楊素勤,魏森,張彪*,李煊楨,張玉鵬,馬振華,寧欣杰,魏宏楊
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,鄭州 450002)
施用土壤調(diào)理劑是降低土壤有效態(tài)重金屬含量和作物吸收量的可行措施。在諸多土壤調(diào)理劑中,生物質(zhì)炭的應(yīng)用前景廣闊。生物質(zhì)炭是生物質(zhì)原料在限氧條件下得到的熱解產(chǎn)物,主要通過吸附或螯合等方式來降低重金屬的毒害作用,改善土壤理化性質(zhì)。生物質(zhì)炭可通過土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)以及微生物群落組成等多種機(jī)制的協(xié)同作用影響重金屬有效性。在大田條件中,兩種以上重金屬的復(fù)合污染較為常見,僅施用單一調(diào)理劑難以達(dá)到理想的穩(wěn)定效果,而配施不同調(diào)理劑可解決這一問題。有研究發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)炭和磷酸鹽配合施用對鉛鈍化的效果好于單一施用兩種固化劑。相比于生物質(zhì)炭,含磷物質(zhì)能通過沉淀等方式明顯降低鉛等重金屬的活性。研究證實(shí),含磷化合物可以降低土壤中鉛的生物有效性,鉛可與磷在氯離子存在條件下形成極穩(wěn)定的磷氯鉛礦[Pb(PO)Cl],明顯降低植物對鉛的吸收。磷酸鹽的溶解性是制約其鈍化修復(fù)鉛污染土壤的重要因素,水溶性磷酸鹽能夠有效降低鎘、鉛、鋅等重金屬的生物有效性,研究表明,水溶性磷酸鹽在降低重金屬的生物有效性上效果好于難溶性磷酸鹽。當(dāng)土壤中加入水溶性磷酸鹽時,土壤溶液中形成的PO可以與Cd和Pb形成磷酸鹽沉淀。
土壤微生物對重金屬脅迫的敏感程度大于動植物,因此可用于預(yù)測土壤生態(tài)系統(tǒng)及環(huán)境質(zhì)量的變化,及時反映土壤污染狀況。在重金屬污染土壤中,微生物會在數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)等方面有所響應(yīng)。BRUCE的研究表明,農(nóng)田土壤中過多的重金屬會顯著降低土壤微生物的多樣性。陳兆進(jìn)等通過對新鄉(xiāng)市鎘污染土壤細(xì)菌群落組成及其對鎘固定效果的研究發(fā)現(xiàn),隨著鎘污染的加重,芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬等高效固定重金屬的細(xì)菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢。生物質(zhì)炭可以將微生物吸附到其表面,作為微生物棲息的微環(huán)境,從而減少微生物的生存競爭。姚欽的研究表明生物質(zhì)炭對門水平的真菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響,但是改變了屬水平上真菌群落的結(jié)構(gòu)。通常微生物對土壤環(huán)境變化有很強(qiáng)的敏感性,施磷可改變作物根系生長和養(yǎng)分吸收等過程。向君等的研究表明,施磷能增加干旱脅迫下箭竹根際土壤養(yǎng)分含量和微生物生物量,改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。而短期磷添加顯著增強(qiáng)了土壤微生物對碳源的利用能力,一定程度上提高了土壤微生物群落功能多樣性。通常認(rèn)為,土壤中微生物多樣性越高,其抗環(huán)境脅迫能力和作物生產(chǎn)能力就越強(qiáng)。
試驗(yàn)點(diǎn)位于豫北某地鉛冶煉企業(yè)周邊污染農(nóng)田。該區(qū)域?qū)倥瘻貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候,年平均氣溫14.5℃,年均降水量567.9 mm,土壤基本理化性質(zhì)見表1。土壤pH>7.5,鎘、鉛含量均高于《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618—2018)中規(guī)定的農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值(鎘0.6 mg·kg、鉛170 mg·kg),但低于風(fēng)險(xiǎn)管控值(鎘4.0 mg·kg、鉛1 000 mg·kg),屬于安全利用類耕地。
表1 供試土壤理化性質(zhì)和重金屬含量Table 1 Physical and chemical properties and heavy metal content of the tested soil
土壤調(diào)理劑為磷酸改性稻殼生物質(zhì)炭,pH 5.5,可提取態(tài)磷含量750 mg·kg,鉛含量1.75 mg·kg,鎘含量0.08 mg·kg,比表面積76.6 m·g。每年的施用量為11.19 t·hm。
試驗(yàn)設(shè)置不施用調(diào)理劑的對照(CK)、2015—2016年施用2 a調(diào)理劑后停施(Y)、2015—2017年連續(xù)施用3 a后停施(Y)、2015—2018年連施4 a后停施(Y)、2015—2019年連施5 a后停施(Y),共5個處理,每個處理4次重復(fù)。
為對比土壤調(diào)理劑對環(huán)境質(zhì)量的影響,對所采土壤樣品進(jìn)行高通量測序分析。采集0~20 cm表層土壤充分混勻,部分土壤樣品裝于無菌袋中,用冰塊冷凍保存后帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-80℃冰箱內(nèi),用于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的測定;其余土壤樣品風(fēng)干后研磨過篩,用于土壤理化性質(zhì)的測定。小麥成熟期采集籽粒樣品,帶回實(shí)驗(yàn)室后洗凈、烘干并粉碎。
土壤pH用2.5∶1水土比浸提后使用pH計(jì)測定;堿解氮使用堿解擴(kuò)散法測定;速效磷采用0.5 mol·LNaHCO浸提-鉬藍(lán)比色法測定;速效鉀采用1 mol·L中性NHOAC浸提-火焰光度計(jì)法測定;土壤有效態(tài)鎘、鉛含量用DTPA浸提-原子吸收分光光度法測定;小麥籽粒鎘、鉛含量用HNO-HClO消解后使用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)法測定。
采用高通量測序技術(shù)對土壤樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測,采用引物338F(5'-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3')對細(xì)菌的16S rRNA的V3~V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,采用引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3')對真菌的ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用QuantiFluor-ST藍(lán)色熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量,樣品按照測序要求混合均勻。高通量測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成,數(shù)據(jù)處理借助美吉生物云平臺進(jìn)行。
使用Origin 2018和SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、制圖與統(tǒng)計(jì)分析,Duncan法多重比較檢驗(yàn)各因素處理間的差異顯著性(<0.05)。微生物試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析前按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平處理。主成分分析利用R語言(version 3.3.1)PCoA統(tǒng)計(jì)分析并制圖;群落熱度圖(Heatmap)的軟件及算法采用R語言(version 3.3.1)vegan包的方法;組間差異顯著性檢驗(yàn)分析采用Wilcox秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon rank-sum test);環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析利用R語言vegan包中的RDA分析并制圖。
相比于CK,本研究中改性生物質(zhì)炭的施用均降低了土壤pH,不同處理土壤pH的降幅可達(dá)0.27~0.57;隨著施用年限的延長,土壤pH呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(圖1)。
圖1 調(diào)理劑施用對土壤pH的影響Figure 1 Effect of modifier application on soil pH
與CK相比,施加調(diào)理劑后土壤有效態(tài)鎘、鉛含量均明顯降低(圖2)。其中,有效態(tài)鎘含量最低為0.54 mg·kg,降幅達(dá)到46%,有效態(tài)鉛含量最低為43.5 mg·kg,降幅達(dá)到36%。連續(xù)施用調(diào)理劑2 a后土壤有效態(tài)鎘、鉛含量即顯著降低,之后隨著連續(xù)施用年限的增加降低幅度有所減??;Y處理有效態(tài)鎘含量最低,而Y、Y和Y處理間沒有顯著差異;Y處理土壤有效態(tài)鉛含量最低,Y、Y和Y處理間沒有顯著差異。
圖2 各處理土壤有效態(tài)鎘、鉛含量Figure 2 Contents of soil available Cd and Pb in different treatments
各處理小麥籽粒鎘、鉛含量如圖3所示。與CK相比,施加調(diào)理劑的各處理小麥籽粒鎘含量顯著下降。隨著調(diào)理劑施用年限的增加,小麥籽粒鎘含量呈不斷下降的趨勢,但所有處理下均超出《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》(GB 2762—2017)規(guī)定的限值;Y處理籽粒鎘含量最低,與CK相比降低幅度達(dá)到43%,而Y、Y和Y處理間差異不顯著。對小麥籽粒中鉛而言,所有處理均未超過GB 2762—2017規(guī)定的限值,與CK相比,Y處理籽粒鉛含量未達(dá)到顯著差異,Y處理籽粒鉛含量顯著降低,與CK相比降低幅度達(dá)到35%,而Y、Y和Y處理間差異不顯著。
圖3 各處理籽粒鎘、鉛含量Figure 3 Contents of Cd and Pb in grains in different treatments
各處理細(xì)菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)如表2所示。施用土壤調(diào)理劑對細(xì)菌多樣性的影響大于真菌。對細(xì)菌來說,相比于CK,各處理Shannon指數(shù)均增加,而Simpson指數(shù)則均有所降低,說明土壤細(xì)菌的多樣性增加;Chao指數(shù)、Ace指數(shù)均顯著升高,表明土壤細(xì)菌群落的多樣性及豐富度均增加;但Y、Y和Y處理與Y處理相比并沒有進(jìn)一步增加細(xì)菌多樣性和豐富度。各處理真菌多樣性與CK相比雖有上升,但差異并不顯著。
表2 各處理細(xì)菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of bacteria and fungi in different treatments
主坐標(biāo)分析(PCoA)可以通過對不同微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析,探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。細(xì)菌群落組成相似度越高,在PCoA圖中的距離越近。細(xì)菌和真菌屬水平上PCoA分析結(jié)果如圖4所示,CK處理的微生物種群單獨(dú)分布,與其他處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較大的差異性;而施加調(diào)理劑的4個處理土壤微生物群落組成較為相似。
圖4 屬水平上土壤細(xì)菌和真菌群落PCoA分析Figure 4 PCoA analysis of soil bacterial and fungal communities at genus level
將微生物按樣本間豐度的相似性進(jìn)行聚類,使高豐度和低豐度的物種分塊聚集,呈現(xiàn)群落物種組成及物種的豐度信息,并通過顏色的變化展示細(xì)菌群落組成的相似性和差異性。其中,紅色越深代表豐度越高,藍(lán)色越深代表豐度越低。
各處理豐度前30的細(xì)菌屬群落熱度圖與聚類樹如圖5a所示。其中,、為豐度最高的菌屬,(芽孢桿菌屬)、、(蓋氏菌屬)、(鞘氨醇單胞菌屬)、(鏈霉菌屬)、(節(jié)桿菌屬)和(類諾卡氏菌屬)等菌屬的豐度變化較為明顯。
各處理豐度前30的真菌屬群落熱度圖與聚類樹如圖5b所示。豐度最高的菌屬為(被孢霉屬)、(裂殼屬)、(赤霉菌屬)。與CK相比,、、、和等菌屬的豐度均有所提升,而、、和等菌屬的豐度則明顯降低。
圖5 屬水平上細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及分布Figure 5 Structure and distribution of bacterial and fungal communities at genus level
由于施用調(diào)理劑的成分一致,因此本研究將所有調(diào)理劑處理的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)合并后視為一個處理(CT),與對照(CK)處理進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)分析,基于群落豐度數(shù)據(jù),展示微生物群落中群落豐度差異顯著的前15個菌屬。
細(xì)菌組間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如圖6a所示,與CK相比,施用土壤調(diào)理劑后、、、、、(苔蘚桿菌屬)、(大理石雕菌屬)和等菌屬的豐度顯著降低,、、、(假雙頭斧形菌屬)、、(慢生根瘤菌屬)和等菌屬的豐度顯著升高。
真菌組間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如圖6b所示,與CK相比,(被孢霉屬)、(籃狀菌屬)、、(腐質(zhì)霉屬)、(樹粉孢屬)、(木霉屬)、(瓶毛殼屬)和(綠僵菌屬)等菌屬的豐度顯著升高,而、、、、(帚枝霉屬)、(柄孢殼屬)和等菌屬的豐度顯著降低。
圖6 細(xì)菌和真菌豐度差異顯著物種Figure 6 Species with significant differences in bacterial and fungal abundance
為了進(jìn)一步明確環(huán)境因子影響土壤菌群的驅(qū)動機(jī)制,對屬分類水平的主要細(xì)菌、真菌群落豐度與土壤理化因子進(jìn)行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果如表3所示。在優(yōu)勢細(xì)菌屬中,與土壤有效態(tài)鎘含量呈顯著負(fù)相關(guān);與調(diào)理劑施用年限呈顯著負(fù)相關(guān);與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著正相關(guān),與土壤pH呈極顯著正相關(guān),與調(diào)理劑施用年限呈極顯著負(fù)相關(guān);與調(diào)理劑施用年限呈顯著正相關(guān),與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。在優(yōu)勢真菌屬中,與土壤有效態(tài)鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān),與土壤有效態(tài)鎘含量呈極顯著負(fù)相關(guān);與土壤有效態(tài)鉛含量呈顯著正相關(guān),與土壤pH和有效態(tài)鎘含量呈極顯著正相關(guān),與調(diào)理劑施用年限呈極顯著負(fù)相關(guān);與有效態(tài)鎘含量呈顯著正相關(guān),與土壤pH呈極顯著正相關(guān),與調(diào)理劑施用年限呈顯著負(fù)相關(guān);與調(diào)理劑施用年限呈顯著正相關(guān),與土壤pH和有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān)。
表3 優(yōu)勢菌群與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between dominant microflora and environmental factors
本研究中,施入改性生物質(zhì)炭后,土壤有效態(tài)鎘、鉛含量均顯著降低。施用4 a處理中,土壤pH達(dá)到最低;有效態(tài)鎘含量在施用5 a處理中達(dá)到最低,有效態(tài)鉛含量在施用4 a處理中達(dá)到最低,說明調(diào)理劑的連續(xù)施用可以進(jìn)一步降低重金屬活性。本研究中各處理均降低了作物籽粒中鎘含量,但小麥鎘含量均未達(dá)到GB 2762—2017的限值要求,應(yīng)進(jìn)一步聯(lián)合種植低積累品種等措施來實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)。本研究中所有處理下的小麥籽粒鉛含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn),其中Y處理鉛含量未顯著減少,其他各處理(Y、Y和Y)與CK相比均顯著降低了鉛污染風(fēng)險(xiǎn),但3個處理之間的差異不顯著。
微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)一定程度上反映了生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定,是評價土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。大量研究表明,土壤微生物受土壤理化性質(zhì)和土壤重金屬等環(huán)境因素影響。土壤pH是制約土壤微生物活動和作物生長的主要因素之一,pH過高的土壤不利于作物根系和根際微生物的生長。此外,重金屬可抑制土壤微生物的生長繁殖,對其群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著的影響。向石灰性污染土壤中施用適量的改性生物質(zhì)炭后,部分土壤pH降低,使得土壤中部分細(xì)菌和真菌的豐度增加,同時土壤有效態(tài)鎘、鉛含量降低,從而提升了土壤微生物多樣性,生物質(zhì)炭豐富的孔隙結(jié)構(gòu)為微生物提供了良好的棲息環(huán)境,有利于土壤微生物的定殖,并能有效減少微生物之間的生存競爭;生物質(zhì)炭豐富的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素可以為微生物提供養(yǎng)分來源,提高土壤微生物的活力,促進(jìn)土壤微生物多樣性的恢復(fù)。因此,在重金屬污染土壤中施用改性生物質(zhì)炭可以通過改善土壤理化性質(zhì)為微生物提供生存空間和養(yǎng)分物質(zhì),同時降低土壤重金屬對微生物的毒性。土壤的基本性質(zhì)、重金屬的有效性及改性生物質(zhì)炭的交互作用可對微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接或間接的作用。
本研究發(fā)現(xiàn)各處理中豐度較高的細(xì)菌菌屬均為、和。其中是土壤中常見的豐度較高且具有解磷能力的細(xì)菌類群,其分泌的次生代謝物能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性,具有較強(qiáng)的促生作用。調(diào)理劑的施用改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),土壤中、(假雙頭斧形菌屬)、、(慢生根瘤菌屬)、等細(xì)菌菌屬的豐度顯著提升,(類諾卡氏菌屬)、(苔蘚桿菌屬)、(大理石雕菌屬)等菌屬的豐度則顯著下降。就本研究中豐度顯著增加的菌屬而言,是植物根際的有益細(xì)菌,與土壤有機(jī)質(zhì)的含量密切相關(guān),其能促進(jìn)植物對激素、生物堿及氮的代謝過程;是重要的固氮細(xì)菌,可將大氣中的N固定轉(zhuǎn)化為土壤氮源。本研究中豐度顯著降低的菌屬中,作為一種嗜鹽放線菌,可在極端環(huán)境下生存,與銅、鋅、鎘、砷等重金屬均呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系,其豐度改變可能是對土壤重金屬含量變化的應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明,與是潛在有益菌,可以促進(jìn)作物生長,提高作物抵抗病害的能力,但在本研究中這兩種細(xì)菌豐度均有所下降。與CK相比,各處理(節(jié)桿菌屬)的豐度變化雖不顯著,但可從熱度圖中看出其豐度明顯降低,這與陳兆進(jìn)等的研究結(jié)果一致。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也表明,的豐度與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈極顯著負(fù)相關(guān),的豐度與土壤pH呈極顯著正相關(guān),與調(diào)理劑施用年限呈顯著負(fù)相關(guān)。此外,本研究發(fā)現(xiàn)、、等部分未分類細(xì)菌也與土壤理化因子存在顯著相關(guān)關(guān)系,這些還需進(jìn)一步驗(yàn)證研究。
大多數(shù)真菌在土壤中扮演分解者的角色,在土壤能量傳遞、物質(zhì)循環(huán)等方面具有不同的作用和特性,70%左右的植物侵染性病害都是由真菌引起的。本研究中,土壤調(diào)理劑對真菌的多樣性指數(shù)沒有顯著的影響,這與殷全玉等的研究結(jié)果相似。改性生物質(zhì)炭改變了真菌的群落結(jié)構(gòu),顯著增加了(被孢霉屬)、(籃狀菌屬)、和(腐質(zhì)霉屬)的豐度,同時顯著降低了(赤霉菌屬)、(裂殼屬)和(帚枝霉屬)等菌屬的豐度。本試驗(yàn)豐度顯著增加的菌屬中,是土壤中植物殘?bào)w的重要分解菌,可通過分解植物殘?bào)w提升土壤養(yǎng)分狀況;具有產(chǎn)纖維素酶活性,能夠降解木質(zhì)纖維素,且對植物病原菌有拮抗作用。除此之外,部分可向土壤中分泌揮發(fā)性有機(jī)物,促進(jìn)幼苗生長并增強(qiáng)抗病性;也會產(chǎn)生熱穩(wěn)定性纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶等,具有促進(jìn)纖維素分解的作用。本試驗(yàn)豐度顯著降低的菌屬中,會導(dǎo)致小麥赤霉病,直接降低小麥產(chǎn)量和品質(zhì),最終通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生危害;而能在小麥上廣泛定殖,并產(chǎn)生抑制赤霉病菌的次生代謝物。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明,與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān),與調(diào)理劑施用量呈顯著正相關(guān),但與土壤pH和有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān),與有效態(tài)鎘含量和土壤pH呈顯著正相關(guān),卻與調(diào)理劑施用年限呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)未分類的真菌與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量都存在顯著正相關(guān)關(guān)系。
(1)施用改性生物質(zhì)炭顯著降低了小麥籽粒鎘、鉛含量。與對照相比,連續(xù)施用調(diào)理劑2 a即顯著降低小麥籽粒鎘含量,隨著施用年限的增加,籽粒鎘含量進(jìn)一步降低;施用3 a后小麥籽粒鉛含量與對照相比顯著降低,隨著施用年限的繼續(xù)增加,鉛含量不再顯著降低。施用改性生物質(zhì)炭后,土壤有效態(tài)鎘、鉛含量的變化與籽?;疽恢?。
(2)施用改性生物質(zhì)炭可顯著增加土壤細(xì)菌群落的多樣性及豐富度,但對真菌多樣性的影響較?。幌啾扔谡婢?,生物質(zhì)炭能更大程度減輕鎘、鉛對細(xì)菌的毒害,促進(jìn)污染土壤微生物多樣性的恢復(fù);施用改性生物質(zhì)炭年限不同,多樣性指數(shù)雖有改變,但差異不顯著。
(3)施用改性生物質(zhì)炭顯著提升了細(xì)菌中、和真菌中的豐度;降低了細(xì)菌中、和真菌中、的豐度,在一定程度上改善了土壤生態(tài)環(huán)境。