陳大衛(wèi)，程 月，任晨瑜，陳春萌，瞿恒賢，瓦云超，燕憲濤，陳 霞，黃玉軍，張臣臣，關(guān)成冉，鄭英明，顧瑞霞,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.江蘇宇航食品科技有限公司，江蘇 鹽城 224000）

乳桿菌作為人體腸道中的重要益生菌，不僅能夠調(diào)節(jié)機(jī)體腸道的微生態(tài)平衡，還具有提高免疫、抗氧化以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等功能。在發(fā)揮益生作用之前，乳桿菌需經(jīng)過口腔、胃及腸道等一系列的消化應(yīng)激，而口腔中的溶菌酶能夠通過水解-乙酰葡糖胺和-乙酰胞壁酸破壞乳桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，胃中的酸性環(huán)境（pH 2.0～5.0）會(huì)使菌體細(xì)胞中維持正常生理功能的蛋白發(fā)生變性，腸道中的膽鹽（0.1%～0.3%）、胰酶（0.1%）及pH值等也會(huì)導(dǎo)致菌體細(xì)胞相關(guān)蛋白的變性；這些不良環(huán)境不僅會(huì)對(duì)乳桿菌的黏附能力產(chǎn)生較大的影響，更會(huì)造成乳桿菌的損傷甚至死亡。而乳桿菌在腸上皮細(xì)胞上的黏附有助于延長(zhǎng)其在腸道中的停留時(shí)間，加強(qiáng)其與腸上皮細(xì)胞間的信息交流，并通過調(diào)節(jié)腸道菌群、免疫反應(yīng)、代謝產(chǎn)物及抑制腸道病原菌的定植等改善低免疫、過氧化、腹瀉等對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生的不良影響。因此，乳桿菌只有耐受口腔、胃液和腸液等消化道的不良環(huán)境，以較高的活菌數(shù)到達(dá)并黏附在腸道上，才能更好地發(fā)揮其益生作用。

乳桿菌的黏附主要分為2 個(gè)階段，首先由非特異性的物理結(jié)合如疏水相互作用、表面電荷驅(qū)動(dòng)黏附；隨后通過菌株細(xì)胞的表層蛋白、胞外多糖、脂磷壁酸等細(xì)胞壁的組成成分與宿主進(jìn)行特異性黏附。表層蛋白是在菌株細(xì)胞內(nèi)合成后通過信號(hào)肽穿過細(xì)胞膜被分泌到細(xì)胞外，通過與菌體表面的肽聚糖層和磷壁酸結(jié)合發(fā)揮其黏附作用；胞外多糖則是乳桿菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的糖類化合物，根據(jù)與菌體的緊密連接程度可分為黏液多糖和莢膜多糖；而脂磷壁酸主要是與細(xì)胞壁肽聚糖共價(jià)結(jié)合的壁磷壁酸，以及錨定在細(xì)胞膜上的脂磷壁酸。

目前，對(duì)乳桿菌黏附的大部分研究?jī)H分別單獨(dú)考察其在模擬胃腸道環(huán)境下的存活情況和對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附能力；而關(guān)于乳桿菌在依次經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液等連續(xù)消化應(yīng)激后的黏附能力及其表面黏附素變化的研究較少，主要集中在單個(gè)消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附能力的影響，對(duì)于連續(xù)消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附能力的影響仍未知，具體的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制也不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)首先研究乳桿菌在依次經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液等連續(xù)消化應(yīng)激后的存活能力，然后研究其對(duì)腸道的黏附能力以及連續(xù)消化應(yīng)激對(duì)其黏附能力和表面黏附素的影響；最后通過透射電鏡（transmissim electnonic microscopy，TEM）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分別探討連續(xù)消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌表層微觀結(jié)構(gòu)及表層蛋白的影響，以期闡明消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（）m1、LYO、m98、W157、W116、W78，副干酪乳桿菌（）W125、m54、96、m38、m64、m111，發(fā)酵乳桿菌（）56、m91、57、146、147、118來自江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株湖南豐暉生物科技有限公司；大腸桿菌（） CICC10899、沙門菌（）WX29 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、氯化鋰（LiCl）、牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（10～180 kDa）賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；黏蛋白（Type II）上海麥克林生化科技有限公司；高碘酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 生工生物工程（上海）股份有限公司；最小基本培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、丙酮酸鈉溶液、氨基酸溶液、谷氨酰胺添加劑美國(guó)Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋 日本TOMY公司；DNP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Legend mach1.6 R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)塞默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；IC1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 美國(guó)Count Star公司；IX2-ILL100熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；JEM1200EX型TEM日本JEOL公司；HX-2000 SDS-PAGE儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 常用試劑及培養(yǎng)基的配制

模擬唾液：按表1的比例配制模擬唾液緩沖液，加入100 mg/L的溶菌酶溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，0.22 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 模擬消化液成分組成Table 1 Composition of simulated digestion fluids mmol/L

模擬胃液：按表1的比例配制模擬胃液緩沖液，加入3 g/L的胃蛋白酶溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，0.22 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

模擬腸液：按表1的比例配制模擬腸液緩沖液，加入0.1%的胰蛋白酶、0.3%的牛膽鹽溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

MEM完全培養(yǎng)液：77% MEM培養(yǎng)液、20% Clark胎牛血清、1% MEM非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸鈉溶液、1% GlutaMAX谷氨酰胺添加劑，4 ℃貯藏備用。

MRS（De Man, Rogosa and Sharpe）液體培養(yǎng)基：無水乙酸鈉5.0 g，KHPOg7HO 0.2 g，MnSOg4HO 0.05 g，蛋白胨10.0 g，吐溫-80 1 mL，葡萄糖20.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min，放置室溫冷卻后使用。MRS固體培養(yǎng)基則加入15.0 g瓊脂。

1.3.2 乳桿菌的消化應(yīng)激能力

活化后的乳桿菌于8 000h離心10 min，無菌PBS（pH 7.2）洗滌后將菌體沉淀懸浮于模擬唾液中，37 ℃培養(yǎng)5 min，8 000h離心10 min后將菌體沉淀重懸于模擬胃液中，37 ℃培養(yǎng)3 h，8 000h離心10 min后再將菌體沉淀重懸于模擬腸液中，37 ℃培養(yǎng)2 h；每次應(yīng)激后均采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌的活菌數(shù)。

1.3.3 乳桿菌對(duì)黏蛋白的黏附能力

稱取一定量的黏蛋白溶于PBS，配制成1 mg/mL的黏蛋白溶液，取0.5 mL加至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)1 h后4 ℃過夜，然后加入等體積的黏蛋白繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)2 h以彌補(bǔ)空白位點(diǎn)，PBS（pH 7.2）洗滌2 次后，接種0.5 mL 10CFU/mL的菌株，37 ℃培養(yǎng)2 h；再用PBS洗滌2 次以除去未黏附的菌株，加入0.5 mL 5 mL/L TritonX-100溶液，于37 ℃孵育30 min解除已黏附的菌株，用槍頭輕輕刮取收集菌懸液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌的活菌數(shù)，按照式（1）計(jì)算乳桿菌對(duì)黏蛋白的黏附率：

1.3.4 乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

取0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每天換液1 次，培養(yǎng)至單層，無菌PBS洗滌2 次，加入0.5 mL 10CFU/mL的未消化應(yīng)激或消化應(yīng)激后的乳桿菌，37 ℃培養(yǎng)2 h；用無菌PBS洗滌3 次除去未黏附的菌株，加入150 μL 0.25%胰酶消化液后在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中消化3～5 min至Caco-2細(xì)胞完全脫落，再加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌的活菌數(shù)，按照式（1）計(jì)算乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率。

1.3.5 乳桿菌表面主要黏附素的測(cè)定

將0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至單層，分別取10CFU/mL未消化應(yīng)激或消化應(yīng)激后的乳桿菌用無菌PBS洗滌3 次，離心后分別加入5 mol/L LiCl溶液、50 mmol/L高碘酸鈉（NaIO）溶液和2% BSA去除菌株細(xì)胞表層蛋白、多糖和脂磷壁酸；無菌PBS洗滌離心收集菌體，并懸浮至10CFU/mL，接種0.5 mL至Caco-2細(xì)胞單層，37 ℃培養(yǎng)2 h，PBS洗滌3 次除去未黏附的菌株，加入0.15 mL胰酶細(xì)胞消化液，待細(xì)胞完全脫落后加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌活菌數(shù)。按照式（1）計(jì)算乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率，分別去除菌株表層蛋白、多糖和脂磷壁酸等表面黏附素后，測(cè)得黏附率最低的即為該菌株的主要黏附素。

1.3.6 乳桿菌抑制病原菌黏附腸道的能力

取0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至單層，無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次；接種菌株分別研究其通過排除、競(jìng)爭(zhēng)和替代等方式抑制大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的能力。

排除實(shí)驗(yàn)：先接種0.5 mL 10CFU/mL乳桿菌菌懸液和0.5 mL 無菌PBS至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h，無菌PBS洗滌3 次，除去未黏附的菌體；然后再分別加入0.5 mL 10CFU/mL的大腸桿菌或沙門菌和0.5 mL 無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：同時(shí)接種0.5 mL 10CFU/mL乳桿菌菌懸液和大腸桿菌或沙門菌至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)2 h。替代實(shí)驗(yàn)：先接種大腸桿菌或沙門菌和無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h，PBS洗滌3 次，除去未黏附的病原菌，然后再接種乳桿菌和無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h。

用無菌PBS分別洗滌上述培養(yǎng)后的細(xì)胞和病原菌的共培養(yǎng)物，除去未黏附的病原菌，每孔加入0.15 mL胰酶細(xì)胞消化液消化，待細(xì)胞完全脫落后加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，平板計(jì)數(shù)法于LB培養(yǎng)基中檢測(cè)大腸桿菌和沙門菌活菌數(shù)；每組做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)式（2）計(jì)算乳桿菌對(duì)病原菌的黏附抑制率：

式中：為未接種菌株時(shí)，黏附在Caco-2細(xì)胞上的病原菌活菌數(shù)；為接種菌株后，黏附在Caco-2細(xì)胞上的病原菌活菌數(shù)。

1.3.7 乳桿菌表層蛋白的SDS-PAGE

利用LiCl提取乳桿菌表層蛋白后，4 ℃、8 000h離心10 min收集上清液，得到表層蛋白粗提液，用0.22 μm的無菌親水性微孔濾膜過濾，于4 ℃ 2 000 Da透析袋中進(jìn)行透析，期間多次更換透析液，48 h后將懸濁液于4 ℃、8 000h離心10 min離心收集沉淀，并進(jìn)行冷凍干燥，得到表層蛋白粗提物；用去離子水溶解粗提物，與4×電泳上樣buffer以3∶1（/）比例充分混勻，60 ℃金屬浴30 min后進(jìn)行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，再用乙酸脫色液脫色到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶。

1.3.8 消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌菌體形態(tài)的影響

將消化應(yīng)激前后的乳桿菌1 000h離心5 min，吸去上清液，沿管壁緩慢加入1 mL 2.5%的戊二醛固定液，于4 ℃ 2.5%戊二醛中固定24 h后，用50 mmol/L PBS（pH 7.2）洗滌5 次，加入1%四氧化鋨于不透光環(huán)境中固定2 h，PBS（pH 7.2）洗滌3 次后，分別利用30%、50%、70%及90%的乙醇溶液脫水，然后用90%～100%的丙酮溶液脫水。將脫水后樣品包埋在Spurr低黏度包埋樹脂中，利用TEM進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的消化應(yīng)激能力

將乳桿菌菌體依次懸浮于模擬唾液、模擬胃液及模擬腸液中，37 ℃分別培養(yǎng)2 h后，研究乳桿菌對(duì)模擬消化道的耐受情況，結(jié)果如表2所示。模擬唾液和模擬唾液-胃液的應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)乳桿菌的存活率影響較小，活菌數(shù)下降均小于0.35（lg（CFU/mL）），甚至還促進(jìn)了乳桿菌的生長(zhǎng)；而模擬唾液-胃液-腸液的應(yīng)激對(duì)乳桿菌的存活率影響較大，活菌數(shù)下降了0.96～5.04（lg（CFU/mL）），其中鼠李糖乳桿菌LYO，副干酪乳桿菌W125、m54、m38、m111，發(fā)酵乳桿菌57、146的活菌數(shù)下降較低且存活率顯著高于其他菌株（＜0.05），均分別大于7（lg（CFU/mL））和1.32%，表明這7 株乳桿菌具有較強(qiáng)的耐唾液-胃液-腸液應(yīng)激的能力并能夠以大于10CFU/mL的活菌數(shù)到達(dá)腸道。

表2 乳桿菌的耐消化應(yīng)激能力（n=3）Table 2 Digestive stress tolerance of Lactobacillus (n = 3)

2.2 乳桿菌的黏附能力

將耐消化應(yīng)激能力較強(qiáng)的乳桿菌接種至腸道黏蛋白溶液和Caco-2單層細(xì)胞中，研究菌株對(duì)腸道黏蛋白和Caco-2細(xì)胞的黏附能力，結(jié)果見圖1。7 株乳桿菌的黏附率差異較大，其中副干酪乳桿菌W125、m111和發(fā)酵乳桿菌146對(duì)黏蛋白的黏附率分別為15.67%、8.75%、8.38%，顯著高于其他菌株（＜0.05）；副干酪乳桿菌W125、m111、m38和發(fā)酵乳桿菌146對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率分別為11.47%、21.34%、10.51%及10.44%，顯著高于其他菌株（＜0.05）。

圖1 乳桿菌對(duì)黏蛋白（A）和Caco-2細(xì)胞（B）的黏附能力Fig.1 Adhesion capacity of Lactobacillus to mucins (A) and Caco-2 cells (B)

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)的乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞和黏蛋白之間的黏附呈顯著正相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.64，因此后續(xù)僅通過菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)菌株對(duì)腸道的黏附能力。

圖2 乳桿菌對(duì)黏蛋白和Caco-2細(xì)胞黏附能力相關(guān)性分析Fig.2 Correlation between the adhesion capacities of Lactobacillus to mucins and Caco-2 cells

2.3 乳桿菌抑制腸道病原菌黏附能力

接種黏附能力較強(qiáng)的菌株至Caco-2細(xì)胞單層，研究菌株通過排除、競(jìng)爭(zhēng)和替代的方式對(duì)大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的抑制能力，結(jié)果如圖3所示。3 株乳桿菌均具有抑制大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的能力，分別通過排除、競(jìng)爭(zhēng)和替代方式對(duì)大腸桿菌和沙門菌的黏附抑制率均大于13.51%，其中發(fā)酵乳桿菌146通過排除、競(jìng)爭(zhēng)和替代的方式對(duì)沙門菌黏附腸道的抑制率分別為94.14%、92.53%和95.61%，顯著高于其他菌株（＜0.05）；副干酪乳桿菌W125和m111通過競(jìng)爭(zhēng)方式對(duì)大腸桿菌黏附腸道的抑制率顯著高于發(fā)酵乳桿菌146（＜0.05），而副干酪乳桿菌m111和發(fā)酵乳桿菌146則是通過替代方式對(duì)大腸桿菌黏附腸道的抑制率顯著高于副干酪乳桿菌W125（＜0.05）。

圖3 乳桿菌對(duì)病原菌的黏附抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Lactobacillus on pathogen adhesion to Caco-2 cells

2.4 消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附能力的影響

機(jī)體的消化應(yīng)激會(huì)影響乳桿菌對(duì)腸上皮Caco-2細(xì)胞的黏附能力，菌株在依次經(jīng)過模擬唾液、模擬胃液及模擬腸液應(yīng)激后的黏附率見圖4。模擬唾液-胃液-腸液應(yīng)激顯著降低了副干酪乳桿菌W125和發(fā)酵乳桿菌146的黏附能力（＜0.05），黏附率分別由11.46%和10.43%下降到3.09%和7.35%；但顯著增加了副干酪乳桿菌m111的黏附能力（＜0.05），黏附率由17.60%增加到30.45%。

圖4 消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附能力的影響Fig.4 Effect of digestive stress on adhesion capacity of Lactobacillus

2.5 消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌表面黏附素的影響

利用LiCl、NaIO和BSA分別去除菌株細(xì)胞的非共價(jià)結(jié)合表層蛋白、表面多糖和抑制菌株細(xì)胞的脂磷壁酸研究消化應(yīng)激對(duì)副干酪乳桿菌m111表面黏附素的影響。由圖5可知，副干酪乳桿菌m111在消化應(yīng)激前，經(jīng)LiCl處理后的黏附能力顯著低于未經(jīng)處理的對(duì)照組及NaIO和BSA處理組（＜0.05），表明表層蛋白是菌株m111表面主要的黏附素；當(dāng)菌株m111經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液應(yīng)激后，LiCl和NaIO處理后的黏附能力顯著低于BSA處理（＜0.05），表明菌株m111經(jīng)過消化應(yīng)激后，表層蛋白和多糖是其表面主要的黏附素。

圖5 消化應(yīng)激對(duì)副干酪乳桿菌m111表面黏附素的影響Fig.5 Effect of digestive stress on surface adhesin of L.paracasei m111

2.6 消化應(yīng)激對(duì)菌株表層蛋白表達(dá)的影響

采用BCA試劑盒測(cè)定提取的菌株表層蛋白含量，同時(shí)利用SDS-PAGE研究消化應(yīng)激對(duì)其表達(dá)的影響。由表3可知，在消化應(yīng)激前后，副干酪乳桿菌m111表層蛋白粗提物中均能檢測(cè)到蛋白，表明菌株表面存在蛋白類物質(zhì)；在依次經(jīng)過模擬唾液-胃液消化應(yīng)激后，菌株表層蛋白粗提物中蛋白質(zhì)量濃度為0.70 mg/mL，是未消化應(yīng)激的表層蛋白粗提物的1.56 倍（＜0.05）；依次經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液應(yīng)激后，菌株表層蛋白粗提物中蛋白含量較模擬唾液-胃液應(yīng)激和未經(jīng)消化應(yīng)激顯著降低（＜0.05）。

表3 副干酪乳桿菌m111表層蛋白含量Table 3 Content of surface protein in L.paracasei m111

由圖6可知，在消化應(yīng)激前，副干酪乳桿菌m111在15～120 kDa范圍內(nèi)存在條帶，表明菌株攜帶表層蛋白；在模擬唾液-胃液應(yīng)激后，蛋白條帶的顏色在36～100 kDa范圍內(nèi)加深，同時(shí)在14 kDa出現(xiàn)了新的條帶，表明模擬唾液-胃液的應(yīng)激增加了菌株m111的蛋白表達(dá)；而經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液應(yīng)激后，在15～120 kDa范圍內(nèi)未檢測(cè)到蛋白條帶，14 kDa處的蛋白條帶顏色變淺。

圖6 消化應(yīng)激對(duì)副干酪乳桿菌m111表層蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of digestive stress on surface protein expression in L.paracasei m111

2.7 消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過TEM觀察副干酪乳桿菌m111在依次經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液應(yīng)激后的細(xì)胞形態(tài)變化，并利用TEM粒徑統(tǒng)計(jì)軟件分析消化應(yīng)激對(duì)菌株表層物質(zhì)厚度的影響。由圖7A、B可知，消化應(yīng)激前后副干酪乳桿菌m111的細(xì)胞形態(tài)均為長(zhǎng)梭形和圓潤(rùn)的桿狀；由圖7C、D及表4可知，消化應(yīng)激前后菌株m111的表層厚度無顯著影響（＞0.05），表明消化應(yīng)激對(duì)菌株的形態(tài)及表層物質(zhì)的厚度影響較小。

圖7 消化應(yīng)激對(duì)副干酪乳桿菌m111表層物質(zhì)厚度的影響Fig.7 Effect of digestive stress on the thickness of surface layer in L.paracasei m111

表4 消化應(yīng)激后副干酪乳桿菌m111細(xì)胞的表層物質(zhì)厚度Table 4 Thickness of surface layer in L.paracasei m111 before and after digestive stress

3 討 論

乳桿菌必須能夠經(jīng)受住消化道的應(yīng)激，才能夠到達(dá)腸道并發(fā)揮有益作用，而乳桿菌在經(jīng)過消化道時(shí)，會(huì)激發(fā)各種保護(hù)機(jī)制以抵抗胃酸性環(huán)境、腸內(nèi)膽汁等不良環(huán)境。實(shí)驗(yàn)乳桿菌在暴露于模擬唾液時(shí)，均能保持較高的活性，與Bove等的研究結(jié)果相似，可能是由于實(shí)驗(yàn)菌株的基因被口腔應(yīng)激顯著上調(diào)所致；研究還發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌的存活率均高于100%，表明在短時(shí)間內(nèi)（5 min），鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)口腔中的溶菌酶具有較強(qiáng)的耐受能力；當(dāng)經(jīng)過模擬胃部消化時(shí)，大部分實(shí)驗(yàn)乳桿菌均能保持較高的活性，甚至有些菌株還得到了生長(zhǎng)，這與Mangia等的研究結(jié)果相似，可能是由于實(shí)驗(yàn)乳桿菌在遭受胃部不良環(huán)境的脅迫后能夠通過調(diào)動(dòng)自身質(zhì)子移位膜ATP酶、谷氨酸脫羧酶、精氨酸脫氨酶和脲酶等改善細(xì)胞內(nèi)外的pH值平衡進(jìn)而維持其活性；而Bove及Ouwehand等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳桿菌以牛奶或多糖為載體進(jìn)入腸道時(shí)，能提高其在唾液和胃液中的存活率，表明牛奶等載體能增強(qiáng)乳桿菌對(duì)消化道的應(yīng)激能力。當(dāng)實(shí)驗(yàn)乳桿菌依次經(jīng)過模擬唾液-胃液-腸液消化應(yīng)激時(shí)，大部分實(shí)驗(yàn)菌株的存活率顯著下降（＜0.05），表明連續(xù)的消化過程中胃蛋白酶、pH值、胰酶及膽鹽等不良環(huán)境的應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株活性影響較大。

乳桿菌能夠通過其表面的3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等兼職功能蛋白與腸道中的黏蛋白相結(jié)合實(shí)現(xiàn)其對(duì)腸道的黏附，而其對(duì)腸Caco-2細(xì)胞的黏附不僅可以通過GAPDH等兼職功能蛋白，還可以通過SlpA等表面蛋白及胞外多糖等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)；因此，不同的黏附素及其黏附機(jī)制會(huì)使乳桿菌對(duì)腸道黏蛋白和腸Caco-2細(xì)胞的黏附能力產(chǎn)生差異；同時(shí)，表面蛋白等黏附素的數(shù)量、組成及其功能的不同也會(huì)造成同一種屬不同菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力的差異。乳桿菌表層蛋白在其抑制病原菌黏附腸道的過程中發(fā)揮著重要作用，添加一定量的表層蛋白能提高菌株抑制病原菌黏附的能力；因此，表層蛋白含量的差異可能是副干酪乳桿菌m111抑制大腸桿菌黏附腸道的能力顯著高于副干酪乳桿菌W125的重要因素（＜0.05）。

通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，模擬唾液-胃液應(yīng)激增加了菌株m111在36～100 kDa處的蛋白表達(dá)，而大部分乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量在25～71 kDa之間，表明模擬唾液-胃液的應(yīng)激可能通過刺激菌株m111分泌更多的蛋白至胞外維持菌株的黏附能力，同時(shí)，在14 kDa檢測(cè)到新的蛋白條帶；而在模擬唾液-胃液-腸液的連續(xù)消化應(yīng)激后，菌株在14 kDa的蛋白條帶顏色變淺，15～120 kDa之間的蛋白條帶消失，蛋白質(zhì)量濃度由0.70 mg/mL顯著降低至0.23 mg/mL，表明連續(xù)的消化應(yīng)激不僅會(huì)將菌株m111的表層蛋白降解為更小分子的蛋白，而且還會(huì)顯著降低蛋白含量（＜0.05），進(jìn)而降低乳桿菌黏附腸道的能力；同時(shí)，也容易減弱乳桿菌與大腸桿菌競(jìng)爭(zhēng)腸細(xì)胞表面黏附位點(diǎn)的能力及降低乳桿菌表面物質(zhì)水解大腸桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的能力，導(dǎo)致乳桿菌抑制病原菌黏附腸道能力的下降。雖然連續(xù)消化應(yīng)激顯著降低了菌株m111表層蛋白的含量（＜0.05），但同時(shí)也可能刺激了菌株m111通過啟動(dòng)自身的群體感應(yīng)系統(tǒng)等自我保護(hù)機(jī)制分泌多糖等物質(zhì)至細(xì)胞外增強(qiáng)其對(duì)消化應(yīng)激的耐受性，從而維持了菌株表層物質(zhì)的厚度，使其未發(fā)生顯著變化（＞0.05），其主要黏附素也由應(yīng)激前的表層蛋白變?yōu)閼?yīng)激后的蛋白和多糖；這些物質(zhì)也有助于改善菌株黏附腸道的能力，其黏附能力顯著高于未消化應(yīng)激（＜0.05），而降解產(chǎn)生的小分子蛋白（14 kDa）與分泌的多糖是否有利于菌株抑制病原菌黏附腸道能力提升還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

副干酪乳桿菌W125、m111和發(fā)酵乳桿菌146具有較強(qiáng)的耐唾液-胃液-腸液消化應(yīng)激和腸道黏附能力，并可以通過排除、競(jìng)爭(zhēng)和替代的方式抑制大腸桿菌和沙門菌對(duì)腸道的黏附；消化應(yīng)激顯著降低了菌株W125和146的黏附能力（＜0.05），但顯著提高了菌株m111對(duì)腸道的黏附能力（＜0.05）。因此，副干酪乳桿菌m111是一株潛在的具有較高應(yīng)用價(jià)值的益生菌。該研究為高耐受消化應(yīng)激和高腸道黏附的益生乳酸菌的篩選提供參考，也為消化應(yīng)激對(duì)乳桿菌黏附腸道的影響機(jī)制研究提供理論依據(jù)。