曹愷欣， 武俊瑞,3， 李 默， 韓 琦， 于 博， 祁姝旖，王子健， 烏日娜,3,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院， 遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術工程研究中心， 遼寧 沈陽 110866；3.沈陽市微生物發(fā)酵技術創(chuàng)新重點實驗室， 遼寧 沈陽 110866)

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，當其黏附于宿主腸道內(nèi)時，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)、促進機體免疫功能提升等作用[1-2]。由于外源性益生菌的腸黏膜黏附性差、競爭力弱和定植困難等原因[3-4]，外源性益生菌的補充在影響人類腸道菌群構成、促進健康方面的作用是有限的。因此，提高益生菌的腸道黏附能力成為益生菌在宿主腸道中穩(wěn)定定植的關鍵[5]。

巰基化合物具有良好的生物黏附性，能與益生菌表面蛋白上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵[6]，也可通過巰基或二硫鍵的交換反應，與黏液凝膠層中富含半胱氨酸的區(qū)域形成二硫鍵，通過共價鍵緊密結合于黏膜[6-8]，進而連接益生菌和腸黏液，促進益生菌的腸道定植。Leitner等[8]通過證實巰基化聚合物能與黏蛋白間形成二硫鍵，為巰基化聚合物黏膜黏附機理提供了依據(jù)。徐詠梅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，巰基化羧甲基殼聚糖能保留羧甲基殼聚糖的生物特性，同時也具備優(yōu)良的生物黏附性。

多糖具有保護腸道屏障，免疫調(diào)節(jié)等益生作用[10]。黨參多糖(Codonopsispilosulapolysaccharide)具有改善腸道微生態(tài)的功能，其表面含有大量的羥基，可經(jīng)過化學修飾得到巰基化合物[11]。目前已有關于香菇柄多糖的乙?；揎梉12]，青錢柳多糖的羧甲基化修飾的研究[13]，但尚未見將黨參多糖化學修飾后應用于益生菌腸道定植方面的報道。鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)是人體腸道內(nèi)重要的益生菌[14]，能耐受胃液進入腸道，維護腸道菌群平衡和腸道穩(wěn)態(tài)平衡，且全基因組明確，易于對其進行腸道定植的定量分析[15]。本研究將前期分離純化所得黨參多糖組分(CPP-2)進行羧甲基化修飾，得到羧甲基黨參多糖(C-CPP-2)，再對其進行巰基化修飾，得到巰基化黨參多糖(sC-CPP-2)。利用與LGG的體外腸道黏附實驗以及與海藻酸鈉形成的復合膜，分析黨參多糖及其修飾組分對LGG黏附性的影響，并驗證sC-CPP-2與腸道黏液之間的相互作用關系，以期為促進益生菌的腸道黏附定植研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、一氯乙酸、冰醋酸、甲醇、鹽酸、溴化鉀、酚酞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、MRS瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京索萊寶生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自美國Sigma-Aldrich公司；硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，購自北京化學試劑廠。以上試劑為分析純。live/dead?BacLight TM細菌活性試劑盒Syto 9，美國Thermo Fisher Scientific公司。

LGG，由內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司饋贈；Sprague-Dawley大鼠(8～10周齡BALB/c雄性小鼠)，北京華阜康生物科技有限公司提供，每籠飼養(yǎng)3只，光/暗循環(huán)12 h，自由取食飲水，馴化1周，實驗前需禁食(不禁水)至少48 h。實驗動物倫理編號：License No. SYXK2021-0001。

1.2 主要儀器與設備

MLS- 3780型高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；Nicolet- 170型傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)，美國Nicolet公司；SHA- B型恒溫水浴鍋，金壇市精達儀器制造廠；ZEN1500型自動電位滴定儀，英國Malvern公司；FD53型高溫干燥箱，德國Binder公司；AR- 1500型流變儀，北京歐亞星宇科技有限公司；Secura225D- 1CN 型天平，德國Sartorius公司。S8100型掃描電子顯微鏡，日本日立高科技公司；LSM 710型激光共聚焦顯微鏡，德國Lavision Biotec公司。

1.3 實驗方法

1.3.1C-CPP-2的制備及結構表征

1.3.1.1 C-CPP-2的制備

取1 g CPP-2充分溶于50 mL去離子水中，加入150 mL NaOH溶液(3 mol/L)，攪拌10 min后加入20 g一氯乙酸，65 ℃下反應4 h，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0，進行透析，直至剩余試劑被消除。將透析得到的產(chǎn)物真空冷凍干燥，即得C-CPP-2。

1.3.1.2 羧甲基取代度的測定

參照Li等[16]和房斐等[17]的方法，利用中和滴定法測定C-CPP-2羧甲基取代度(DS)。取10 mg C-CPP-2于100 ℃干燥1 h，冷卻至室溫，加入3 mL體積分數(shù)為70%的甲醇水溶液，充分攪拌5 min，用50 mL NaOH溶液(0.5 mol/L)稀釋，攪拌3～5 h。計算方法見式(1)和式(2)。

DS=0.162X/(1-0.058X)；

(1)

X=C1V1-C2(V2-V0)。

(2)

式(1)中，DS為羧甲基取代度；

式(2)中，C1為NaOH濃度，0.5 mol/L；V1為氫氧化鈉溶液體積，50 mL；C2為鹽酸濃度，0.1 mol/L；V2為消耗的鹽酸溶液體積，mL；V0為空白溶液消耗的鹽酸溶液體積，mL。

1.3.1.3 紅外光譜分析

取20 mg CPP-2樣品，與200 mg溴化鉀研磨后壓成球團，用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1內(nèi)進行光譜掃描，確定羧基的取代情況。

1.3.2sC-CPP-2共軛物的制備及結構表征

1.3.2.1 sC-CPP-2共軛物的制備

取100 mg C-CPP-2充分溶解于20 mL蒸餾水中，加入166 mg EDC，室溫攪拌1 h，在氮氣保護下加入76 mg NAC，攪拌24 h，蒸餾水透析24 h，真空冷凍干燥，得到sC-CPP-2。

1.3.2.2 巰基含量的測定

參照段好剛[6]的方法，取50 mg sC-CPP-2，溶于100 mL去離子水中，取1 mL樣品溶液采用Ellman’s法測定其吸光度，根據(jù)式(3)計算sC-CPP-2中巰基含量。

Y=(X+0.012 7)/3.495。

(3)

式(3)中：Y為巰基含量，μmol/g；X為421 nm處測定的吸光度值。

1.3.2.3 電位變化分析

根據(jù)Liu[7]的方法，利用電位質(zhì)子滴定法測定CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2的ζ-電位。

1.3.3sC-CPP-2對LGG的黏附效果的測定

1.3.3.1 腸黏液的制備

參照北婷婷[18]的方法制備大鼠腸黏液，并于超低溫保藏。

1.3.3.2 CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG懸液的制備

將LGG菌體重懸于PBS中，調(diào)整LGG菌濃度為109CFU/mL。取5 mg CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2分別加入1 mL菌液中，混合均勻，得CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG混合懸液，對照組為生理鹽水/LGG(NS)。

1.3.3.3 sC-CPP-2體外黏液黏附實驗

參照北婷婷[18]的方法，檢測腸黏液對LGG的黏附作用。在96孔細胞培養(yǎng)板中加入1.3.3.1中制備所得腸黏液，并分別加入1.3.3.2中制備所得混合懸液，密封置于4 ℃冰箱過夜，吸取緩沖液洗滌2次。加入體積分數(shù)為1%的SDS與0.1 mol/L NaOH混合的裂解液，釋放黏附的細菌。進行平板活菌計數(shù)，根據(jù)式(4)計算腸黏液對LGG的黏附率。

黏附率=B/A×100%。

(4)

式(4)中：A為總細菌數(shù)，CFU/mL；B為黏附的細菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.3.4 sC-CPP-2的體外腸道黏附實驗

脊椎脫臼法處死大鼠后，鋪4份1.5 cm×1.5 cm×2 mm的大鼠腸道于無菌載玻片上，分別滴加1.3.3.2中制備所得混合懸液。將載玻片放置于滅菌離心管中輕微振蕩2 h后用生理鹽水沖洗，并將沖洗液收集后梯度稀釋，活菌計數(shù)，根據(jù)式(5)計算黏附率。

黏附率=(A-B)/A×100%。

(5)

式(5)中：A為總細菌數(shù)，CFU/mL；B為未黏附的細菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4LGG的黏液黏附性能的測定

參照Liu等[7]的方法，使用細菌活性試劑盒對LGG菌懸液染色，制作腸切片，采用激光掃描共聚焦顯微鏡進行3D層掃，觀察黏液中LGG吸附情況。

1.3.5黨參多糖/海藻酸鈉復合薄膜對LGG黏附作用的測定

1.3.5.1 CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2海藻酸鈉復合薄膜的制備

各取0.3 g海藻酸鈉分別溶解于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2(5 mg/mL，10 mL)水溶液中，空白組(BLK)不加糖，室溫攪拌4 h，加入150 mg甘油，超聲處理2 min去除氣泡。各取10 mL溶液分別倒入直徑為9 cm的塑料圓柱模具中，60 ℃烘干6 h。將膜取出，在50%濕度、25 ℃條件下放入烘干機中干燥48 h后備用。

1.3.5.2 復合薄膜對LGG的黏附作用的測定

將1.3.5.1中制備的各復合薄膜(1 cm2)與染色的LGG溶液(1 mL，4×108CFU/mL)合并，37 ℃孵育30 min，滅菌PBS沖洗3次后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。為計算黏附菌數(shù)，將相同數(shù)量的未染色的LGG與CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2膜37 ℃孵育30 min，用滅菌PBS沖洗3次后，將剩下的益生菌溶液全部鍍到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃孵育2 d。未黏附的益生菌細菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。LGG黏附于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2的黏附率根據(jù)1.3.3.4中式(5)計算。

1.3.6CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液黏附作用的測定

1.3.6.1 流變學特性的測定

參照Huamani-Melendez 等[19]和Cohen等[20]的方法，各取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(5 mg/mL)加入至等體積的腸黏液中制成均勻混合物，于1 Hz頻率下進行線性黏彈性區(qū)域內(nèi)的振蕩時間掃描。通過流變儀測定3種混合物在剪切速率為0.01～100.00 s-1條件下的黏度變化情況。

1.3.6.2 張力的測定

參照Liu等[7]的方法，取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(500 mg/mL)分別壓縮于平面測試圓盤(d=10 mm)中，注射泵固定于天平上方。將大鼠的結腸組織固定于燒杯底部，注入PBS，使測試圓盤降至結腸組織表面，孵育20 min。注射泵滑塊以2.83 mm/min的速度勻速上升，直至測試圓盤與結腸組織分離。每秒記錄一次天平數(shù)據(jù)，計算最大分離力并按照梯形法則計算總黏附功。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示；使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 多重比較分析，P<0.05表示差異顯著；利用OriginPro 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 C-CPP-2和sC-CPP-2的結構表征

圖1 CPP-2和C-CPP-2的FT-IR分析

C-CPP-2的羧基進一步與N-乙酰-L-半胱氨酸結合，進而將-SH連接到多糖的結構上，得到sC-CPP-2。-SH既能與細菌表面的黏液結合蛋白形成穩(wěn)固的S-S，又能與腸道黏液層的半胱氨酸結合形成S-S[7-8]，連接細菌和腸道黏液，增加細菌的腸道黏附作用。經(jīng)過巰基修飾之后，由式(3)計算得sC-CPP-2中巰基含量為 (279.50±5.97) μmol/g。CPP-2，C-CPP-2和sC-CPP-2中ζ-電位變化情況見圖2。由圖2可見，經(jīng)羧基甲基化后，ζ-電位從-8.8 mV(CPP-2)下降到-67.5 mV(C-CPP-2)，sC-CPP-2則上升到-53.6 mV，表明sC-CPP-2成功修飾上巰基，且處于巰基和羧基共存狀態(tài)。

不同小寫字母表示組間差異顯著。

2.2 sC-CPP-2對LGG的體外黏液及腸道黏附性的影響

2.2.1體外黏液黏附性分析

為研究sC-CPP-2是否能夠增強LGG的體外黏液黏附作用，由式(4)計算分別添加生理鹽水、CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2后LGG的黏附性，各組樣品對LGG的黏附情況見圖3。由圖3可見，與NS組、CPP-2組和C-CPP-2組相比，sC-CPP-2對LGG的黏附作用顯著增強。表明sC-CPP-2表面巰基與LGG表面蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，在LGG和黏液之間形成黏附作用，增加了黏液對LGG的黏附性；且sC-CPP-2與黏液之間的相互作用強度強于CPP-2與黏液之間的相互作用強度。C-CPP-2對益生菌的吸附率高于CPP-2，可能是由于C-CPP-2的羧基、羥基與腸黏液糖蛋白上唾液酸殘基之間形成的氫鍵和離子鍵所致[25]。

不同小寫字母表示組間差異顯著。

2.2.2體外腸道黏附性分析

益生菌通過胃后，與腸道黏液的長期黏附是益生菌發(fā)揮其生理功能的先決條件[4]。利用體外腸道黏附實驗進一步驗證sC-CPP-2/LGG對LGG的黏附作用。各組樣品對LGG的黏附情況見圖4。由圖4可見，與NS組、CPP-2組和C-CPP-2組相比，sC-CPP-2對LGG的黏附作用顯著增強，可能是sC-CPP-2表面巰基與LGG和黏液之間形成共價鍵，增加黏液對LGG的黏附性。相比于體外黏液的黏附實驗，NS組、CPP-2組和C-CPP-2組對LGG的體外腸道黏附作用更好，可能是其與LGG腸道黏液間存在氫鍵、范德華力等其他作用力的影響。

不同小寫字母表示組間差異顯著。

2.3 sC-CPP-2對LGG的腸道黏附性分析

LGG在腸道中的黏附情況CLSM觀察結果見圖5。由圖5可見，CPP-2和C-CPP-2組有少量的LGG黏附到腸道，sC-CPP-2組的LGG黏附效果最佳，黏附數(shù)量最多。與CPP-2相比，sC-CPP-2和LGG之間的相互作用更強，這可能是因為sC-CPP-2和LGG之間存在二硫鍵。這一結果與體外黏液和腸道黏附實驗相對應，再次證明sC-CPP-2可以增加LGG的腸道黏附性。Liu等[7]對魔芋葡甘聚糖的修飾也得到了與本研究相似的結果。

圖5 不同黨參多糖對LGG的腸道黏附性激光共聚焦觀察結果

2.4 sC-CPP-2/海藻酸鈉復合薄膜對LGG的黏附性分析

為進一步考察不同組復合薄膜對LGG的吸附作用，利用不同黨參多糖與海藻酸鈉形成復合薄膜，間接驗證巰基化黨參多糖對LGG的黏附性。由式(5)計算不同樣品組對LGG的黏附率，實驗結果見圖6。由圖6可見，BLK組、CPP-2組和C-CPP-2組對LGG均有一定的黏附作用，但巰基化修飾后的黨參多糖sC-CPP-2對LGG的黏附率最大，表明sC-CPP-2聚合物與LGG之間的相互作用更強，對LGG有更強的黏附作用，這與2.2和2.3的實驗結果一致。

不同小寫字母表示組間差異顯著。

同時，本研究還利用激光共聚焦顯微鏡對LGG在不同復合薄膜上的黏附情況進行了觀察，結果見圖7。由圖7可見，sC-CPP-2/海藻酸鈉組薄膜上吸附的LGG顯著多于海藻酸鈉組、CPP-2/海藻酸鈉組和C-CPP-2/海藻酸鈉組，說明sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜對LGG有較強的黏附作用。染色的LGG在sC-CPP-2薄膜上的熒光強度高于其他組復合膜，進一步證實了LGG對sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜的黏附性最強。此外，CPP-2/海藻酸鈉薄膜在浸水后分解，而sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜在浸水后保持完整，表明二硫鍵增強了膜的機械強度。sC-CPP-2可能通過其與黏液和益生菌的雙重黏附作用，在腸黏膜中起到橋梁作用，從而將益生菌保留在腸黏膜中。

圖7 激光共聚焦表征不同黨參多糖/海藻酸鈉復合膜對LGG的黏附性

2.5 sC-CPP-2與腸道黏液黏附性分析

2.5.1流變學測量結果

利用流變儀分析CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液的相互作用關系，實驗結果見圖8。由圖8(a)和圖8(b)可見，在1 Hz的頻率下，腸道黏液與CPP-2、C-CPP-2混合物的損耗模量G″均大于儲能模量G′，表明混合物呈現(xiàn)黏性占優(yōu)勢的稀溶液性質(zhì)，具有典型黏性流體特征。圖8(c)顯示，sC-CPP-2與腸道黏液的G′ 和G″在檢測時間內(nèi)出現(xiàn)了相交，混合物逐漸趨近于彈性占優(yōu)勢狀態(tài)，說明sC-CPP-2與腸道黏液之間通過二硫鍵形成了具有黏彈性的凝膠網(wǎng)絡，修飾過的黨參多糖與腸道黏液的相互作用更強。CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液混合物的表觀黏度如圖8(d)。圖8(d)中，在0.01～100.00 s-1增速剪切過程中，3種混合物的表觀黏度均隨剪切速率的升高而降低，sC-CPP-2樣品的表觀黏度高于C-CPP-2樣品和CPP-2樣品，說明sC-CPP-2與腸道黏液的相互作用較強。

圖8 腸道黏液與CPP-2、C-CPP-2、sC-CPP-2混合液的動態(tài)流變學特性和表觀黏度分析

2.5.2拉伸實驗測量結果

利用經(jīng)典拉伸實驗，記錄各組樣品從腸道表面分離時的分離力及黏附功的變化，實驗結果見圖9。由圖9(a)可知，sC-CPP-2與黏液之間獲得的分離力[(101.82±5.78) mN]是C-CPP-2與黏液之間獲得的分離力[(71.54±4.60) mN]的近1.5倍，是CPP-2黏液之間獲得的分離力的2倍[(49.53±3.90) mN]。由圖9(b)可知，sC-CPP-2的黏附功[(120.07±6.81) μJ]明顯高于C-CPP-2[(77.60±4.99) μJ]和CPP-2[(51.39±3.90) μJ]，再次證實了sC-CPP-2與黏液之間的黏合力最強。

不同小寫字母表示組間差異顯著。

3 討 論

在腸道微生態(tài)失衡時，可通過食用外源性益生菌補充劑來重塑腸道菌群，改善疾病病癥[26]。一般情況下，由于外源性益生菌腸道黏附性弱，與腸道固有菌群相比競爭力差，很多研究者將目光轉(zhuǎn)向高黏附菌株的篩選。蔡紅英[27]利用Caco-2細胞黏附實驗從11株植物乳桿菌中篩選出具有降脂黏附性良好的植物乳桿菌FRT4和FRT10。占萌[28]從12株植物乳桿菌和2株耐久腸球菌中篩選出具有高黏附作用的嗜酸乳桿菌KLDS1.10901。然而，菌株篩選工作量大，且較難篩選出黏附特性好的理想菌株。如何在調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道健康的同時，增加益生菌的腸道黏附作用，成為當前研究熱點。

黨參多糖具有益生元特性，可與益生菌結合促進宿主微生態(tài)調(diào)節(jié)，從而防治疾病[26]。巰基化修飾多糖可增強多糖的生物黏附性。前期實驗結果表明，CPP-2可促進益生菌增殖，但經(jīng)修飾后是否會影響CPP-2的益生特性還需驗證。通過預實驗發(fā)現(xiàn)，C-CPP-2和sC-CPP-2對益生菌的增殖作用與CPP-2無顯著差異，說明對CPP-2進行羧甲基化和巰基化修飾并不會改變其對益生菌的增殖作用；且CPP-2經(jīng)過羧甲基化修飾之后，紅外光譜結果證實，修飾后的C-CPP-2仍保留多糖的結構特征。Li等[16]對羊肚菌多糖的羧甲基化和Wang等[11]對青錢柳多糖的羧甲基化也得到了與本研究相似的結果；尤其是在羧甲基化的衍生物中發(fā)現(xiàn)了多糖的特征峰，說明C-CPP-2雖然被成功羧甲基化，但并未顯著改變其分子結構。因此，對CPP-2進行羧甲基化和巰基化修飾并不會改變其對益生菌的增殖作用。未來將利用微膠囊技術使益生菌和巰基黨參多糖共包埋，構建小鼠急性結腸炎模型，進一步探究益生菌微膠囊對結腸炎的緩解作用，為實現(xiàn)益生菌在結腸內(nèi)的增殖和黏附定植提供可能。

4 結 論

為構建益生菌與腸道黏液連接的橋梁，本研究對前期制備所得黨參多糖CPP-2進行羧甲基化與巰基化修飾，得到sC-CPP-2；采用體外腸道黏附實驗及與海藻酸鈉形成的復合膜，檢測sC-CPP-2對LGG和腸道黏液的黏附作用，并利用流變學和經(jīng)典拉伸實驗進行驗證。結果顯示，sC-CPP-2中巰基含量為(279.50±5.97) μmol/g，且處于巰基和羧基共存狀態(tài)。sC-CPP-2/LGG能和黏液之間形成黏附作用，且sC-CPP-2與黏液之間的黏合力最強。sC-CPP-2能增加LGG的腸道黏附性，延長LGG在腸道內(nèi)的停留時間，促進LGG的腸道黏附定植。希望本研究能夠為解決外源性益生菌腸道黏附性差、定植難等問題提供參考。