李孟孟，宋英華，劉寶秀，薛 鵬，任 薇，柴文瓊，劉桂芹，朱明霞，王長(zhǎng)法*

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000）

驢（）屬馬屬，是許多國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)家畜，為人類提供皮（主要用于熬制阿膠）、奶和肉類?！疤焐淆埲?，地上驢肉”，不僅贊美驢肉的美味，更表明驢肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特之處。研究表明，與豬、牛和羊肉相比，驢肉不僅肉質(zhì)紅嫩鮮美、纖維細(xì)膩、口感勁道，且蛋白質(zhì)及其必需氨基酸豐富。此外，驢肉中脂肪、膽固醇含量和熱量較低，而多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）含量豐富，深受一些消費(fèi)者喜愛，具有較高的開發(fā)和利用價(jià)值。驢肉是我國(guó)傳統(tǒng)飲食，特色地方驢肉小吃有河間驢肉火燒、保定驢肉卷、東阿驢肉餃子、廣饒臘驢肉、高唐驢肉和南京五香驢肉等。近年來(lái)，驢肉消費(fèi)在我國(guó)越來(lái)越流行，尤其在山東、山西和河北。因此，深入解析驢肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是脂質(zhì)組成，對(duì)驢肉提質(zhì)增效具有重要實(shí)際意義。

研究表明，食物中PUFA在抗炎、降脂和預(yù)防心血管疾病方面發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道驢肉的肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）占2%～4%，且含有較高的單不飽和脂肪酸和PUFA等。另外，IMF是肉品質(zhì)的重要影響因素，與肉的風(fēng)味、多汁性和嫩度直接相關(guān)。因此，研究驢肉IMF的種類、含量、分布以及優(yōu)勢(shì)脂質(zhì)等對(duì)認(rèn)識(shí)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和優(yōu)質(zhì)肉生產(chǎn)具有重要實(shí)際意義。然而，目前缺乏驢肉脂質(zhì)組成的系統(tǒng)報(bào)道，特別是中國(guó)地方特色驢種，如德州驢。德州驢主要分為三粉驢和烏頭驢2 個(gè)品種，在產(chǎn)皮、肉和奶方面表現(xiàn)出巨大潛力。此外，德州驢由于適應(yīng)性和抗病能力強(qiáng)、耐粗飼等特點(diǎn)，在我國(guó)已廣泛飼養(yǎng)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以德州三粉驢和烏頭驢為研究對(duì)象，基于液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法脂質(zhì)組學(xué)對(duì)驢肉脂質(zhì)和脂肪酸組成、差異脂質(zhì)、潛在生物標(biāo)記物和代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在為清晰認(rèn)識(shí)德州驢肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)其肉制品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在山東省聊城市當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶養(yǎng)殖場(chǎng)選擇體質(zhì)量相近、飼養(yǎng)管理一致的2 歲齡左右德州三粉和烏頭公驢各5 頭。全部驢饑餓12 h后被轉(zhuǎn)運(yùn)到當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)（山東東阿天龍食品有限公司），按照常規(guī)屠宰程序進(jìn)行屠宰。屠宰后，取背最長(zhǎng)肌立即置于液氮中速凍，貯存在－80 ℃冰箱中用于脂肪酸組成和脂質(zhì)組學(xué)分析。三粉驢和烏頭驢樣品分別記作SF和WT。

氯仿、甲醇、氫氧化鉀、乙腈和甲酸銨 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；三氟化硼-甲醇溶液 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；CRM47885 37 種C～C混合標(biāo)準(zhǔn)品 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；0.22 μm濾膜 生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙醇 天津祥瑞鑫化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；FD5-3T GOLD-SIM冷凍干燥機(jī) 美國(guó)金西盟國(guó)際集團(tuán)；7890B氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器）、CP7487毛細(xì)管柱（60 mh0.25 mm，0.20 μm）、氣相化學(xué)工作站軟件、1290 LC儀 美國(guó)安捷倫有限公司；Scientz-48高通量組織研磨儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；5305真空濃縮儀、5424冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；Kinetex C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm） 美國(guó)飛諾美公司；TripleTOF 6600 plus MS儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸測(cè)定

肌肉樣品在－80 ℃冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后，使用粉碎機(jī)研磨成肉粉，放在－80 ℃冰箱中備用。樣品總脂質(zhì)提取采用氯仿-甲醇法（2∶1，/），肌肉脂肪酸測(cè)定方法依據(jù)前期研究報(bào)道的方法。脂質(zhì)使用0.50 mol/L KOH-甲醇溶液和15%三氟化硼-甲醇溶液在70 ℃水浴下轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，待氣相色譜分析。進(jìn)樣1 μL，柱烘箱溫度在140 ℃保持5 min，并以4 ℃/min升高到220 ℃，保持10 min。通過(guò)與37 種C～C混合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比鑒定樣品中各種脂肪酸。最后使用氣相化學(xué)工作站軟件對(duì)脂肪酸進(jìn)行分析，各種脂肪酸以占總脂肪酸含量的百分比表示。

1.3.2 LC-MS分析

樣品脂質(zhì)提取前處理依據(jù)前期相關(guān)研究報(bào)道的方法，并稍作修改。取約100 mg樣品于2 mL勻漿管中，加入750 μL氯仿-甲醇混合溶液（2∶1，/）和1 顆3 mm鋼珠，放入高通量組織研磨儀中60 Hz研磨120 s；樣品在冰上提取2 h，每30 min渦旋振蕩30 s；在4 ℃、10 000h離心15 min，所得上清液在真空濃縮至干；樣品溶解于200 μL異丙醇，0.22 μm濾膜過(guò)濾后于－20 ℃冰箱中貯藏備用。

LC條件：C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8 ℃；柱溫55 ℃；流動(dòng)相A：乙腈-水（40∶60，/，含10 mmol/L甲酸銨）；流動(dòng)相B：異丙醇-乙腈（90∶10，/，含10 mmol/L甲酸銨）；流速0.30 mL/min。梯度洗脫程序：0～1.5 min，60% A、40% B；1.5～10.5 min，60%～15% A、40%～85% B；10.5～14 min，15% A、85% B；14～14.1 min，15%～0% A、85%～100% B；14.1～15 min，0% A、100% B；15～15.2 min，0%～60% A、100%～40% B；15.2～18 min，60% A、40% B。

MS條件：電噴霧離子源；正模式進(jìn)樣體積2 μL，負(fù)模式進(jìn)樣體積6 μL；離子源霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi，氣簾氣壓力30 psi，離子源溫度600 ℃，正、負(fù)模式電壓分別為5 000 V和－4 500 V；去簇電位100 V。采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集方法，每個(gè)采集周期包括一個(gè)快速飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometry，TOF MS）掃描（200 ms），然后連續(xù)采集11 個(gè)子離子掃描（每個(gè)50 ms）。TOF MS掃描質(zhì)量范圍為200～2 000 Da，碰撞能量10 eV。子離子掃描范圍100～2 000 Da，碰撞能量（45f25）eV。采用動(dòng)態(tài)背景排除法去除無(wú)必要的MS/MS信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 德州三粉驢和烏頭驢肌肉脂質(zhì)和脂肪酸組成

由圖1可知，將原始數(shù)據(jù)通過(guò)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)/進(jìn)行檢索，2 種驢肉均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子屬于13 個(gè)亞類，包括20.65%（脂質(zhì)分子數(shù)量占比，下同）甘油三酯（triglyceride，TG）、5.91%甘油二酯（diacylglycerol，DG）、0.09%甘油一酯（monoglyceride，MG）、26.64%磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、16.74%磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、7.91%磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、6.41%磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、2.83%磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、1.35%磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、5.83%神經(jīng)酰胺（ceramides，Cer）、4.08%鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、0.26%鞘氨醇（sphingosine，Sph）和0.42%磺胺肽（sulfatide，ST）。分析德州三粉驢和烏頭驢肌肉中主要脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，TG為優(yōu)勢(shì)脂質(zhì)，其次是磷脂（PC、PE、PG和PI）；TG、PC、PE、PG、PI、PS、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）和SM的相對(duì)含量在2 種驢肌肉中均無(wú)顯著差異（＞0.05）；而DG相對(duì)含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢（＜0.001）（圖1B）。另外，脂肪酸C、C和C分別為2 種驢肌肉最主要的飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和PUFA；2 種驢肌肉中脂肪酸C、C、C、SFA、C、C、C、MUFA、C、C、C和PUFA的相對(duì)含量均無(wú)顯著差異（＞0.05）。

圖1 德州三粉驢和烏頭驢背最長(zhǎng)肌脂質(zhì)和脂肪酸組成Fig.1 Lipid and fatty acid profiles in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

2.2 德州三粉驢和烏頭驢肌肉差異脂質(zhì)分子

由圖2可知，OPLS-DA評(píng)估德州三粉驢和烏頭驢肌肉的脂質(zhì)組結(jié)果具有明顯的區(qū)別；置換檢驗(yàn)圖的和截距值在離子模式下分別為（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。如表1所示，共篩選出37 種差異脂質(zhì)分子（VIP＞1和＜0.05），包括5 種TG、8 種DG、10 種PC、6 種PE、2 種LPE、2 種PG、2 種PI、1 種PS和1 種SM；其中三粉驢與烏頭驢相比，32 種上調(diào)，5 種下調(diào)（圖3A）。對(duì)差異脂質(zhì)分子進(jìn)行ROC分析，結(jié)果表明，11 種脂質(zhì)分子的ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）、特異性和敏感性均分別為1、100%和100%（圖3B），包括1 種PC（PC(19:2)）、3 種TG（TG(18:3_18:2_16:0)、TG(16:0_16:0_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）、7 種DG（DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:0)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）；其中三粉驢的PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量顯著低于烏頭驢，而其他9 種脂質(zhì)分子表現(xiàn)為相反的趨勢(shì)（圖3C）。

圖2 德州三驢粉和烏頭驢背最長(zhǎng)肌的脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的OPLS-DA評(píng)估（A）和置換檢驗(yàn)圖（B）Fig.2 OPLS-DA score plot (A) and permutation test plot (B) of lipidomic data of longissimus dorsi of SF and WT donkeys

圖3 德州三粉驢和烏頭驢背最長(zhǎng)肌差異脂質(zhì)分子和潛在脂質(zhì)標(biāo)記物Fig.3 Differential lipid molecules and potential lipid markers in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

表1 德州三粉和烏頭驢背最長(zhǎng)肌差異脂質(zhì)分子的詳細(xì)信息Table 1 Information on differential lipid molecules in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

續(xù)表1

2.3 脂質(zhì)代謝途徑

由圖4可知，37 種差異脂質(zhì)分子主要富集在14 條代謝途徑，包括花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、阿米巴病、癌癥中膽堿代謝、利什曼病、自噬-動(dòng)物、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自噬-其他。其中，獲得5 條與脂質(zhì)代謝最相關(guān)的途徑，包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝。

圖4 德州三粉驢和烏頭驢背最長(zhǎng)肌差異脂質(zhì)分子功能富集Fig.4 Functional enrichment of differential lipid molecules in longissimus dorsi muscle of SF and WT donkeys

3 討 論

關(guān)于驢肉中脂質(zhì)組成的研究甚少，但對(duì)豬、雞、羊肉的研究較多。本研究表明，德州三粉驢和烏頭驢肉均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子，屬于13 個(gè)亞類。這些結(jié)果與豬肉（1 180 種脂質(zhì)）和雞肉（1 127 種脂質(zhì)）脂質(zhì)分子的結(jié)果基本一致，卻遠(yuǎn)多于驢乳中的335 種脂質(zhì)。值得注意的是，驢肉中磷脂分子數(shù)量（680多種）占總脂質(zhì)分子的61.87%，其占比顯著高于豬肉（38.31%）和雞肉（30.90%），這表明驢肉含有豐富種類的磷脂分子。本研究中，德州驢肌肉中TG為優(yōu)勢(shì)脂質(zhì)，占總脂質(zhì)的75%以上，其次是磷脂（PC、PE、PI、PG和PS）；DG相對(duì)含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢，這可能對(duì)于提高肌內(nèi)脂肪沉積具有重要潛力，由于肌內(nèi)脂肪主要由TG和磷脂組成，而DG是合成TG和磷脂的重要中間產(chǎn)物。此外，本研究表明，德州驢2 個(gè)品種肌肉中，脂肪酸C、C和C分別為其最主要的SFA、MUFA和PUFA，與前期報(bào)道的德州三粉驢公驢肌肉具有相似的結(jié)論。然而，三粉驢和烏頭驢肌肉中所有脂肪酸組成均無(wú)顯著差異，這可能是由于2 種驢均屬于德州驢品系，且實(shí)驗(yàn)驢喂食飼料和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

采用OPLS-DA評(píng)估德州三粉驢和烏頭驢肌肉的脂質(zhì)數(shù)據(jù)，二者呈明顯分離。OPLS-DA在建模型時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行指定和分組，所得結(jié)果可能存在過(guò)擬合現(xiàn)象。為進(jìn)一步闡明OPLS-DA評(píng)估的可行性，應(yīng)用置換檢驗(yàn)圖評(píng)估當(dāng)前模型是否過(guò)擬合，和截距值在離子模式下分別為（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。此結(jié)果均符合：所有均低于最右原始；回歸線縱軸截距小于等于0；OPLS-DA未發(fā)生過(guò)擬合。這也證實(shí)基于LC-MS的脂質(zhì)組學(xué)方法適用于驢肉脂質(zhì)組成的全面分析。

通過(guò)VIP＞1和＜0.05，共篩選出37 種差異脂質(zhì)分子；三粉驢與烏頭驢相比，32 種脂質(zhì)上調(diào)，5 種下調(diào)。其中，8 個(gè)DG分子相對(duì)含量在三粉驢中顯著高于烏頭驢，這與DG相對(duì)含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢的結(jié)果一致。這表明差異DG分子對(duì)DG含量起決定作用，在脂質(zhì)分子水平揭示了三粉驢高DG的機(jī)制。DG是生物體內(nèi)脂肪代謝的內(nèi)源中間產(chǎn)物，為脂質(zhì)亞類之一，是多種細(xì)胞活動(dòng)的第二信使，已被證明能加速脂肪酸-氧化，影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)，從而降低血清和肝臟中TG水平，加速脂質(zhì)體內(nèi)代謝。此外，DG協(xié)同增強(qiáng)PS降低膽固醇含量的能力，可用于預(yù)防和輔助治療動(dòng)脈粥樣硬化。本研究共鑒定出65 種DG，三粉驢肌肉富含8 種（脂肪酸組成主要為C、C、C和C），這為驢肉功能脂質(zhì)開發(fā)提供了基礎(chǔ)。為進(jìn)一步篩選區(qū)分三粉驢和烏頭驢肉的脂質(zhì)標(biāo)記物，對(duì)37 種差異脂質(zhì)分子進(jìn)行ROC分析，共計(jì)11 種脂質(zhì)分子AUC均為1，包括1 種PC、3 種TG和7 種DG。三粉驢中2 種TG（TG(18:3_18:2_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）和7 種DG（(DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:00)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）的含量均顯著高于烏頭驢，PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量顯著低于烏頭驢。這為2 個(gè)品種德州驢肉的區(qū)分提供了參考。

基于脂質(zhì)組學(xué)途徑分析發(fā)現(xiàn)，37 種差異脂質(zhì)主要富集在14 條代謝途徑?；ㄉ南┧岽x是最顯著的代謝途徑，其次是甘油磷脂代謝和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。根據(jù)差異脂質(zhì)對(duì)代謝途徑的影響程度，確定甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝是最關(guān)鍵的5 條代謝途徑。這些相關(guān)通路可能與不同品系德州驢肌肉脂質(zhì)代謝差異最相關(guān)。研究報(bào)道，豬肉中脂質(zhì)差異和代謝途徑與豬品種有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。此外，研究表明豬肌內(nèi)沉脂的差異可能由脂肪酸、甘油脂質(zhì)和甘油磷脂代謝途徑差異引起。因此，本研究結(jié)果表明驢品種不同導(dǎo)致肌肉脂質(zhì)代謝途徑差異，引起相關(guān)脂質(zhì)分子含量變化，尤其是DG、PC和PE等。

本研究基于LC-MS脂質(zhì)組學(xué)分析不同品種德州驢肌肉脂質(zhì)組成。在三粉驢和烏頭驢肌肉中均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子屬于13 個(gè)亞類。德州驢肌肉TG為優(yōu)勢(shì)脂質(zhì)，其次是磷脂（PC、PE和PI），且三粉驢肌肉中含有較高的DG。使用生物信息學(xué)篩選出37 種差異脂質(zhì)分子，進(jìn)一步篩選出11 種區(qū)分2 種驢肉的候選生物標(biāo)志物和5 條脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑。本研究深入分析德州驢肉脂質(zhì)組成，在脂質(zhì)分子和代謝水平解析德州驢不同品種肌肉脂質(zhì)的差異，篩選出的差異脂質(zhì)分子和相關(guān)代謝途徑可作為區(qū)分驢肉的潛在生物標(biāo)志物，為清晰認(rèn)識(shí)德州驢肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)其肉制品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。