孫賀軍，孔永紅，陳新蕾，張海龍，夏海清

作者單位：1駐馬店市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 駐馬店 463000；

2南陽(yáng)市中心醫(yī)院西藥科，河南 南陽(yáng) 473009

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）參與血栓形成與止血、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)、免疫排斥反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程，VEC 遷移和增殖在組織損傷修復(fù)和血管新生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）具有干細(xì)胞的特性，是血管疾病的重要研究模型［2］。

白細(xì)胞介素8（interleukin 8，IL-8）能夠促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)程，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，在肺腺癌中高表達(dá)，可能促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生與發(fā)展［3］。IL-8 可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)遷移和侵襲［4］，并可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［5］。研究表明，沒(méi)食子酰芍藥苷（6'-O-Galloylpaeoniflorin，GPF）通過(guò)降低激活轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移［6］。ATF2 在宮頸癌中高表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)［7］。本研究通過(guò)Target Scan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATF2可能是miR-212-3p 的靶基因。miR-212-3p 在骨肉瘤中低表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展［8］，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，其也抑制成纖維滑膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡［9］。miR-212-3p和ATF2 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響尚不清楚。

因此，本研究自2019 年6 月至2020 年1 月以HUVECs 為研究對(duì)象，研究GPF 是否通過(guò)miR-212-3p/ATF2 調(diào)控IL-8 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，以期為血管類(lèi)疾病的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株HUVECs 購(gòu)自美國(guó)ATCC；沒(méi)食子酰芍藥苷（GPF）（HPLC≥98%）購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；IL-8、肝素、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（ECGS）、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亞礬（DMSO）和四氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；F-12K 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco 公司；Transwell 板購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；引物、miR-212-3p mimics（miR-212-3p）、miR-212-3p 抑制物（anti-miR-212-3p）、ATF2 干擾物（si-ATF2）和陰性對(duì)照（miR-con、antimiR-con 和si-con）及含有miR-212-3p 結(jié)合位點(diǎn)的ATF2-3’UTR 野生型及突變型報(bào)告基因載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、RNA 提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）和real-time PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ATF2抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體和肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；顯微鏡、發(fā)光儀、酶標(biāo)儀及Real-time PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理 細(xì)胞培養(yǎng)：將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1% 青-鏈霉素、0.1 g/L 肝素和0.05 g/L ECGS 的F-12K 培養(yǎng)基中，在濕度95%、37 ℃且5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代。

藥物處理：將IL-8 和GPF 分別配制并過(guò)濾除菌。根據(jù)文獻(xiàn)［4］用100 μg/L IL-8 處理HUVECs 48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將IL-8 誘導(dǎo)后的HUVECs 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入終濃度為100、200 和400 μmol/L 的GPF，對(duì)照組加入空白培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染或后續(xù)實(shí)驗(yàn)［4，6］。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs 細(xì)胞，以2×l05個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞待細(xì)胞至融合度為80%～90%，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行HUVECs 轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分組：miR-212-3p低表達(dá)組（轉(zhuǎn)染anti-miR-con和anti-miR-212-3p）、miR-212-3p 過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-con 和miR-212-3p）、miR-212-3p 和ATF2 低表達(dá)組（轉(zhuǎn)染anti-miR-212-3p+si-con 和anti-miR-212-3p+si-ATF2）及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（轉(zhuǎn)染miR-con+WT、miR-212-3p+WT、miR-con+MUT和miR-212-3p+MUT）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)RNA 的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染和（或）IL-8及GPF 處理的HUVECs 細(xì)胞，用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，以cDNA 為模板按照realtime PCR 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)合成miR-212-3p 和AFT2 mRNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃35 s、72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。運(yùn)用Bio-Rad PCR系統(tǒng)，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集轉(zhuǎn)染或IL-8處理后的HUVECs 細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞并稀釋?zhuān)?×103個(gè)/孔接種于96 微孔板中，培養(yǎng)液中加入GPF（終濃度分別為100、200 和400μmol/L），對(duì)照NC 組中添加等體積的空白培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)至48 h 時(shí)進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 吸光度（A）值。存活率=（A 對(duì)照NC 組-A 實(shí)驗(yàn)組）/A 對(duì)照NC 組×100%。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染或處理后的各組HUVECs 細(xì)胞，消化細(xì)胞，用含無(wú)血清F-12K 培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為2×105個(gè)/毫升。24 孔Transwell 下層小室加入500 μL 含10%FBS 的F-12K 培養(yǎng)基，上層小室中加入100 μL細(xì)胞同時(shí)加入實(shí)驗(yàn)濃度的GPF，對(duì)照中加入等體積的空白培養(yǎng)液，將上層小室放入下層小室中，培養(yǎng)24 h，取出上層小室，棄培養(yǎng)液，洗滌2 遍，用棉簽拭去基質(zhì)膠和上層小室未遷移的細(xì)胞，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取均值。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)方法“1.2.2”在HUVECs 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-212-3p 和ATF2 野生型（WT）及突變型（MUT）報(bào)告基因載體（含有miR-212-3p 結(jié)合位點(diǎn)），轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，室溫裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染和（或）IL-8 處理48 h 及GPF 處理48 h 的各組HUVECs 細(xì)胞，室溫裂解并超聲冰浴破碎細(xì)胞，離心收集蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)濃度。然后進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)PVDF 膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，抗ATF2 抗體（1∶2 000）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體（1∶1 000）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體（1∶2 000）和抗β-actin 抗體（1∶4 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜2次，然后加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s 描述。兩組間的比較為成組t 檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)。多組間的比較為單因素方差分析+兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度GPF抑制IL-8誘導(dǎo)的HUVECs增殖和遷移 結(jié)果表明，與對(duì)照0 μmol/L 組相比，GPF 100 μmol/L 組、200 μmol/L 組和400 μmol/L 組HUVECs 中PCNA 和MMP2 蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率和遷移細(xì)胞數(shù)均下降（P＜0.05），且均呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)趨勢(shì)，見(jiàn)表1。說(shuō)明GPF 可抑制HUVECs 的增殖和遷移。

表1 不同濃度沒(méi)食子酰芍藥苷（GPF）抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖和遷移/±s

表1 不同濃度沒(méi)食子酰芍藥苷（GPF）抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖和遷移/±s

注：PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與0μmol/L細(xì)胞組比較，P＜0.05。

GPF 0μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L F值P值遷移細(xì)胞數(shù)256.26±15.66 189.23±18.91①120.72±12.11①88.09±8.91①229.95＜0.001重復(fù)次數(shù)9999 PCNA 1.00±0.10 0.85±0.09①0.62±0.07①0.32±0.05①118.33＜0.001 MMP2 1.20±0.12 1.00±0.11①0.75±0.08①0.40±0.05①123.41＜0.001細(xì)胞存活率/%100.05±10.23 90.46±9.11①72.49±7.25①45.16±4.51①79.67＜0.001

2.2 不同濃度GPF對(duì)HUVECs細(xì)胞中miR-212-3p和ATF2 表達(dá)的影響 與0μmol/L 組相比，GPF 100μmol/L 組、200 μmol/L 組和400 μmol/L 組HUVECs細(xì)胞中miR-212-3p的表達(dá)量上升（P＜0.05），ATF2的mRNA 和蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)，見(jiàn)表2。說(shuō)明GPF 可以促進(jìn)HUVECs 細(xì)胞中miR-212-3p 表達(dá)，抑制ATF2 表達(dá)，且劑量越高效果越好。據(jù)此選擇GPF 濃度400 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同濃度GPF對(duì)HUVECs中miR-212-3p和激活轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）mRNA及蛋白表達(dá)的影響/±s

表2 不同濃度GPF對(duì)HUVECs中miR-212-3p和激活轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）mRNA及蛋白表達(dá)的影響/±s

注：①與0μmol/L細(xì)胞組比較，P＜0.05。

GPF 0μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)ATF2 protein 1.00±0.10 0.85±0.08①0.60±0.06①0.25±0.03①173.04＜0.001 9999 miR-212-3p 0.16±0.03 0.50±0.05①1.00±0.10①1.56±0.17①320.84＜0.001 ATF2 mRNA 2.05±0.20 1.55±0.15①0.92±0.09①0.41±0.05①229.51＜0.001

2.3 低表達(dá)miR-212-3p 消減400 μmol/L GPF 對(duì)HUVECs 增殖和遷移的影響 與GPF+anti-miR-con組相比，GPF+anti-miR-212-3p 組HUVECs 中miR-212-3p表達(dá)量降低（P＜0.05），PCNA 和MMP2表達(dá)升高（P＜0.05），細(xì)胞存活率上升（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)上升（P＜0.05），見(jiàn)表3。說(shuō)明低表達(dá)miR-212-3p 可消減400μmol/L GPF對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。

表3 低表達(dá)miR-212-3p對(duì)GPF處理的HUVECs增殖和遷移的影響/±s

表3 低表達(dá)miR-212-3p對(duì)GPF處理的HUVECs增殖和遷移的影響/±s

注：PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與GPF+anti-miR-con組比較，P＜0.05。

組別GPF+anti-miR-con GPF+anti-miR-212-3p GPF+NC F值P值遷移細(xì)胞數(shù)78.09±7.91 198.24±19.83①80.11±8.01 245.75＜0.001重復(fù)次數(shù)999 miR-212-3p 1.60±0.16 0.60±0.06①1.65±0.18 162.06＜0.001 PCNA 0.35±0.05 1.05±0.10①0.30±0.05 307.94＜0.001 MMP2 0.40±0.05 1.10±0.11①0.35±0.04 252.02＜0.001細(xì)胞存活率/%102.44±10.20 144.03±14.41①100.11±10.03 51.32＜0.001

2.4 高表達(dá)ATF2 消減400 μmol/L GPF 對(duì)HU-VECs增殖和遷移的影響 與GPF+pcDNA-con組相比，GPF+pcDNA-ATF2 組HUVECs 中ATF2、PCNA和MMP2表達(dá)均升高（P＜0.05），細(xì)胞存活率提高（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)上升（P＜0.05），見(jiàn)表4。說(shuō)明高表達(dá)ATF2 可消減400 μmol/L GPF 對(duì)HUVECs 細(xì)胞增殖和遷移的作用。

表4 高表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）消減400μmol/L GPF對(duì)HUVECs增殖和遷移的影響/±s

表4 高表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）消減400μmol/L GPF對(duì)HUVECs增殖和遷移的影響/±s

注：PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與GPF+pcDNA-con比較，P＜0.05。

組別GPF+pcDNA-con GPF+pcDNA-ATF2 GPF+NC F值P值遷移細(xì)胞數(shù)79.11±8.01 163.10±16.31①84.11±8.82 146.91＜0.001重復(fù)次數(shù)999 ATF2 0.22±0.02 0.88±0.11①0.25±0.03 279.87＜0.001 PCNA 0.35±0.06 1.13±0.12①0.33±0.05 274.13＜0.001 MMP2 0.39±0.05 1.03±0.11①0.37±0.05 222.53＜0.001細(xì)胞存活率/%103.48±10.35 161.11±16.10①100.38±10.04 67.62＜0.001

2.5 miR-212-3p 靶向ATF2，調(diào)控ATF2 的表達(dá)通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATF2的3’-UTR序列中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的序列，見(jiàn)圖1。

圖1 通過(guò)TargetScan對(duì)miR-212-3p和ATF2結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果見(jiàn)表5，與miR-con 組相比，過(guò)表達(dá)miR-212-3p組ATF2野生型WT的熒光素酶相對(duì)活性下降（P＜0.05）；而ATF2 突變型MUT的熒光素酶相對(duì)活性沒(méi)有變化。Western blotting 結(jié)果表明，與miR-con組（1.00±0.10）相比，過(guò)表達(dá)miR-212-3p 可使ATF2 蛋白表達(dá)量（0.30±0.03）下降（P＜0.05）；與anti-miR-con組（1.02±0.10）相比，抑制miR-212-3p 表達(dá)可使ATF2 表達(dá)量（1.60±0.16）上升（F=219.045，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ATF2蛋白表達(dá)

表5 miR-con或miR-212-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)/±s

表5 miR-con或miR-212-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)/±s

組別miR-con miR-212-3p t值P值重復(fù)次數(shù)99熒光素酶活性WT 1.00±0.10 0.30±0.03 20.11＜0.001 MUT 1.00±0.10 1.01±0.10 0.21 0.835

2.6 低表達(dá)ATF2 可以部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-212-3p 對(duì)GPF 處理的HUVECs 增殖、遷移的影響 為了確認(rèn)miR-212-3p 是否通過(guò)ATF2 對(duì)GPF 處理的HUVECs 細(xì)胞的增殖和遷移產(chǎn)生影響，在低表達(dá)miR-212-3p 的同時(shí)低表達(dá)ATF2。結(jié)果顯示，抑制miR-212-3p 可促進(jìn)GPF（400 μmol/L）處理的HUVECs 細(xì)胞中ATF2、PCNA 和MMP2 蛋白表達(dá)（P＜0.05），細(xì)胞存活率和遷移細(xì)胞數(shù)均上升（P＜0.05）；與GPF+anti-miR-212-3p+si-con 組相比，GPF+antimiR-212-3p+si-ATF2 組的HUVECs 細(xì)胞ATF2、PCNA和MMP2蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05），細(xì)胞存活率和遷移細(xì)胞數(shù)均下降（P＜0.05）。說(shuō)明低表達(dá)ATF2 可部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-212-3p 對(duì)GPF 處理的HUVECs細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。見(jiàn)表6。

表6 ATF2低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-212-3p對(duì)GPF處理的HUVECs增殖、遷移的影響/±s

表6 ATF2低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-212-3p對(duì)GPF處理的HUVECs增殖、遷移的影響/±s

注：ATF2為激活轉(zhuǎn)錄因子2，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與GPF+anti-miR-con組比較P＜0.05。②與GPF+anti-miR-212-3p+si-con組比較，P＜0.05。

組別GPF+anti-miR-con GPF+anti-miR-212-3p GPF+anti-miR-212-3p+si-con GPF+anti-miR-212-3p+si-ATF2 F值P值細(xì)胞遷移數(shù)78.09±7.91 198.24±19.83①200.04±20.05 120.79±12.14②129.57＜0.001重復(fù)次數(shù)9999 ATF2 0.20±0.10 0.80±0.08①0.82±0.08 0.35±0.09②115.60＜0.001 PCNA 0.32±0.05 1.00±0.10①1.02±0.10 0.55±0.05②171.49＜0.001 MMP2 0.38±0.05 1.05±0.10①1.10±0.10 0.48±0.05②202.69＜0.001細(xì)胞存活率/%）102.44±10.20 144.03±14.41①145.02±14.51 112.25±11.22②26.50＜0.001

3 討論

白細(xì)胞介素8（IL-8）是趨化因子家族的一員，可直接提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、調(diào)節(jié)血管生成［10］并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移［11］。本研究采用IL-8誘導(dǎo)HUVECs 增殖和遷移，然后用GPF 處理誘導(dǎo)的HUVECs，檢測(cè)沒(méi)食子酰芍藥苷（GPF）對(duì)HUVECs 細(xì)胞增殖和遷移的作用，以期為血管疾病的治療提供新的方向。

沒(méi)食子酰芍藥苷（GPF）是白芍的化學(xué)成分之一［12］，具有的抗氧化能力，可保護(hù)人角質(zhì)形成細(xì)胞免受氧化應(yīng)激［13］和紫外線B 輻射［14］誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并可通過(guò)激活PI3K/Akt/Nrf2 通路減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡［15］。研究表明，GPF 可通過(guò)AMPK/miR-299-5p/ATF2 途徑調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡［6］。GPF 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用尚不清楚。本研究通過(guò)用不同濃度的GPF 處理經(jīng)IL-8 誘導(dǎo)的HUVECs 發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L、200 μmol/L 和400 μmol/L 的GPF 可抑制IL-8 誘導(dǎo)的HUVECs 增殖和遷移，促進(jìn)miR-212-3p 表達(dá)，抑制ATF2 表達(dá)，呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)，400μmol/L GPF 效果最好，說(shuō)明GPF 可抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖。但具體機(jī)制尚不清楚。根據(jù)溫中梅［6］研究結(jié)果表明GPF 通過(guò)調(diào)節(jié)ATF2 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，由此假設(shè)GPF 也可能通過(guò)ATF2 調(diào)控HUVECs 增殖和遷移，本研究通過(guò)Tar-getScan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATF2 的3’UTR 區(qū)含有與miR-212-3p 互補(bǔ)的區(qū)域，可能是miR-212-3p 的靶基因，因此假設(shè)GPF 可通過(guò)miR-212-3p/ATF2 調(diào)控IL-8 誘導(dǎo)的HUVECs增殖和遷移。miR-212-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［16］、肝細(xì)胞癌［17］和骨肉瘤［18］中表達(dá)異常，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖有關(guān)。激活轉(zhuǎn)錄因子（ATF2）基因編碼一種對(duì)正常細(xì)胞發(fā)育和生存至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，還在DNA 損傷反應(yīng)中發(fā)揮作用［19］，并可與JUN 形成JUN-ATF2 二聚體促進(jìn)腫瘤發(fā)生［20］。ATF2 在H2O2誘導(dǎo)24 h 的HUVECs 中表達(dá)下調(diào)［21］，ATF2的激活與HUVECs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生有關(guān)［22］，具體機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，GPF 可促進(jìn)IL-8 誘導(dǎo)的HUVECs中miR-212-3p的表達(dá)，抑制ATF2表達(dá)，在400μmol/L濃度內(nèi)，具有劑量依賴(lài)性，低表達(dá)miR-212-3p可逆轉(zhuǎn)400μmol/L GPF對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用；通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western blotting 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-212-3p 靶向ATF2 并調(diào)控ATF2的表達(dá)，低表達(dá)ATF2 可部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-212-3p 對(duì)GPF 處理及IL-8 誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞增殖和遷移的作用，GPF 通過(guò)miR-212-3p/ATF2 途徑調(diào)控IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，在HUVECs 細(xì)胞中，GPF 通過(guò)上調(diào)miR-212-3p 靶向抑制ATF2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖和遷移。GPF在血管新生方面具有重要作用，對(duì)血管類(lèi)疾病的研究具有指導(dǎo)意義。