王志輝，周新茹，成惠珍，王 智，童巧珍，周日寶，3*，劉湘丹，3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室，湖南 長沙 410208；3.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confusa DC.）、黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花[1]。 山銀花具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，含有有機(jī)酸、黃酮類和皂苷類等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化、抑菌、保肝和抗炎等多種生理活性[2]，其中抗氧化和抑菌是山銀花的主要現(xiàn)代藥理作用，用于治療癰腫瘡毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等癥，是銀翹解毒片、銀花口服液、維C 銀翹片等多種中成藥的主要原料[3-6]。近年來，山銀花還廣泛應(yīng)用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸藥等方面，市場前景廣闊?；覛置潭?010 版《中華人民共和國藥典》首次收藏在山銀花項(xiàng)下[7]，是湖南省山銀花藥材種植的主要品種，湖南山銀花年產(chǎn)量已達(dá)1.5 萬噸，占全國山銀花總產(chǎn)量的75%。但目前對山銀花的研究大多集中在藥效成分和藥理作用方面，缺乏針對其多靶點(diǎn)藥效作用的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[8-10]，這在很大程度上制約了湖南省山銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2009 年，肖小河研究員在中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會提出了中藥“大質(zhì)量觀”概念，強(qiáng)調(diào)生物評價(jià)在中藥質(zhì)量評價(jià)方面的重要性[11]。 2016 年，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物的新概念，針對中藥的生物屬性、制造過程等自身醫(yī)藥體系的特點(diǎn)，中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以體現(xiàn)藥效的物質(zhì)成分為基礎(chǔ)，從而更科學(xué)地反映藥材內(nèi)在質(zhì)量的差別[12]。因此，藥效評價(jià)將成為更科學(xué)、更前沿的中藥材質(zhì)量評價(jià)方法[13]。

高效液相指紋圖譜克服了用單一指標(biāo)評價(jià)質(zhì)量的局限性，實(shí)現(xiàn)了較全面的化學(xué)組分分析，是目前最常用的質(zhì)量控制方法之一[14-16]，本文擬建立湘產(chǎn)山銀花指紋圖譜和抗氧化、抑菌藥效評價(jià)體系，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法、偏最小二乘回歸分析和雙變量相關(guān)分析等多元統(tǒng)計(jì)方法[17-18]分析湘產(chǎn)山銀花發(fā)揮抗氧化和抑菌藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為山銀花的臨床用藥、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 供試材料

山銀花樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的干燥花蕾，共20 份。 具體樣品信息見表1。

表1 山銀花樣品信息

1.2 儀器與試劑

Agilent 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，Agilent Technologies 1260 Infinity, G1314F紫外檢測器，G1239B 自動進(jìn)樣器）；色譜柱(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm, 5-Micron)；數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司，型號：SB25-12DT）；超純水機(jī)（山東京申分析儀器有限公司，UPA-20）；紫外分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司，722SP）；生化培養(yǎng)箱（青島景弘環(huán)保科技有限公司，型號：JH-100A）；高速萬能粉碎機(jī)（型號：FW-100，北京科偉永興儀器有限公司）；分析天平（型號：PL203，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)烘干箱（型號：DH-420AB，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

綠原酸（批號：18071907）、新綠原酸（批號：19081403）、木犀草苷（批號：20060301）、灰氈毛忍冬皂苷乙（批號：20072203）、川續(xù)斷皂苷乙（批號：19120601）、灰氈毛忍冬皂苷甲（批號：18120403）、咖啡酸（批號：20110501）、異綠原酸A（批號：21032304）、異綠原酸B（批號：21022308）純度均≥98%，均購自成都普非德生物技術(shù)有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003（北京索萊寶科技有限公司）；乙腈、磷酸、甲醇均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 指紋圖譜

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密吸取綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、木犀草苷、咖啡酸、灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、獐牙菜苷，分別置于10 個5 mL 量瓶中，以70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各系列混合對照品溶液：綠原酸(1.830 mg/mL）、新綠原酸(0.012 mg/mL)、異綠原酸A (1.050 mg/mL)、異綠原酸B(0.108 mg/mL)、木犀草苷(0.049 mg/mL)、咖啡酸(0.120 mg/mL)、灰氈毛忍冬皂苷甲(0.300 mg/mL)、灰氈毛忍冬皂苷乙(0.500 mg/mL)、川續(xù)斷皂苷乙(1.900 mg/mL)、獐芽菜苷(1.060 mg/mL)。

2.1.2 供試品溶液的制備 取灰氈毛忍冬粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密封，稱定重量，靜置12 h，超聲處理30 min (20 ℃，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 以乙腈為流動相A，0.4%磷酸水為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，10% A； 15～17 min，10%～12% A；17～20 min，12%～15.4% A；20～22 min，15.4%～21.4% A；22～34 min，21.4%～21.8% A; 34～40 min，21.8%～30% A；40～60 min，30% A）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃；檢測波長為210 nm。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6 次，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件測定。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 測定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件測定。

2.1.7 指紋圖譜分析 按照“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備20 批灰氈毛忍冬供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件對樣品依次進(jìn)行檢測，記錄指紋圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）建立20 批灰氈毛忍冬特征圖譜，并進(jìn)行相似度分析。

2.2 體外藥效實(shí)驗(yàn)

2.2.1 抑菌活性試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌菌液20 μL注入平板培養(yǎng)基中，混合均勻，傾注平板20 mL，水平靜置凝固后備用，抑菌用供試溶液同“2.1.2”項(xiàng)制備方法，用已滅菌的鋼管在實(shí)驗(yàn)平板上打孔，往孔中注入50 μL 供試品溶液，以青霉素為陽性對照組，70%甲醇為空白對照組，每組重復(fù)3次，4 ℃預(yù)擴(kuò)散2 h，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)好的平板，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，抑菌效果以抑菌圈直徑大小表示。2.2.2 抗氧化活性測定 精密移取1 mL 供試品溶液與4 mL DPPH 溶液于試管中，搖勻，避光處理30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)i。 同法測得供試品溶液與60%乙醇吸光度值A(chǔ)j、60%乙醇與4 mL DPPH 溶液吸光度值A(chǔ)0。 計(jì)算清除率[1－(Ai－Aj)/A0]。分別測得各樣品的抗氧化活性，以DPPH 清除率表示。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.3.1 譜效關(guān)系分析 采用SPSS 23.0 在線分析軟件對20 批灰氈毛忍冬的18 個指紋圖譜共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)和抑菌率藥效指標(biāo)值進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，研究兩者之間的相關(guān)性。 通過計(jì)算子序列（灰氈毛忍冬各化學(xué)成分）與母序列（抗氧化率和抑菌圈直徑）之間的關(guān)聯(lián)度來確定灰氈毛忍冬提取物各成分對DPPH 清除率和金黃色葡萄球菌的抑制作用影響程度；以共有峰面積為自變量（X），DPPH 清除率、抑菌圈直徑為因變量（Y），采用偏最小二乘法回歸分析對二者進(jìn)行譜效關(guān)系分析。

2.3.2 相關(guān)性分析 采用SPSS 23.0 軟件中雙變量相關(guān)分析處理方法，計(jì)算20 批灰氈毛忍冬提取物的18 個指紋圖譜共有峰的相對峰面積和抑菌率藥效指標(biāo)值的Pearson 相關(guān)系數(shù)。

2.4 含量測定

分別取“2.1.1”項(xiàng)下10 個不同對照品溶液，加甲醇稀釋制得6 個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)建立線性回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6 次，各峰面積RSD 在0.009 5%～0.228 7%之間，說明儀器精密度良好，同一供試品分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣，測定各峰面積RSD 在0.004 0%～0.194 6%之間，表明供試品在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定，同一供試品重復(fù)制備6份，測定各峰面積RSD 在0.003 8%～0.136 5%之間，表明本方法重復(fù)性良好。

3.2 HPLC 指紋圖譜的建立

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）建立20 批山銀花指紋圖譜，結(jié)果見圖1。 選取時(shí)間寬度為0.1 min，以平均數(shù)生成對照圖譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動匹配，確定18 個特征峰作為評價(jià)的變量指標(biāo)（X）。 并用混合對照品（圖2）對特征峰進(jìn)行指認(rèn)，確定1、3、7、8、10、11、12、16、17、18 號峰分別為新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙。

圖1 20 批山銀花指紋圖譜

圖2 混合對照品HPLC 圖譜

3.3 體外藥效結(jié)果

70%甲醇的抑菌圈為直徑0 mm，青霉素的抑菌圈為直徑12.67 mm，灰氈毛忍冬抑菌圈直徑在7.39～11.40 mm 之間， 說明灰氈毛忍冬具有抑菌作用，DPPH 清除率在65.11%～78.1%之間。 詳見表2。

表2 灰氈毛忍冬抗氧化、抑菌效果(±s，n=3)

表2 灰氈毛忍冬抗氧化、抑菌效果(±s，n=3)

樣品編號1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 DPPH 清除率/%67.77±0.02 68.88±0.01 66.81±0.10 67.30±0.03 76.17±0.01 68.88±0.05 69.84±0.12 66.82±0.11 70.54±0.10 73.80±0.13 65.11±0.01 67.58±0.02 65.60±0.03 74.25±0.02 67.73±0.14 76.84±0.05 67.28±0.11 78.52±0.06 71.62±0.09 78.10±0.03抑菌圈直徑/mm 8.58±0.00 8.39±0.02 7.55±0.01 9.19±0.02 9.12±0.03 10.03±0.24 9.54±0.00 7.39±0.02 8.56±0.14 7.88±0.00 8.32±0.00 9.00±0.00 11.40±0.01 10.51±0.00 9.70±0.20 8.24±0.00 10.59±0.18 10.50±0.14 9.84±0.34 9.10±0.00

3.4 山銀花抗氧化、抑菌“譜-效”關(guān)系分析

3.4.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 使用關(guān)聯(lián)度值針對20 個評價(jià)對象進(jìn)行排序；關(guān)聯(lián)度值介于0～1 之間，該值越大代表其與“參考值”（母序列）之間的相關(guān)性越強(qiáng)。從表3 可知：針對本次18 個色譜峰評價(jià)項(xiàng)，抗氧化藥效關(guān)聯(lián)度中有兩個色譜峰關(guān)聯(lián)度大于0.5，其中3 號峰的綜合評價(jià)最高（關(guān)聯(lián)度為0.980），其次是12號峰（關(guān)聯(lián)度為0.699）。抑菌譜效關(guān)聯(lián)度有兩個色譜峰關(guān)聯(lián)度大于0.5，其中3 號峰的綜合評價(jià)最高（關(guān)聯(lián)度為0.764），其次是12 號峰（關(guān)聯(lián)度為0.615）。由此推測綠原酸與異綠原酸A 是抗氧化活性和抑菌的主要活性成分。

表3 體外藥效與色譜圖譜的關(guān)聯(lián)度

3.4.2 PLS 回歸分析 以共有峰面積為自變量（X），DPPH 清除率、抑菌圈直徑為因變量（Y），采用偏最小二乘法回歸分析對二者進(jìn)行譜效關(guān)系分析， 得出自變量X 關(guān)于因變量Y 的回方程。

DPPH清除率（Y）=-2.196×X1+1.013×X2+5.571×X3-0.208×X4-0.262×X5+0.028×X6+0.306×X7+0.118×X8+0.879×X9-2.115×X10+0.566×X11-5.709×X12+0.995×X13+0.776×X14-0.101×X15+0.859×X16-0.205×X17-0.293×X18，由圖2 可知，共有峰2、3、6、7、8、9、11、13、14、16 的回歸系數(shù)為正數(shù)，表明以上成分與抗氧化效果呈正相關(guān)。 其中2 號和3 號峰回歸系數(shù)大于1，說明其與抗氧化效率顯著相關(guān)。

抑菌圈（Y）=-3.907×X1+8.980×X2+23.283×X3-10.041×X4+2.602×X5+0.670×X6+1.510×X7-0.629×X8+2.123×X9-7.516×X10+0.879×X11-38.807×X12+22.171×X13-0.980×X14+0.609×X15-0.386×X16-1.486×X17+1.939×X18，可知，共有峰2、3、5、6、7、9、11、13、15、18 回歸系數(shù)為正數(shù)， 表明以上成分與抑菌效果呈正相關(guān)。其中，2、3、5、7、9、13、18 號峰回歸系數(shù)大于1，說明其與抑菌效果顯著相關(guān)。

3.4.3 色譜峰與藥效雙變量相關(guān)分析 由表4 可知，3 號峰與抗氧化率呈顯著相關(guān)（P＜0.05），4、11 和12 號峰與抑菌效果呈顯著相關(guān)（P＜0.05），其中12號峰呈正相關(guān)，4、11 號峰呈負(fù)相關(guān)。

表4 山銀花特征峰與藥效相關(guān)性及偏最小二乘法回歸系數(shù)

3.5 山銀花抗氧化、抑菌“量-效”關(guān)系分析

3.5.1 山銀花主要化學(xué)成分的含量測定 在指紋圖譜的色譜條件下，測定20 批山銀花中10 種化學(xué)成分的含量，線性關(guān)系及方法學(xué)考察結(jié)果見表5。 由表5可知各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，方法穩(wěn)定可靠。 由表6 可知，山銀花中綠原酸含量為0.863%～7.142%，不同樣品中綠原酸含量差異較大，木犀草苷含量為0.031%～0.092%，灰氈毛忍冬皂苷甲含量為0.007%～0.103%，新綠原酸含量為1.162%～13.516%，咖啡酸含量為0.007%～0.161%，川續(xù)斷皂苷乙含量為0.830%～6.791%，灰氈毛忍冬皂苷乙含量為0.350%～10.750%，異綠原酸A 含量為0.562%～4.963%，異綠原酸B 含量為0.054%～0.201%。

表5 綠原酸等成分線性關(guān)系與方法學(xué)考察

表6 20 批山銀花樣品中綠原酸等成分的含量（%）

3.5.2 山銀花各成分含量與抗氧化、抑菌藥效相關(guān)性分析 由表7 可知，綠原酸與抗氧化藥效呈顯著正相關(guān)，川續(xù)斷皂苷乙和異綠原酸A 與抑菌藥效呈顯著正相關(guān)。

表7 綠原酸等成分含量與藥效的相關(guān)性分析（Pearson 相關(guān)系數(shù)）

4 討論

4.1 指紋圖譜的建立

2020 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定灰氈毛忍冬（山銀花）的質(zhì)控成分為綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙，其中綠原酸檢測波長為330 nm，皂苷使用蒸發(fā)光檢測器。本文通過優(yōu)化洗脫條件，最終確定在紫外檢測器下選擇210 nm 波長，建立比較全面的可同時(shí)反應(yīng)有機(jī)酸、黃酮、皂苷等化學(xué)成分的指紋圖譜。 本次由于山銀花采收時(shí)間的原因，收集的樣品數(shù)量相對較少，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將增加樣品數(shù)量，細(xì)化不同產(chǎn)地、不同加工方法和不同來源等樣品信息，不斷完善山銀花特征圖譜，以期為山銀花全面的質(zhì)量評價(jià)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

4.2 數(shù)據(jù)分析方法的選擇

本文通過灰色關(guān)聯(lián)分析、偏最小二乘回歸分析和雙變量相關(guān)分析進(jìn)行“譜-效”關(guān)聯(lián)分析[19-20]，3 種方法結(jié)果一致，初步篩選出與藥效相關(guān)的基礎(chǔ)物質(zhì)?；疑P(guān)聯(lián)度分析法作為對模糊系統(tǒng)分析的有效手段，是構(gòu)建譜-效關(guān)系的常用方法之一。 偏最小二乘回歸是一種多元統(tǒng)計(jì)回歸建模方法，主要研究的是多自變量對多因變量的回歸建模，能在樣本數(shù)較少情況下建立精度較高的回歸模型。 雙變量相關(guān)分析是研究隨機(jī)變量之間密切程度的一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，Pearson 相關(guān)系數(shù)絕對值越大，兩變量之間的相關(guān)性越強(qiáng)，通過將指紋圖譜共有峰的相對峰面積與抗氧化和抑菌藥效指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，從而得出各色譜峰成分與藥效指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，從而為研究兩者之間的線性相關(guān)密切程度提供依據(jù)。

4.3 質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測

“譜-效”關(guān)系的研究在于揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通過對照品指認(rèn)了部分共有峰成分，并選擇合理的數(shù)據(jù)分析方法來評價(jià)灰氈毛忍冬的化學(xué)成分與藥效之間的相互關(guān)系，采用灰色關(guān)聯(lián)度法和最小偏二乘法回歸分析建立了灰氈毛忍冬抗氧化和抑菌的“譜-效”關(guān)系。 采用相關(guān)性分析計(jì)算共有峰和藥效的相關(guān)系數(shù)，根據(jù)關(guān)聯(lián)度法分析得出綠原酸、異綠原酸A 與抗氧化和抑菌均有很強(qiáng)的相關(guān)性，由偏最小二乘法回歸系數(shù)可知2 號峰和綠原酸與抗氧化效果相關(guān)性強(qiáng)，綠原酸、咖啡酸、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、2 號峰、5 號峰、9 號峰和1 號峰成分與抑菌效果相關(guān)性強(qiáng)，由雙變量相關(guān)性分析可知綠原酸與抗氧化效果顯著相關(guān)，4 號峰成分、異綠原酸B 和異綠原酸A 與抑菌效果顯著相關(guān)。 為進(jìn)一步確定成分-藥效的相關(guān)性，通過測定樣品中綠原酸等10 種成分的含量，與藥效進(jìn)行“量-效”相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)綠原酸與抗氧化藥效顯著相關(guān)，川續(xù)斷皂苷乙和異綠原酸A 與抑菌藥效顯著相關(guān)。 故本研究預(yù)測抗氧化藥效的質(zhì)量標(biāo)志物為綠原酸和異綠原酸等有機(jī)酸類，抑菌藥效的質(zhì)量標(biāo)志物為皂苷和有機(jī)酸類，但還需進(jìn)一步體內(nèi)藥效分析驗(yàn)證。 另外，山銀花還具有抗病毒和抗腫瘤等藥理作用，后續(xù)研究可采用GC-MS、UV 等分析方法建立多元化指紋圖譜，進(jìn)一步挖掘灰氈毛忍冬藥效物質(zhì)，完善“譜-效”關(guān)系，從源頭提升灰氈毛忍冬產(chǎn)品質(zhì)量。