董文鳳 杜向東

[摘要] 目的 研究長期服用奧氮平對大鼠糖原代謝及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響，探討奧氮平影響糖代謝的可能機(jī)制。 方法 將12只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（n = 6）和藥物組（n = 6），藥物組大鼠每天以奧氮平混懸液2.1 mg/kg體重灌胃，對照組大鼠每天以等體積蒸餾水灌胃，持續(xù)63 d。定期監(jiān)測大鼠的攝食量、體重變化、空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS），計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI）和胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評(píng)價(jià)模型指數(shù)（HOMA-IR）。給藥63 d后采集兩組大鼠的肝臟、肌肉和脂肪組織，檢測肝臟和肌肉組織中糖原含量和糖原合酶（GS）活性，Western blot法檢測肝臟和肌肉組織中GS以及肝臟、肌肉和脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）的蛋白表達(dá)，PCR法檢測肝臟、肌肉和脂肪組織中GLUT的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，長期給予奧氮平后藥物組大鼠攝食量和體重增加，F(xiàn)BG和FINS升高，糖原含量減少，GS活性提高但蛋白表達(dá)不變;GLUT蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 在奧氮平長期誘導(dǎo)下，機(jī)體糖原分解增加，糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，產(chǎn)生胰島素抵抗，這可能是長期服用奧氮平后糖代謝異常的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 奧氮平;血糖;糖原;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體

[中圖分類號(hào)] R749.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（c）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effects of subchronic Olanzapine treatment on the metabolism of glycogen and expression of glucose transporter in rats and to investigate the possible mechanism of Olanzapine′s effects on glycometabolism. Methods Twelve healthy male SPF grade Sprague-Dawley （SD） rats were divided into control group （n = 6） and drug group （n = 6） according to random number table method. Rats in drug group were given 2.1 mg/kg Olanzapine suspension per day according to body weight by gavage and rats in control group were given the same volume of distilled water by gavage for 63 days. The food intake， change of body weight， levels of fasting blood glucose （FBG） and fasting insulin （FINS） were detected periodically. The insulin sensitivity index （ISI） and homeostasis model assessment of insulin resistance （HOMA-IR） were calculated. After 63 days， the liver， muscle and adipose tissues were collected and the content of glycogen and activity of glycogensynthase （GS） in liver and muscle tissues were detected. Western blot was used to assay the protein expression of GS in liver and muscle tissues and glucose transporter （GLUT） in liver， muscle and adipose tissues. PCR was used to assay the mRNA expression of GLUT in liver， muscle and adipose tissues. Results Compared to rats of control group， the subchronic Olanzapine treatment led to an increase of food intake， body weight， FBG and FINS in drug group， while the content of glycogen was reduced， the activity of GS was increased but the protein expression of GS was unchanged; the protein and mRNA expression of GLUT in liver， muscle and adipose tissues were decreased with highly statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Subchronic Olanzapine treatment can increase glycogenolysis， decrease the capacity of glucose transport and result in generating insulin resistance， which may be one of the mechanisms lead to abnormal glucose metabolism after subchronic administration of Olanzapine.

[Key words] Olanzapine; Blood glucose; Glycogen; Glucose transporter

精神分裂癥是精神科最常見的一種高致殘、高復(fù)發(fā)、慢性、難治性疾病，抗精神病藥物是主要的治療手段。因作用譜廣、安全性高，第二代抗精神病藥物在精神分裂癥治療中處方量很大。但隨著第二代抗精神病藥物的廣泛應(yīng)用，該類藥物被發(fā)現(xiàn)會(huì)引起體重增加、血糖異常等代謝相關(guān)不良反應(yīng)[1-3]，這不但會(huì)誘發(fā)心腦血管疾病，而且降低了患者的生活質(zhì)量和治療滿意度，影響患者的用藥依從性和疾病的轉(zhuǎn)歸[4-5]。

在第二代抗精神病藥物中，奧氮平處方量較大，引起代謝異常的報(bào)道相對較多[6-8]。該藥物誘發(fā)糖代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)已被證實(shí)，藥品說明書也明確標(biāo)示“接受奧氮平治療的患者，應(yīng)定期檢查血糖控制情況”。但奧氮平引起糖代謝異常的機(jī)制至今不明。本研究建立長期給予奧氮平的大鼠模型，觀察奧氮平對糖原代謝及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響，探討奧氮平藥源性高血糖的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠12只，體重180～220 g，6～8周齡，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物組（n = 6）和對照組（n = 6）。每天17∶00，藥物組以奧氮平混懸液（商品名：歐蘭寧，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，碾粉后用蒸餾水溶解制成混懸液）2.1 mg/kg體重灌胃，空白組以等體積蒸餾水灌胃，持續(xù)63 d。實(shí)驗(yàn)期間，自由進(jìn)食普通飼料，自由飲水。

1.2 攝食量、體重和空腹血糖（FBG）的測定

每天記錄大鼠的攝食量，每周稱1次體重。每周在固定時(shí)間禁食12 h后，經(jīng)尾靜脈采血10 μL，按照羅氏血糖儀（卓越型）的操作說明測定FBG值。

1.3 空腹胰島素（FINS）水平的測定以及胰島素敏感指數(shù)（ISI）和胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評(píng)價(jià)模型指數(shù)（HOMA-IR）的計(jì)算

每周在固定時(shí)間禁食12 h后，經(jīng)尾靜脈采血100 μL，靜置30 min，離心，取血清，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定FINS值：標(biāo)準(zhǔn)品孔每孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;樣品孔每孔加40 μL樣品稀釋液和10 μL待測樣品，混勻;加檢測抗體100 μL，37℃溫育1 h;洗滌5次，拍干;加顯色劑100 μL，混勻，37℃避光顯色15 min;加50 μL終止液，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度（OD值）;以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度（即FINS值），并按公式ISI=ln[1/（FBG×FINS）]和HOMA-IR=FBG×FINS/22.5分別計(jì)算長期給予奧氮平后機(jī)體的ISI和HOMA-IR值。

1.4 采集標(biāo)本

給藥結(jié)束后處死大鼠，分別采集肝臟、脂肪、肌肉組織，稱重，4℃保存待測。

1.5 肝糖原和肌糖原含量的測定

取待測肝臟、肌肉組織，按樣本重量（mg）∶堿液體積（μL）=1∶3加入試管，沸水浴20 min，冷卻得糖原水解液，用雙蒸水將糖原水解液制成1%肝糖原檢測液（5%肌糖原檢測液），按照試劑盒說明書測定糖原含量。

1.6 糖原合酶（GS）活性及蛋白表達(dá)水平的檢測

取待測肝臟、肌肉組織，按1∶10加入提取液，冰浴下勻漿，4℃、8000 g離心10 min，取上清，用紫外分光光度計(jì)在340 nm處測定吸光度，按照試劑盒說明書計(jì)算GS活性。

Western blot法測定GS的蛋白表達(dá)：取待測肝臟、肌肉組織，以GAPDH為對照，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，以1%牛血清白蛋白（BSA）對膜進(jìn)行封閉;加一抗與對照抗體，4℃孵育過夜;洗滌后加二抗，37℃孵育1 h;洗滌后熒光成像，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值計(jì)算GS的蛋白表達(dá)量。

1.7 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）表達(dá)能力的檢測

Western blot法測定GLUT的蛋白表達(dá)：取待測肝臟、肌肉和脂肪組織，以GAPDH為對照，具體方法同“1.6”。

PCR法測定GLUT的mRNA表達(dá)：取待測肝臟、肌肉和脂肪組織，以β-actin為對照，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用熒光定量PCR儀檢測目的蛋白的mRNA表達(dá)水平。以2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系：4 μL dNTP Mix、2 μL Primer Mix、5 μL RNA模板、4 μL 5×SuperRT Buffer、1 μL SuperRT、4 μL滅菌蒸餾水。擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下，GLUT2上游引物：5′-TTCCGGAAGAAGAGTGGTTCG-3′，下游引物：5′-TGGTCGGTTCAACTCCACACCG-3′;GLUT4上游引物：5′-CATTGTCTCCTGCATCTCGTC-3′，下游引物：5′-ATTCCGCAATCTAGGCTCGTC-3′;β-actin上游引物：5′-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-3′，下游引物：5′-TCCTGCATCCTGTGAGCAATG-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對攝食量、體重的影響

實(shí)驗(yàn)第35天后，藥物組攝食量大于對照組。實(shí)驗(yàn)第14天后，藥物組體重普遍大于對照組，但該階段內(nèi)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，藥物組體重明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 對FBG的影響

實(shí)驗(yàn)前7 d，兩組大鼠FBG均有一過性升高;之后兩組FBG均下降;至35 d時(shí)，兩組FBG趨于相等，基本穩(wěn)定在給藥前的水平;35 d后，藥物組FBG整體高于對照組;第56天時(shí)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;第63天時(shí)，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.3 對FINS、ISI和HOMA-IR的影響

實(shí)驗(yàn)前14 d，兩組大鼠FINS均持續(xù)升高;14 d后，兩組FINS均下降;35 d后，對照組FINS基本穩(wěn)定在同一水平上，而藥物組FINS整體升高;第63天時(shí)，藥物組FINS高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。計(jì)算ISI和HOMA-IR發(fā)現(xiàn)，第63天，藥物組ISI（-6.00±0.09）較對照組（-5.71±0.10）下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;藥物組HOMA-IR（17.95±1.57）大于對照組（13.46±1.32），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.4 對糖原含量的影響

測定喂養(yǎng)結(jié)束后大鼠肝臟和肌肉組織中糖原含量發(fā)現(xiàn)，藥物組肝糖原含量[（5.95±0.17）mg/g]較對照組[（6.37±0.45）mg/g]減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;藥物組肌糖原含量[（1.25±0.06）mg/g]與對照組[（1.35±0.05）mg/g]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.5 對GS的活性及蛋白表達(dá)的影響

檢測喂養(yǎng)結(jié)束后大鼠肝臟和肌肉組織中的GS發(fā)現(xiàn)，藥物組肝臟GS活性[（1774.00±880.47）nmol/（min·g）]較對照組[（458.17±224.47）nmol/（min·g）]增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;藥物組肌肉GS活性[（1486.83±2255.08）nmol/（min·g）]與對照組[（678.47±1426.18）nmol/（min·g）]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。兩組肝臟和肌肉GS的蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.6 對GLUT的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)的影響

檢測喂養(yǎng)結(jié)束后大鼠肝臟、肌肉和脂肪組織中GLUT發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，藥物組GLUT的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)均下調(diào)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

3 討論

在慢性、難治性精神分裂癥的治療中，抗精神病藥物長期維持治療起著非常重要的作用。本研究建立長期給予奧氮平的大鼠模型，藥物組攝食量、體重增長、FBG都高于對照組，提示長期給予奧氮平產(chǎn)生了一系列代謝相關(guān)不良反應(yīng)，該結(jié)果與臨床報(bào)道相符[6-7]。服藥后食欲和體重增加是奧氮平常見的不良反應(yīng)[2，9-10]，但體重增加只是糖代謝異常的危險(xiǎn)因素之一[11]，糖代謝過程主要涉及胰島素分泌和響應(yīng)、葡萄糖攝取和利用等多個(gè)環(huán)節(jié)[12-13]，每一環(huán)節(jié)都可能在奧氮平作用下發(fā)生異常而引起糖穩(wěn)態(tài)失衡。

本研究發(fā)現(xiàn)，長期給予奧氮平后，藥物組大鼠FINS高于對照組，提示長期給予奧氮平并未抑制胰島素分泌，但I(xiàn)SI低于對照組，HOMA-IR大于對照組，提示機(jī)體對胰島素敏感性降低，產(chǎn)生了胰島素抵抗傾向。胰島素可以促進(jìn)糖原合成[14]，但本研究中藥物組FINS上升的同時(shí)糖原合成卻減少，進(jìn)一步提示在奧氮平長期誘導(dǎo)下機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗，對胰島素敏感性和響應(yīng)性降低。胰島素抵抗時(shí)，體內(nèi)胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用效率下降[15-16]。親水性葡萄糖不能獨(dú)自跨過細(xì)胞膜，必須由特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即GLUT帶入細(xì)胞內(nèi)，GLUT2主要存在于肝臟組織中，GLUT4在骨骼肌和脂肪組織中表達(dá)，GLUT性能改變可影響組織細(xì)胞對葡萄糖的攝取[17-18]。體內(nèi)葡萄糖除氧化供能外，主要在肝臟和肌肉中合成糖原，維持機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)。GS是糖原合成的關(guān)鍵酶，在肌肉和肝臟中都有表達(dá)，當(dāng)GS性能改變時(shí)，糖原合成減少，影響糖利用引起血糖波動(dòng)[19-20]。

為進(jìn)一步探討奧氮平慢性治療下糖穩(wěn)態(tài)失調(diào)、胰島素抵抗的內(nèi)在原因，本研究以負(fù)責(zé)葡萄糖攝取的GLUT和參與糖原代謝利用的GS為研究對象，觀察奧氮平對葡萄糖攝取和利用的影響。研究發(fā)現(xiàn)，長期給予奧氮平后，肝臟和肌肉組織中GS的蛋白表達(dá)無變化、蛋白活性增強(qiáng)，提示奧氮平的長期誘導(dǎo)不影響糖原合成。結(jié)合本研究中藥物組糖原含量減少這一結(jié)果，推測奧氮平增加糖原分解能力大于促進(jìn)糖原合成能力，因而血糖波動(dòng)。此外，長期給予奧氮平后大鼠肝臟、肌肉、脂肪組織中GLUT的蛋白和mRNA表達(dá)均下降，推測奧氮平抑制了葡萄糖的正常攝取轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)胞對糖的吸收利用，升高了血液中葡萄糖的濃度。

綜上所述，在奧氮平長期誘導(dǎo)下，機(jī)體食欲和體重增加，組織中GLUT表達(dá)下調(diào)限制了細(xì)胞攝取葡萄糖，糖原分解增加破壞了體內(nèi)糖穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生胰島素抵抗，造成血液中葡萄糖濃度高于正常值。奧氮平藥源性高血糖不僅威脅著用藥者的心血管健康，還會(huì)因此影響患者的治療滿意度和用藥依從性，容易導(dǎo)致精神癥狀復(fù)發(fā)，增加個(gè)人、家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。研究該類不良反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制對尋找奧氮平藥源性高血糖防治靶點(diǎn)、開發(fā)新藥物、實(shí)施個(gè)體化治療防治奧氮平誘發(fā)高血糖、提高用藥者的生活質(zhì)量具有重要的科學(xué)和社會(huì)意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Vuk A，Kuzman MR，Baretic M，et al. Diabetic ketoacidosis associated with antipsychotic drugs：case reports and a review of literature [J]. Psychiatr Danub，2017，29（2）：121-135.

[2]? Zahan T，Akhter N，Mullick MSI，et al. Metabolic risk factor-profile in patients on treatment with second generation antipsychotics [J]. Bangladesh Med Res Counc Bull，2015， 41（3）：144-150.