張 悅， 關(guān)樺楠， 劉曉飛， 劉樹萍， 崔琳琳， 宋 巖

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150028)

膽固醇是一種廣泛存在于質(zhì)膜中的甾體成分，也是膽汁酸、維生素D和激素等活性成分的前體物質(zhì)，是人體所必需的營(yíng)養(yǎng)成分[1]。血液中的膽固醇水平卻與許多疾病密切相關(guān)，例如當(dāng)血液中的膽固醇濃度處于高水平時(shí)，血管會(huì)發(fā)生堵塞，若血液中的膽固醇濃度處于低水平時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致貧血、甲狀腺功能亢進(jìn)和營(yíng)養(yǎng)不良等疾病。因此，靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的膽固醇含量對(duì)疾病的預(yù)防具有重要意義。目前，膽固醇的常規(guī)檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜法[2]、比色法[3]、熒光法[4]和電化學(xué)法[5]等。其中，應(yīng)用電化學(xué)法檢測(cè)食品中膽固醇的含量具有高效、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。例如Alagappan等[6]構(gòu)建了基于金納米顆粒- 功能化多壁碳納米管- 聚吡咯/膽固醇氧化酶(Au-f-MWCNT-PPy/ChOx)的膽固醇電化學(xué)生物傳感器，其中聚吡咯納米材料作為支撐矩陣來維持膽固醇氧化酶的活性。Wu等[7]基于分層技術(shù)，成功開發(fā)了一種由水溶性聚乙烯亞胺還原氧化石墨烯(PEIrGO)復(fù)合材料和膽固醇氧化酶(ChOx)組成的新型電化學(xué)檢測(cè)膽固醇平臺(tái)。發(fā)現(xiàn)利用分層技術(shù)，ChOx可以良好地嵌入PEIrGO多層膜中。Jayanthi等[8]制備了一種新型的基于菊粉的納米復(fù)合材料TiO2-MWCNT@Inulin，將ChOx固定化到納米復(fù)合材料中，并修飾于玻碳電極上，用于膽固醇的檢測(cè)。這些電化學(xué)檢測(cè)膽固醇的方法依賴于天然膽固醇氧化酶的活性，然而，天然酶在極端條件下穩(wěn)定性差、易變性失活，對(duì)環(huán)境變化高度敏感、易影響催化效率，使其應(yīng)用受到限制[9]。

相較于天然酶易于失活的性質(zhì)，人工合成的具有類酶活性的材料代替天然酶引起了廣泛的關(guān)注。其中，金屬有機(jī)框架(metal organic frame，MOF)被認(rèn)為是模擬酶的理想材料[10]。金屬有機(jī)框架是由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體通過配位鍵自組裝而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米雜化材料[11]。MOF中的金屬團(tuán)簇或金屬離子一般為過渡金屬離子和鑭系離子，而有機(jī)配體通常含有吡啶和氰基、冠醚、多胺、膦酸鹽、羧酸鹽等官能團(tuán)，這些官能團(tuán)在MOF中起連接金屬離子的橋梁作用[12]。近年來，金屬有機(jī)框架作為模擬酶的研究愈加得到廣泛的關(guān)注，與天然酶相比，其具有成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于貯存和活性可調(diào)等的明顯優(yōu)勢(shì)[13]。然而，與其他復(fù)合的金屬有機(jī)框架相比，單金屬有機(jī)框架的酶活性較低且不易顯現(xiàn)。因此，本研究將在單金屬有機(jī)框架的基礎(chǔ)上增加其他納米材料制備復(fù)合金屬有機(jī)框架以提高其酶活性。在眾多納米材料中，F(xiàn)e3O4磁性粒子和金納米粒子均具有類過氧化物酶的活性[14-15]，將二者加入到金屬有機(jī)框架中可提高復(fù)合納米粒子的類過氧化物酶的活性。此外，F(xiàn)e3O4作為一種生物相容性磁性材料，可以通過磁鐵對(duì)其進(jìn)行回收并可重復(fù)利用[16-17]。金納米粒子可通過調(diào)諧信號(hào)放大和加速電子轉(zhuǎn)移，大大增強(qiáng)了電化學(xué)傳感器的靈敏度和選擇性[18-19]。因此，將Fe3O4磁性粒子和金納米粒子與金屬有機(jī)框架結(jié)合而成的納米粒子復(fù)合材料兼具這些材料的所有優(yōu)點(diǎn)，可以更加廣泛地進(jìn)行應(yīng)用。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4磁性粒子和金納米粒子具有良好的類過氧化物酶活性以及催化性能，因此選擇其加入金屬有機(jī)框架之中[20-22]。

本研究將Fe3O4磁性粒子和過渡金屬銅離子(Cu2+)分散于對(duì)苯二甲酸(p-phthalic acid，PTA)形成的二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，形成具有磁性的銅基金屬有機(jī)框架(Fe3O4@Cu- MOF)，并將金納米粒子(Au Nanoparticles，AuNPs)嵌入其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，制備出具有酶活性的金屬有機(jī)框架模擬酶(Fe3O4@Au/MOF)。由于協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)e3O4@Au/MOF綜合了Fe3O4納米粒子(Fe3O4nanoparticles，F(xiàn)e3O4NPs)和AuNPs的雙重催化性能，使其具有增強(qiáng)型的類過氧化物酶活性。此外，由于Fe3O4NPs的磁性核心具有較大的表面自由能和強(qiáng)磁偶極矩的相互作用，可以重復(fù)的回收利用，減少利用成本，然而彼此之間也容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，降低催化活性。同樣地，金納米粒子之間也會(huì)發(fā)生聚集，從而阻礙了金納米粒子之間的勢(shì)能或電子轉(zhuǎn)移過程。AuNPs具有高比表面積、優(yōu)異的表面改性能力和高穩(wěn)定性等獨(dú)特的模擬酶性質(zhì)，已成功地在許多電化學(xué)反應(yīng)中用作有效的電催化劑[23]。利用空間效應(yīng)，將二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的金屬有機(jī)框架作為支撐基底可以減少金屬合成過程中的結(jié)塊現(xiàn)象來克服納米顆粒自身的不足，有助于提高其催化活性。金屬有機(jī)框架作為有效的電活性材料，具有快速傳質(zhì)和優(yōu)異電子轉(zhuǎn)移的納米厚度、極高百分比的暴露活性表面以及易于識(shí)別和可調(diào)的原子結(jié)構(gòu)和鍵合排列的獨(dú)有特性[24]。而過渡金屬銅的參與使得金屬有機(jī)框架不僅具有這些優(yōu)點(diǎn)，而且更加的穩(wěn)定，不易被破壞。因此由Fe3O4NPs、AuNPs和銅基金屬有機(jī)框架組成的Fe3O4@Au/MOF復(fù)合納米材料具有較高的穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的過氧化物酶活性。Fe3O4@Au/MOF可使膽固醇氧化為膽甾烯三酮和過氧化氫(H2O2)，而H2O2在模擬酶的催化下產(chǎn)生的具有氧化活性的羥基自由基(·OH)促進(jìn)了3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而增加了體系中電荷的移動(dòng)?；诖嗽?，構(gòu)建出了Fe3O4@Au/MOF模擬酶增強(qiáng)型電化學(xué)膽固醇檢測(cè)體系。希望本研究可為食品中膽固醇的檢測(cè)技術(shù)的更新和無酶型傳感器的構(gòu)建提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋酸、醋酸鈉、乙醇，遼寧馥源化工有限責(zé)任公司；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；膽固醇，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；FeCl3·6H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮，攻碧克新材料科技(上海)有限公司；N,N-二甲基甲酰胺，漯河豫博生物化工有限公司；硫酸銅，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；對(duì)苯二甲酸，成都?xì)W恩瑞思化學(xué)試劑有限公司；氯金酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鈉，上海宏瑞化工有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

黃油，內(nèi)蒙古蒙牛奶酪有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ- 3200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FC- 204型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；PHS- 3C型pH計(jì)，上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司；CHI660E型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；HWS- 24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ- QA型全溫恒溫?fù)u床，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；YH- 1019型水熱反應(yīng)釜，河南豫華儀器科技有限公司；DHG- 9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司；Nicolet- iS20型傅里葉紅外光譜，蘇州英蒔特儀器科技有限公司；LVEM5型透射電子顯微鏡，QUANTUM量子科學(xué)儀器貿(mào)易(北京)有限公司；EscaLab Xi型X射線光電子能譜儀，英國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1金屬有機(jī)框架模擬酶的制備和表征方法

采用改良的綠色還原法制備金納米粒子。取20 g切碎的新鮮橙皮在80 ℃去離子水中浸泡1 h，然后將濾液3 500 r/min離心5 min，用去離子水稀釋上清液，得到橙皮備用溶液，并在4 ℃下保存。將預(yù)冷到4 ℃的20 mL氯金酸放入燒杯中，在磁力攪拌器下攪拌均勻，快速加入5 mL橙皮備用溶液。隨著攪拌速度的不斷提高，體系的顏色由黃色變?yōu)榫萍t色。當(dāng)顏色在30 min內(nèi)沒有變化時(shí)，反應(yīng)完成，即可以得到金納米粒子溶液。

將2 g合成的Fe3O4納米微粒加入10 mL乙醇中，并置于搖床中振蕩30 min后，再依次加入3 g的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、20 mL乙醇和45 mL的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)，并進(jìn)行45 min的超聲處理，之后，向其中加入10 mL濃度為0.05 mol/L的二價(jià)銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 g的對(duì)苯二甲酸粉末，并在搖床中振蕩充分反應(yīng)30 min，將經(jīng)過振蕩處理的混合溶液置于水熱反應(yīng)釜中，在200 ℃的高溫下反應(yīng)6 h，再用乙醇和蒸餾水對(duì)混合溶液進(jìn)行多次洗滌，直至洗滌水變?yōu)榍宄?，最后將洗滌干凈的金屬有機(jī)框架(Fe3O4@Cu- MOF)置于干燥箱中干燥至恒重。將Fe3O4@Cu- MOF超聲分散于5 mL的蒸餾水中后，加入5 mL的金納米粒子溶液并置于搖床中振蕩6 h，再加入10 mL濃度為0.1 mol/L的硼氫化鈉水溶液，超聲震蕩45 min，最后用蒸餾水進(jìn)行洗滌，干燥至恒重得到Fe3O4@Au/MOF二維磁性金屬有機(jī)框架。采用傅里葉紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)以及X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)對(duì)其結(jié)構(gòu)和表觀形貌進(jìn)行分析。

1.3.2金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)方法

將不同質(zhì)量的Fe3O4@Au/MOF粉末(0.002 5、0.005、0.007 5、0.010 0 g和0.012 5 g)分別加入不同pH值(4、5、6、7和8)的10 mL的HAc- NaAc緩沖溶液中混勻，并將其置于不同的恒定溫度(20、30、40、50℃和60 ℃)，加入400 μL濃度為1 mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(采用乙醇溶解膽固醇粉末)，充分反應(yīng)15 min后，再加入200 μL的10 mmol/L的TMB溶液，并采用不同掃描速率(0.02、0.04、0.06、0.08 V/s和0.10 V/s)的電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)。監(jiān)測(cè)氧化峰電流的絕對(duì)值，并將其作為體系指標(biāo)，指標(biāo)越大越好。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)方法

分別考察反應(yīng)Fe3O4@Au/MOF添加量(A因素)、溫度(B因素)、掃描速率(C因素)和pH值(D因素)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系的影響，每種因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平(根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出)，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。采用電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)，利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry,CV)檢測(cè)體系中的膽固醇濃度，監(jiān)測(cè)氧化峰電流絕對(duì)值的變化，并確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

1.3.3金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)檢測(cè)膽固醇工作曲線的構(gòu)建

按照優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出的最適金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系對(duì)不同濃度(0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 mmol/L和1.500 mmol/L)的膽固醇進(jìn)行檢測(cè)，以膽固醇的濃度為橫坐標(biāo)，以氧化峰電流絕對(duì)值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并計(jì)算最低檢測(cè)限和回收率。

1.3.4金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)檢測(cè)膽固醇的抗干擾性研究

為驗(yàn)證電化學(xué)體系在檢測(cè)過程中的抗干擾性能，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下向電化學(xué)檢測(cè)體系中分別加入濃度為50 mmol/L的乳糖、甘氨酸、半胱甘酸、葡萄糖、Cu2+、Na+和K+常見干擾物質(zhì)，觀察氧化峰電流絕對(duì)值的變化，對(duì)其抗干擾性能進(jìn)行評(píng)估。

1.3.5實(shí)際樣品的檢測(cè)研究

為了探討構(gòu)建的電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系在實(shí)際樣品中的可行性，選擇黃油作為樣品進(jìn)行膽固醇的檢測(cè)。準(zhǔn)確稱取1 g黃油于燒杯中，并加入10 mL的2 mol/L氫氧化鉀和10 mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混合后將其置于60 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱1 h(加熱過程中不斷攪拌)。皂化完全后，冷卻至室溫，在分液漏斗中用乙醚萃取3次，將收集的萃取液中的乙醚揮發(fā)回收后，加入10 mL乙醇溶液溶解并定容作為待分析樣液，利用所得到的最佳檢測(cè)體系對(duì)其中的膽固醇含量進(jìn)行檢測(cè)。然后將配置好的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液加入黃油待分析樣液中，使加標(biāo)濃度分別為0.25、0.50、1.00 mmol/L。按照膽固醇最優(yōu)電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系分別檢測(cè)3種不同濃度樣品溶液的氧化峰電流絕對(duì)值，代入工作曲線回歸方程，測(cè)定其加標(biāo)回收率并評(píng)價(jià)檢測(cè)體系的準(zhǔn)確度和精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)平行，統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)樣品重復(fù)分析3次，采用Microsoft Excel、SPSS和Origin進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬有機(jī)框架模擬酶的表征

首先，對(duì)自組裝法制備的磁性金屬有機(jī)框架模擬酶(Fe3O4@Au/MOF)進(jìn)行了紅外光譜分析，見圖1。根據(jù)圖1可知，位于500～750 cm-1的吸收峰是Fe—O鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；位于1 000～1 250 cm-1的吸收峰是醇羥基中C—O鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；位于1 625 cm-1處是一級(jí)酰胺的特征吸收峰，是由于N—H的彎曲振動(dòng)所產(chǎn)生的，由此也證明了該金屬有機(jī)框架具有氨基；與此同時(shí)，在2 250～2 750 cm-1的兩個(gè)吸收峰是由于醛基質(zhì)子的費(fèi)米共振產(chǎn)生的伸縮振動(dòng)而引起的；位于3 750～4 000 cm-1的吸收峰是酚羥基—OH鍵中O—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的。

圖1 Fe3O4@Au/MOF的紅外光譜表征

其次，利用透射電子顯微鏡對(duì)制備的Fe3O4@Au/MOF的大小及分布情況進(jìn)行了表征，見圖2。圖2顯示了不同分辨率下Fe3O4@Au/MOF金屬有機(jī)框架的TEM圖像。由圖2可知，該納米微粒的平均粒徑為8～15 nm，從圖中可以看出，由表面粗糙的分散球組成的大團(tuán)簇的直徑約為600 nm。

圖2 Fe3O4@Au/MOF的透射電子顯微鏡表征

采用XPS進(jìn)一步對(duì)Fe3O4@Au/MOF復(fù)合材料的組成進(jìn)行分析，見圖3。由圖3可知，在XPS中，3組主要峰分別為Fe 2p、Au 4f和Cu 2p。Fe 2p的高分辨率XPS光譜包含兩個(gè)結(jié)合能值，分別為710.55 eV和724.32 eV，這兩個(gè)結(jié)合能值分別代表雙峰的Fe 2P3/2和Fe 2P1/2，這和Fe3O4磁性粒子的特征表現(xiàn)一致。在93.55 eV處可以觀察到Au 4f區(qū)域的光譜，這表明了AuNPs在體系溶液中保持著金屬狀態(tài)[25-26]。932.52 eV處可以觀察到Cu 2p區(qū)域的光譜，這與金屬Cu的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合能相符合[27]。

圖3 Fe3O4@Au/MOF的XPS表征

2.2 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)1.3.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果見圖4。

2.2.1.1 掃描速率的影響

在考察掃描速率對(duì)電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系影響的過程中，不僅要篩選出合適的水平，還要鑒定其與電流的線性關(guān)系。由圖4(a)可知，隨著掃描速率的增加，體系中的氧化峰電流絕對(duì)值明顯上升，且氧化峰電流絕對(duì)值與掃描速率之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=112.4x+3.374，R2=0.995 8。這是由于體系中的電子轉(zhuǎn)移過程受控于擴(kuò)散效應(yīng)，掃描速率增加，電子轉(zhuǎn)移速率隨之增大，電化學(xué)響應(yīng)增加，從而氧化峰電流絕對(duì)值增高。因此，選取掃描速率為0.06、0.08、0.10 V/s參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最為適合。

2.2.1.2 pH值的影響

由圖4(b)可知，當(dāng)pH=4時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)的Fe3O4@Au/MOF模擬酶催化活性最為顯著，同時(shí)在較酸性的溶液中含有大量的質(zhì)子，并與膽固醇分子中的—OH基團(tuán)相互作用[28]，從而促使大量電子進(jìn)行轉(zhuǎn)移，電化學(xué)響應(yīng)增加。當(dāng)pH處于5～8時(shí)，隨著pH不斷地增加，氧化峰電流絕對(duì)值呈現(xiàn)顯著的下降的趨勢(shì)，這可能是由于體系中的質(zhì)子隨著pH的增加而不斷減少，而質(zhì)子參與體系中的氧化還原反應(yīng)[29]。因此，體系中的電子轉(zhuǎn)移量減少，從而電化學(xué)響應(yīng)降低，氧化峰電流絕對(duì)值減小。綜上所述，選取pH為4、5和6參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最為適合。

2.2.2.3 金屬有機(jī)框架添加量的影響

由圖4(c)可知，檢測(cè)體系體積為10.60 mL，F(xiàn)e3O4@Au/MOF添加量在0.002 5～0.010 0 g時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值隨添加量的增加逐漸增大。這是由于在電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系中，一方面，隨著Fe3O4@Au/MOF添加量的增加，體系內(nèi)的模擬酶活性也增強(qiáng)，促進(jìn)了膽固醇反應(yīng)產(chǎn)生更多的過氧化氫，并使得過氧化氫產(chǎn)生具有氧化活性的自由基，從而與TMB發(fā)生氧化還原反應(yīng)，增加了電子轉(zhuǎn)移量，進(jìn)而增加電流響應(yīng)，氧化峰電流絕對(duì)值上升。當(dāng)Fe3O4@Au/MOF添加量處于0.010 0～0.012 5 g時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值明顯下降，這是由于隨著體系中Fe3O4@Au/MOF添加量不斷地增加，納米粒子發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致復(fù)合納米模擬酶催化活性逐漸降低。綜上所述，F(xiàn)e3O4@Au/MOF添加量在0.010 0 g時(shí)電化學(xué)檢測(cè)效果最優(yōu)。因此，F(xiàn)e3O4@Au/MOF添加量選取0.007 5、0.010 0、0.012 5 g參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最為適合。

2.2.2.4 溫度的影響

為考察溫度對(duì)體系檢測(cè)膽固醇的影響，設(shè)計(jì)了5種溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見圖4(d)。通過圖4(d)可以看出，當(dāng)溫度處于20～30 ℃時(shí)，隨著溫度的增加，反應(yīng)速率增大，電極表面的電子轉(zhuǎn)移數(shù)目增多，電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)，氧化峰電流絕對(duì)值不斷地增大。當(dāng)溫度處于40～60 ℃時(shí)，隨著溫度的增加，溶液中的膽固醇溶解度不斷增加，同時(shí)模擬酶的催化活性也不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致體系的反應(yīng)速率增大，產(chǎn)生大量氧化活性自由基，并與TMB發(fā)生氧化還原反應(yīng)，增加了電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率和電化學(xué)響應(yīng)，因此氧化峰電流絕對(duì)值顯著升高?？紤]其即時(shí)檢測(cè)的實(shí)用性，溫度選取40、50、60 ℃參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最為適合。

圖4 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系的單因素優(yōu)化結(jié)果

2.2.2正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系結(jié)果分析見表1。由表1可知，實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)氧化峰電流絕對(duì)值的影響主次順序由高到低依次為：B(溫度)、A(添加量)、C(掃描速率)、D(pH值)。通過極差分析確定的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案組合為：A3B2C3D1，即在檢測(cè)體系體積為10.60 mL時(shí)，F(xiàn)e3O4@Au/MOF添加量0.012 5 g，反應(yīng)溫度50 ℃，掃描速率0.1 V/s和緩沖液pH=4。雖正交優(yōu)化的結(jié)果與單因素優(yōu)化結(jié)果有些不同，這是由于原則上Fe3O4@Au/MOF添加量越大，催化效率越高，可顯著提高催化膽固醇產(chǎn)生H2O2以及促進(jìn)H2O2產(chǎn)生大量氧化活性自由基的速率，因此Fe3O4@Au/MOF的添加量可為0.012 5 g；對(duì)于體系的酸堿度，膽固醇在較酸的條件下易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，但由于質(zhì)子參與體系反應(yīng)，當(dāng)溶液體系pH值過低存在大量的質(zhì)子時(shí)，則會(huì)影響溶液的體系不利于進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)pH值可選為4；對(duì)于電化學(xué)工作站的掃描速率，本研究團(tuán)隊(duì)之前的實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)掃描速率超過0.1 V/s時(shí)，檢測(cè)體系的穩(wěn)定性會(huì)受到影響，因此掃描速率可選擇0.1 V/s。以最優(yōu)條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，氧化峰電流絕對(duì)值平均值約為21.40 μA。

表1 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)檢測(cè)膽固醇的工作曲線、檢測(cè)限和回收率

選擇一定范圍的已知的膽固醇濃度構(gòu)建其工作曲線，見圖5。由圖5可知，膽固醇濃度在0.001～1.500 mmol/L，與氧化峰電流絕對(duì)值具有良好的線性關(guān)系，工作曲線回歸方程為y=20.640 1x+4.772 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6，計(jì)算檢測(cè)限為2.7 μmol/L。為評(píng)估該體系的檢測(cè)實(shí)用性，在較優(yōu)的檢測(cè)體系下，根據(jù)所得的工作曲線回歸方程，對(duì)膽固醇進(jìn)行回收率的評(píng)價(jià)，計(jì)算其回收率范圍為98.40%～103.25%。結(jié)果表明，在Fe3O4@Au/MOF模擬酶催化的電信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)下，所建立的檢測(cè)方法對(duì)膽固醇具有較高的靈敏度和精密度。

圖5 Fe3O4@Au/MOF電化學(xué)增強(qiáng)體系檢測(cè)膽固醇的工作曲線

2.4 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)檢測(cè)膽固醇的抗干擾性

本研究選取食品中6種常見物質(zhì)作為干擾物質(zhì)，對(duì)體系的抗干擾性能進(jìn)行評(píng)估，見圖6。以濃度為0.5 mmol/L的膽固醇作為參照標(biāo)準(zhǔn)，選取濃度為50 mmol/L的乳糖、甘氨酸、半胱甘酸、葡萄糖、Cu2+、Na+和K+作為干擾物質(zhì)，干擾物質(zhì)的濃度均為膽固醇濃度的100倍。由圖6可知，相較于50 mmol/L的乳糖、甘氨酸、半胱甘酸、葡萄糖、Cu2+、Na+和K+等干擾物質(zhì)，該電化學(xué)增強(qiáng)體系對(duì)0.5 mmol/L的膽固醇表現(xiàn)出顯著的電流響應(yīng)，具有較高的氧化峰電流絕對(duì)值。表明了該電化學(xué)增強(qiáng)體系對(duì)膽固醇的檢測(cè)具有良好的選擇性和抗干擾性能。

圖6 Fe3O4@Au/MOF電化學(xué)增強(qiáng)體系檢測(cè)膽固醇的抗干擾性

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

3種不同膽固醇加標(biāo)濃度的黃油樣品的檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，該增強(qiáng)檢測(cè)體系加標(biāo)回收率分別為93.38%、110.36%和106.46%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.25%、2.52%和1.84%，均小于3%，說明該電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系對(duì)黃油樣品具有良好的加標(biāo)回收率和精密度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品中膽固醇的檢測(cè)。

表2 金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系對(duì)實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率和精密度的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論

納米粒子獨(dú)特的酶活性對(duì)于提高電化學(xué)傳感器的檢測(cè)性能至關(guān)重要，因此本研究制備了一種新型的具有良好的增強(qiáng)型類過氧化物酶活性的Fe3O4@Au/MOF納米復(fù)合材料。在H2O2的存在下，F(xiàn)e3O4@Au/MOF可催化H2O2產(chǎn)生·OH，并進(jìn)一步促進(jìn)TMB被氧化，使得玻碳電極表面的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而體系的電信號(hào)產(chǎn)生響應(yīng)，基于此原理可對(duì)膽固醇進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。此外，基于Fe3O4@Au/MOF納米粒子的電化學(xué)傳感器無需對(duì)電極進(jìn)行修飾，提高了檢測(cè)時(shí)間以及降低了檢測(cè)的難度，從而獲得良好的檢測(cè)穩(wěn)定性和方便性。且該檢測(cè)體系對(duì)共存分子具有較強(qiáng)的抗干擾能力，并成功地應(yīng)用于黃油樣品中膽固醇的測(cè)定，解決了可以實(shí)時(shí)實(shí)地快速檢測(cè)食品中膽固醇含量的實(shí)際問題。希望該檢測(cè)方法為電化學(xué)傳感器的構(gòu)建開辟一條新的途徑，為食品質(zhì)量安全檢測(cè)工作提供一種高效便捷的選擇。