唐金蓉 李 盛 張曼俐 李鳳至

四川省綿陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院 621000

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae,CRKP)的檢出近年來(lái)呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，且對(duì)多種抗生素均表現(xiàn)出較高的耐藥性，其致死率高，預(yù)后差，為臨床治療帶來(lái)巨大壓力[1-3]。隨著對(duì)中藥抑菌研究的深入，發(fā)現(xiàn)中藥在抑菌方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，甚至對(duì)于多重耐藥菌也可以發(fā)揮一定作用[4]。目前對(duì)中藥聯(lián)合抗生素對(duì)多重耐藥菌的抑菌作用研究較多，但中藥之間的聯(lián)合作用研究較少。本研究特選用黃芩、黃連和黃柏這三種中藥進(jìn)行研究，觀察單味中藥和聯(lián)合用藥對(duì)CRKP的體外藥敏作用，為中藥抗多重耐藥菌提供更多的思路。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 選取我院檢驗(yàn)科微生物室日常培養(yǎng)標(biāo)本中篩出的致病菌，標(biāo)本類型為痰液、血液等。共收集8株細(xì)菌，要求鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌，藥敏結(jié)果為亞胺培南耐藥，并且用紙片法對(duì)亞胺培南的藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，兩種方法亞胺培南均為耐藥的菌株予以納入。將菌株分純后放入含肉湯的無(wú)菌密封容器中，置于-70℃冰箱保存。

1.2 藥物來(lái)源 黃芩(批號(hào)：21100148)、黃連(批號(hào)：20190055)、黃柏(批號(hào)：20190042)三種中藥顆粒均來(lái)自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.3 儀器與試劑 鑒定用梅里埃全自動(dòng)鑒定儀VITEK2 Compact。所有鑒定試劑來(lái)自法國(guó)梅里埃，鑒定和藥敏用GN卡、GN13卡。亞胺培南藥敏紙片來(lái)自O(shè)xoid Limited。質(zhì)控菌株來(lái)自溫州康泰，主要為霍氏腸桿菌ATCC700203、嗜麥芽窄食假單胞菌ATCC17666等。MH肉湯干粉來(lái)自杭州濱和。血平板等來(lái)自鄭州安圖生物。96孔U型培養(yǎng)板來(lái)自優(yōu)耐特。

1.4 方法

1.4.1 藥液的制備：以黃芩為例，將5g黃芩顆粒加入5ml無(wú)菌蒸餾水中，用渦輪混勻器充分混勻溶解，必要時(shí)在水浴箱中孵育使其充分溶解，再用濾紙過(guò)濾。配制成1 000mg/ml的黃芩藥液置于4℃冰箱中備用。

1.4.2 菌液制備：將菌株從冰箱取出解凍后接種于血平板，35℃孵育16～24h后，取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種血平板孵育16～24h備用。挑取單個(gè)菌落至專用細(xì)菌稀釋液中，用比濁儀將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?細(xì)菌濃度為1×108CFU/ml)，然后稀釋100倍，即得到細(xì)菌濃度為1×106CFU/ml菌液備用。

1.4.3 測(cè)定黃芩、黃柏和黃連分別對(duì)CRKP的最低抑菌濃度(MIC)：采用微量肉湯稀釋法，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行反應(yīng)。(2)以黃芩為例，第1孔為陽(yáng)性對(duì)照，加入100μl 經(jīng)高壓滅菌的MH肉湯和100μl菌液，第2孔為陰性對(duì)照100μl MH肉湯和100μl藥液，第3孔加入200μl起始濃度為1 000μg/ml的黃芩藥液，第4～12孔分別加入100μl MH肉湯，將第3孔的藥液加100μl到第4孔，混勻后再吸取100μl到第5孔以此類推進(jìn)行倍比稀釋，使黃芩藥液調(diào)節(jié)為2～1 000mg/ml的10個(gè)濃度梯度。(3)第3～12孔分別加入100μl之前準(zhǔn)備好的菌液，每孔細(xì)菌的終末濃度為5×105CFU/ml。(4)35℃孵育16～24h后觀察菌液生長(zhǎng)情況，以小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。(5)由于黃連等藥物顏色較深，或是藥物沉積不利于觀察，則可將該孔中的液體轉(zhuǎn)種至平板35℃孵育16～24h再觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.4.4 測(cè)定黃芩、黃柏和黃連兩兩聯(lián)合對(duì)CRKP的聯(lián)合藥敏：(1) 采用微量肉湯稀釋棋盤法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn): 以黃芩和黃連為例，將黃芩和黃連分別從2倍MIC值開始用MH肉湯稀釋8個(gè)稀釋倍數(shù)備用，96孔板的行和列分別按濃度從大到小加黃芩和黃連藥液，每孔50μl，再每孔加入100μl菌液。(2) 每行的最后兩孔分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照加樣。(3)35℃孵育16～24h后讀取結(jié)果，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。(4)部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index,FIC )計(jì)算方法：FIC=MIC甲藥(單測(cè))/MIC甲藥(聯(lián)合)+MIC乙藥(單測(cè))/MIC乙藥(聯(lián)合)。FIC結(jié)果解讀：FIC≤0.5,則表示兩種藥物之間具有協(xié)同作用。FIC>0.5～1，則表示兩種藥物之間具有相加作用。FIC>1～2，表示無(wú)關(guān)作用。FIC>2，表示存在拮抗作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩、黃柏和黃連分別對(duì)8株CRKP的MIC值 黃芩對(duì)CRKP的MIC為250～1 000mg/ml，黃連對(duì)CRKP的MIC為250～1 000mg/ml，黃柏對(duì)CRKP的MIC均為>1 000mg/ml。詳見表1。

2.2 黃芩、黃柏和黃連兩兩組合對(duì)8株CRKP的MIC和FIC

表1 黃芩、黃連和黃柏對(duì)8株CRKP的MIC(mg/ml)

黃芩聯(lián)合黃連對(duì)CRKP的FIC為0.25～1.00，表現(xiàn)為協(xié)同作用和相加作用；黃芩聯(lián)合黃柏對(duì)CRKP的FIC為0.63～1.50，表現(xiàn)為相加作用和無(wú)關(guān)作用，黃連聯(lián)合黃柏對(duì)CRKP的FIC為0.53～1.50，表現(xiàn)為相加作用和無(wú)關(guān)作用。詳見表2。

表2 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯(lián)合對(duì)8株CRKP的MIC和FIC

2.3 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯(lián)合后的作用統(tǒng)計(jì) 黃芩聯(lián)合黃連表現(xiàn)為協(xié)同作用(50.0%)和相加作用(50.0%)，黃芩聯(lián)合黃柏表現(xiàn)為相加作用(12.5%)和無(wú)關(guān)作用(87.5%)，黃連聯(lián)合黃柏表現(xiàn)為相加作用(25.0%)和無(wú)關(guān)作用(75.0%)，三種組合方式的作用有差異(P=0.01<0.05),詳見表3。

表3 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯(lián)合的作用[n(%)]

3 討論

目前對(duì)于CRKP所致感染形式嚴(yán)峻，治療主要采用以碳青霉烯類抗生素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥，但其費(fèi)用高昂，毒副作用大，且藥物的可獲得性及療效均不樂觀[5]。中藥在多重耐藥菌的防治中也有獨(dú)特的作用，篩選出有效的中藥對(duì)CRKP的防治也將發(fā)揮重要的作用。 本研究發(fā)現(xiàn)黃芩、黃連和黃柏三種中藥中黃芩、黃連對(duì)CRKP的效果最好，其MIC范圍均為250～1 000mg/ml，黃柏未表現(xiàn)出抑菌作用，對(duì)CRKP的MIC均為>1 000mg/ml。 與賴韶欽等[6]、蘭小琴等[7]的研究結(jié)果部分一致。黃芩的主要成分黃芩苷和黃芩素以及黃連的主要成分小檗堿和黃連堿均具有良好的抑菌作用[8]，所以這兩味中藥對(duì)CRKP也具有較好的抑制作用。雖然黃芩和黃連效果最好，但其MIC的濃度很高，這樣高的濃度在體內(nèi)難以達(dá)到，所以單藥抗CRKP的效果很難實(shí)現(xiàn)。

中藥聯(lián)合方面，黃芩同黃連聯(lián)合效果最明顯，具有協(xié)同作用(50.0%)和相加作用(50.0%)。黃芩同黃柏以及黃連同黃柏聯(lián)用主要表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。所有的聯(lián)合藥敏未發(fā)現(xiàn)拮抗作用。這與程招敏等[9]的研究結(jié)果完全不同，可能是由于二者選用的菌株不一樣，本試驗(yàn)選用的是CRKP,而前者全部是泛耐藥菌株。本結(jié)論說(shuō)明在對(duì)CRKP的治療中，具有黃芩和黃連的方劑可能會(huì)具有一定的作用。

綜上所述，黃芩、黃連和黃柏三種中藥中，黃芩、黃連對(duì)CRKP的效果最好，且二者聯(lián)用對(duì)CRKP具有協(xié)同或相加作用。本研究的不足之處在于采用的是中藥顆粒，其成分很多，可進(jìn)一步研究中藥提取物的藥敏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)起抑菌作用的主要成分。目前對(duì)于中藥抑菌的研究，更多地局限在體外藥敏試驗(yàn)中，可能會(huì)與體內(nèi)實(shí)際療效有所差異。