袁君，王曉娟，王春，黃慶，周淑萍，徐禮五

作者單位：1安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 淮南 232000；

2安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，安徽 合肥 230000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因未明，以滑膜炎癥為主要特點的自身免疫性疾病。RA 除了侵犯關(guān)節(jié)滑膜導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕破壞外，隨著病程的延長，還會出現(xiàn)風(fēng)濕心臟病、代謝綜合征等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量［1］。研究發(fā)現(xiàn)RA 病人多伴有血糖代謝異常和胰島素抵抗等現(xiàn)象［2］。血糖代謝異常作為獨立誘因，不僅刺激免疫細(xì)胞異?；罨?，加重免疫系統(tǒng)紊亂，同時還能直接損傷機(jī)體多個靶器官，與炎癥反應(yīng)等因素共同誘導(dǎo)并發(fā)癥的發(fā)生［2-3］。因此維持糖代謝穩(wěn)定對于延緩RA 疾病進(jìn)程具有積極的意義。

白芍總苷（total glucosides of paeonia ，TGP）是從白芍根部提取的有效成分，臨床上主要用于治療RA 等自身免疫性疾?。?］。TGP 具有抗炎免疫調(diào)節(jié)活性，能有效改善RA 病人的關(guān)節(jié)功能，降低血沉、類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白等多種實驗室指標(biāo)［4］。TGP抗炎免疫調(diào)節(jié)作用主要機(jī)制包括抑制免疫細(xì)胞過度活化，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，恢復(fù)炎癥相關(guān)的G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路至生理水平［5］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)［6］TGP 主要活性成分芍藥苷對糖尿病大鼠具有保護(hù)作用，可降低大鼠空腹血糖，改善胰島素抵抗現(xiàn)象。臨床研究也發(fā)現(xiàn)TGP 聯(lián)合硫酸羥氯喹治療RA 合并糖尿病病人能有效降低血糖、血脂水平［7］。

本研究于2021 年1—5 月通過考察TGP 治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠血糖、血清胰島素、糖化血紅蛋白、肝糖原和肌糖原等水平的影響，初步探討TGP 對CIA 大鼠血糖和葡萄糖轉(zhuǎn)運體的影響，為TGP 用于治療RA 合并糖代謝紊亂提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 TGP（寧波立華制藥有限公司，批號H20055058），規(guī)格0.3 克/粒，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解；甲氨蝶呤（methotrexate ，MTX）（上海信誼藥廠有限公司，批號H31020644），規(guī)格0.25克/片；卡介苗（BCG）及雞Ⅱ型膠原（CCⅡ）為美國Sigma 公司；GLUT4 抗體（批次ab33780）；GLUT2抗體（批次ab85715）；胰島素檢測試劑盒（南京建成生物有限公司，批次20180706，規(guī)格48T）；糖化血紅蛋白檢測試劑盒（南京建成生物有限公司，批次20180524，規(guī)格48T）。

1.2 實驗動物 Wistar 大鼠，雄性，體質(zhì)量（180±20）g；購于北京維通利華有限公司，許可證SCXK（京）2016-0006。在恒溫（24±2）℃、光照周期12 h∶12 h環(huán)境中飼養(yǎng)1周后實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIA大鼠模型制備與評價 將BCG放置于水浴鍋中80 ℃水浴1 h 后，與無菌液體石蠟充分研磨呈乳白狀，配制成濃度是4 g/L的弗氏完全佐劑。將CCⅡ溶解在0.1 mol/L 乙酸中，并用等體積的弗氏完全佐劑乳化，使其終濃度為2 g/L，然后在4 ℃下孵育過夜。實驗造模大鼠60只，在大鼠的右后足跖和尾根部進(jìn)行皮下注射各0.1 mL 混合溶液，以誘導(dǎo)CIA模型，正常組的大鼠用同樣方法注射溶媒，記為第0天（D0）并在D7 在尾根部再次進(jìn)行加強(qiáng)注射。致炎后D14 測量大鼠的足爪容積和空腹血糖，選取關(guān)節(jié)明顯腫脹且血糖濃度較高的大鼠18只，重新采用隨機(jī)數(shù)字表法分組（每組6 只）進(jìn)行后續(xù)給藥，TGP 組大鼠每天按照50 mg/kg，MTX 組每3 天按照0.5 mg/kg，模型組大鼠給予等量的溶媒。各給藥組在大鼠致炎后D14至D30連續(xù)灌胃給藥。

1.3.2 血糖水平 初次免疫前，及免疫后D14 和D30，大鼠空腹眼內(nèi)靜脈層取血0.4 mL，采用羅氏血糖儀（ACCU-CHEK，上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）監(jiān)測血糖水平。

1.3.3 血清胰島素和糖化血紅蛋白水平 末次給藥后24 h，大鼠空腹眼內(nèi)靜脈層取血0.4 mL，于室溫下靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min 分離出血清，分別采用糖化血紅蛋白試劑盒和胰島素試劑盒對各組大鼠血清胰島素和糖化血紅蛋白水平進(jìn)行檢測，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.4 肝糖原和肌糖原水平 末次給藥后24 h，處死實驗動物，解剖并分離出肝臟及后腿肌肉樣本。生物樣本中糖原含量水平采用試劑盒檢測（南京建成生物工程研究所）。參照說明書將組織樣本用生理鹽水進(jìn)行漂洗，然后用濾紙吸干多余的水分。各樣本準(zhǔn)確稱取100 mg，與堿液混合后，沸水中煮20 min 后冷卻。將稀釋制備的肝糖原檢測液和肌糖原檢測液與樣本進(jìn)行混合，在620 nm 處比色定量測定。

1.3.5 葡萄糖轉(zhuǎn)運體水平 末次給藥后24 h，處死動物，解剖并分離出肝臟及后腿肌肉樣本。剪碎組織后加入裂解液進(jìn)行勻漿，冰上研磨30 min，采用蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司）對組織蛋白進(jìn)行定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，以5%牛血清白蛋白對膜進(jìn)行封閉2 h。加葡萄糖轉(zhuǎn)運體-2（GLUT2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4（GLUT4）的一抗抗體（英國Abcam 公司），4 ℃孵育過夜；洗滌后加二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），37 ℃孵育1 h；顯影液顯影，條帶灰度值采用Image-J軟件進(jìn)行分析處理。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的比值表示相對蛋白表達(dá)量。

1.3.6 關(guān)節(jié)組織病理學(xué) 末次給藥后24 h，股動脈放血處死各組大鼠，浸泡于0.1%新潔兒滅溶液中10 min，用4%甲醛溶液固定取下大鼠的繼發(fā)側(cè)踝關(guān)節(jié)，常規(guī)方法石蠟包埋、切片和HE 染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠繼發(fā)側(cè)踝關(guān)節(jié)病理，從滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、軟骨侵蝕和血管翳形成等方面進(jìn)行定量評價［8］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGP 對CIA 大鼠足爪腫脹的影響 由表1 可知，大鼠致炎后D14足爪明顯腫脹，約在致炎后D26腫脹達(dá)到峰值，隨后腫脹逐漸自行緩解。與模型組大鼠相比，TGP 和MTX 治療給藥能夠明顯抑制大鼠非致炎側(cè)足爪腫脹。

表1 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠非致炎側(cè)足爪腫脹的影響/（mL，±s）

表1 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠非致炎側(cè)足爪腫脹的影響/（mL，±s）

注：①與正常組相比較，P＜0.01。②與模型組相比較，P＜0.01。

組別正常組模型組TGP組MTX組F值P值第30天1.36±0.04 1.88±0.05①1.75±0.08②1.61±0.07②87.72＜0.001鼠數(shù)6666第0天1.33±0.04 1.33±0.05 1.32±0.04 1.34±0.05 0.04 0.990第14天1.34±0.05 1.51±0.02①1.55±0.04 1.57±0.03 30.67＜0.001第18天1.37±0.04 1.71±0.03①1.66±0.04 1.59±0.05②55.26＜0.001第22天1.38±0.04 1.96±0.10①1.81±0.05②1.74±0.05②48.96＜0.001第26天1.33±0.05 1.99±0.06①1.86±0.02②1.76±0.12②48.06＜0.001

2.2 TGP 對CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)結(jié)果如圖1所示。正常組大鼠關(guān)節(jié)面光滑完整，關(guān)節(jié)間隙均勻，軟骨外側(cè)可見少量排列整齊的滑膜細(xì)胞。模型組大鼠關(guān)節(jié)間隙不均一，關(guān)節(jié)面中可見增生為多層、排列紊亂的滑膜細(xì)胞，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，明顯的軟骨侵蝕及局部炎癥。與模型組相比較，TGP 和MTX 治療給藥能夠顯著抑制滑膜層滑膜細(xì)胞增生，減少炎性細(xì)胞浸潤，同時在一定程度上能夠改善軟骨侵蝕。模型組，TGP 和MTX 組大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分依次（12.5±1.2）、（7.5±0.8）、（6.3±0.8）。與模型組大鼠相比，TGP 和MTX 治療給藥能顯著降低大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分（F=36.69，P＜0.001）。

2.3 TGP 治療給藥對CIA 大鼠血糖的調(diào)控作用結(jié)果如表2 所示，致炎前各組大鼠空腹血糖濃度差異無顯著性；致炎后D14，模型組大鼠空腹血糖濃度明顯高于正常組大鼠。與模型組大鼠相比，TGP 治療給藥能夠顯著降低大鼠的血糖濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠血糖濃度的影響/（mmol/L，±s）

表2 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠血糖濃度的影響/（mmol/L，±s）

注：①與正常組相比較，P＜0.01。②與模型組相比較，P＜0.01。

組別正常組模型組TGP組F值P值第30天6.66±0.32 12.92±1.98①9.97±1.13②20.54＜0.001鼠數(shù)666第0天6.52±0.48 6.70±0.33 6.82±0.45 0.45 0.648第14天6.71±0.34 9.20±0.60①9.12±0.52 30.78＜0.001

2.4 TGP 治療給藥對CIA 大鼠胰島素、糖化血紅蛋白的影響 結(jié)果如表3所示，與正常組相比較，模型組大鼠空腹胰島素水平和糖化血紅蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組大鼠相比較，TGP治療給藥能夠顯著降低胰島素水平和糖化血紅蛋白水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 TGP 治療給藥對大鼠肌糖原和肝糖原的影響 結(jié)果如表3所示，與正常組相比較，模型組大鼠的肝糖原和肌糖原含量水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組大鼠相比較，TGP治療給藥能夠顯著提高大鼠肝臟和肌肉糖原水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠胰島素、糖化血紅蛋白、肌糖原、肝糖原的影響/±s

表3 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠胰島素、糖化血紅蛋白、肌糖原、肝糖原的影響/±s

注：①與正常組相比較，P＜0.01。②與模型組相比較，P＜0.01。

組別正常組鼠數(shù)666空腹胰島素/（μg/L）13.9±1.42糖化血紅蛋白/%0.50±0.05肌糖原/（mg/g）8.70±0.67肝糖原/（mg/g）45.85±5.63模型組TGP組F值P值17.48±1.32①33.83±4.23②45.07＜0.001 24.6±2.22①16.7±1.87②34.17＜0.001 0.78±0.06①0.63±0.07②27.32＜0.001 2.30±0.53①5.35±0.82②65.73＜0.001

2.6 TGP 治療給藥對CIA 大鼠GLUT-2 和GLUT-4 水平的影響 結(jié)果如圖2 所示，正常組，模型組和TGP 組大鼠的GLUT-2/β-actin 比值依次為（0.76±0.07）、（0.29±0.06）、（0.77±0.09）。與正常組相比較，模型組大鼠肝臟組織GLUT-2 表達(dá)水平顯著低于正常對照組；與模型組相比較，TGP 給藥組GLUT-2 表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=51.24，P＜0.001）。此外，正常組，模型組和TGP 組大鼠的GLUT-4/β-actin 比值依次為（0.89±0.05）、（0.36±0.03）、（0.81±0.04）。與正常組相比，模型組大鼠肌肉組織GLUT-4 表達(dá)水平顯著低于正常對照組；與模型組相比較，TGP治療組大鼠肌肉組織GLUT-4表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=177.21，P＜0.001）。

圖2 白芍總苷（TGP）治療給藥對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠GLUT-2和GLUT-4水平的影響

3 討論

RA 是一類以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性、慢性自身免疫病。在RA 疾病進(jìn)程過程中會誘發(fā)多種并發(fā)癥，其中血糖異常升高在長病程RA 病人中較為常見。研究發(fā)現(xiàn)RA 病人合并糖尿病發(fā)生的概率約為20%［9］，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人群。目前對RA病人血糖異常升高的原因尚未完全闡明清楚，但一般認(rèn)為在RA 發(fā)病初期，炎癥免疫反應(yīng)及其調(diào)控因素參與誘發(fā)了血糖的代謝異常［10］。然而血糖的異常升高可反過來促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)。這兩種因素在RA 疾病發(fā)展過程中，相互作用構(gòu)成惡性循環(huán)［11］，加重RA 病情及誘發(fā)多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的預(yù)后。因此，在RA 病人早期診斷和治療過程中，及時監(jiān)控血糖代謝情況以及維持血糖的穩(wěn)定對于控制疾病的發(fā)展具有積極的意義。

TGP是我國傳統(tǒng)中藥白芍根中的提取有效活性成分成，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎免疫調(diào)節(jié)活性等多種藥理活性［12］。TGP 治療RA 療效肯定，安全性高，能明顯改善病人的關(guān)節(jié)功能，降低實驗室指標(biāo)血沉、C 反應(yīng)蛋白及類風(fēng)濕因子等［13］。TGP 聯(lián)合來氟米特等改變病情抗風(fēng)濕病藥物（DEMARDs）治療RA 不僅療效協(xié)同增加，同時還能降低DEMARDs 引起的肝腎損傷等不良反應(yīng)［14］。研究報道TGP 主要活性成分芍藥苷對2型糖尿病動物模型具有良好治療作用，不僅可以抑制糖尿病動物機(jī)體炎癥反應(yīng)，還可以降低空腹血糖，改善胰島素抵抗水平，提示TGP具有維持血糖代謝穩(wěn)態(tài)等作用。本研究初步考察TGP 對關(guān)節(jié)炎動物模型血糖的調(diào)控作用。大鼠CIA 模型是兼有體液免疫和細(xì)胞免疫的慢性炎癥性動物模型，其遺傳背景和病理學(xué)改變與RA 極為相似，是研究RA 發(fā)病機(jī)制、病程變化和藥物作用的最常用模型之一［15］。本研究中，我們首先建立了大鼠CIA 模型，結(jié)果表明模型大鼠足爪腫脹在致炎后D26 達(dá)到高峰期，隨后逐步緩解。組織病理學(xué)結(jié)果表明模型大鼠關(guān)節(jié)間隙不均一，關(guān)節(jié)面可見異常的滑膜細(xì)胞增生并伴有炎性細(xì)胞浸潤和軟骨侵蝕，而TGP 和陽性對照藥MTX 能顯著抑制足爪腫脹，改善關(guān)節(jié)組織病理學(xué)，提示當(dāng)前模型建立成功。為了探討TGP 對CIA 大鼠血糖的作用，在實驗開始之前對每只大鼠進(jìn)行標(biāo)記，并且在大鼠致炎前，致炎后（給藥前）及給藥后三個不同的時間點檢測大鼠空腹血糖水平。研究結(jié)果表明致炎前三組大鼠之間血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，致炎后D14，模型組大鼠血糖濃度明顯高于正常組，且TGP 治療給藥能顯著降低大鼠空腹血糖水平和糖化血紅蛋白水平。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)TGP 治療給藥能夠降低模型大鼠胰島素水平，提示對胰島素抵抗具有改善作用。

正常機(jī)體血糖濃度維持在一個相對恒定的水平，主要是受到神經(jīng)系統(tǒng)、激素及組織器官共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。在生理性血糖升高情況下，肝臟作為血糖濃度最主要器官，會通過快速上調(diào)GLUT-2，加速攝取過多的葡萄糖進(jìn)入肝細(xì)胞，通過肝糖原合成來降低血糖濃度［16］。除肝臟之外，肌肉組織細(xì)胞膜上GLUT4 水平也會上調(diào)，加快對血液中葡萄糖吸收，合成肌糖原或轉(zhuǎn)變成脂肪儲存起來。當(dāng)血糖濃度偏低時，肝臟通過糖原分解及糖異生升高血糖濃度［17］。本研究結(jié)果表明TGP 給藥后能夠增加關(guān)節(jié)炎大鼠肝臟和肌肉糖原的含量水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TGP 上調(diào)了GLUT-2 和GLUT-4 的水平，提示TGP通過調(diào)控轉(zhuǎn)運體，加快機(jī)體組織對葡萄糖吸收，達(dá)到穩(wěn)定血糖水平作用。TGP 如何調(diào)控GLUT-2 和GLUT-4，已有研究發(fā)現(xiàn)GLUT4 受到胰島素受體介導(dǎo)的信號通路正性調(diào)控［18］。芍藥苷作為TGP 最主要活性成分能夠調(diào)控糖尿病下異常的胰島素受體信號通路［19］，提示TGP 調(diào)控GLUT 可能與胰島素受體信號通路有關(guān)，而該作用機(jī)制可能獨立于其抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，TGP 能夠維持CIA 大鼠血糖穩(wěn)定，該作用可能與其調(diào)控GLUT-2和GLUT-4水平有關(guān)。

（本文圖1見插圖8-1）