因子的上調(diào)。 詳見圖3。

圖3 不同濃度CA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α、NO 水平的影響（±s，n=3）

3.4 各組NF-κB、TLR4 的蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比， 模型組p-NF-κB p65 與NF-κB p65 蛋白表達(dá)量比值以及p-NF-κB p65 蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預(yù)組p-NFκB p65 與NF-κB p65 蛋白表達(dá)量比值明顯降低（P＜0.05），p-IκB-α 蛋白含量明顯下降（P＜0.01）。 與對(duì)照組相比，模型組的TLR4 和MYD88 表達(dá)量都有明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預(yù)組TLR4蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。 詳見圖4、圖5。

圖4 不同濃度CA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞NF-κB/IκB-α 表達(dá)及其磷酸化的影響（±s，n=3）

圖5 不同濃度CA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞TLR-4、MYD88 的影響（±s，n=3）

4 討論

適度的炎癥反應(yīng)可以幫助大腦維持穩(wěn)態(tài)，保護(hù)神經(jīng)元功能，而過度的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要病理特征，例如帕金森綜合征、抑郁癥等[9]，且主要由膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)[10]，持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)釋放出大量的炎癥因子，損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致一系列病理變化。 所以，針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控神經(jīng)炎癥達(dá)到治療腦部疾病的治療方案研究具有廣闊的發(fā)展前景。

姜黃素是姜黃的主要成分，已被證實(shí)其藥理作用包括抗炎、調(diào)脂等[11]。盡管已有文章表明姜黃素對(duì)于抑郁癥患者具有一定療效[12]，但是其臨床應(yīng)用并不廣泛的一個(gè)重要原因是其生物利用度低[13-14]。 而姜黃素的酯化物在提高生物利用度的同時(shí)，也可以達(dá)到抗炎、調(diào)脂等一系列效果[15]。乙酰水楊酸已被證實(shí)具有良好的抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等藥理作用，但是其缺點(diǎn)在于體內(nèi)代謝速度快，因此，為了更好地提高兩種物質(zhì)的療效，我們將其合成CA，也達(dá)到了比較可觀的合成率[16]。

LPS 可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞并觸發(fā)促炎信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]，在小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)時(shí)，這些介質(zhì)也受NF-κB 的調(diào)節(jié)，NF-κB 是炎癥的中央調(diào)節(jié)因子，它控制趨化因子、細(xì)胞因子、促炎酶、黏附分子和促炎轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄[18-19]。 而Toll 樣受體是與病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated m olecular patterns, PAMPs） 識(shí)別有關(guān)的關(guān)鍵模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs），可以識(shí)別多種病原體，并通過激活NF-κB 和其他引起促炎分子合成的轉(zhuǎn)錄因子來啟動(dòng)促炎免疫應(yīng)答[20]。 在我們前期的分子對(duì)接結(jié)果中，CA 與NF-κB 以及TLRs 皆具有比較高吻合度的對(duì)接結(jié)果，基于此結(jié)果，我們對(duì)CA 抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的初步機(jī)制做了簡單的探索。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CA對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用較小，可以降低細(xì)胞炎癥因子水平，其機(jī)制可能與抑制NF-κB 的磷酸化、減少IκB-α 的磷酸化降解以及TLR4 通路的激活有關(guān)。 本課題組前期針對(duì)CA 調(diào)脂、抗炎的效果已發(fā)表相關(guān)論文[7]，本文首次提出將CA 運(yùn)用到體外神經(jīng)炎癥模型當(dāng)中，并且在此研究中也證實(shí)其具有良好的抗炎效果，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能具有較好的療效。

本研究應(yīng)用體外LPS 誘導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，觀察了CA 的抗炎作用，并證實(shí)了CA 可以通過抑制NF-κB/TLR4 通路減少炎癥介質(zhì)的釋放從而降低細(xì)胞炎癥水平，CA 抗BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥作用機(jī)制如圖6 所示，但其更深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖6 模式示意圖