孫晶，李偉，叢瑞，胡獻(xiàn)剛，歐陽少虎*

（1.生態(tài)環(huán)境部海河流域北海海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)督管理局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與科學(xué)研究中心，天津 300061；2.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室，天津 300071）

近年來，碳基納米材料（Carbon-based nanomaterials，CNs）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)鏈條各環(huán)節(jié)上的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是在納米農(nóng)業(yè)化學(xué)品方面。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）作為一類重要的CNs，因其優(yōu)越的理化性質(zhì)而得到了廣泛的研究和使用，也因此其排放到環(huán)境中的風(fēng)險越來越大。多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類由兩個或兩個以上苯環(huán)按照線性、角狀或者簇狀方式相連組成的中性或非極性揮發(fā)性有機(jī)化合物，是重要的環(huán)境和食品污染物。我國地表水體中PAHs的含量差異很大。例如，長江部分區(qū)域表層水中PAHs的含量為1 630 ng·L，部分地區(qū)水體中的PAHs含量達(dá)到了7 596.56 ng·L。CNs（包括GO）進(jìn)入環(huán)境后可以吸附多種有機(jī)污染物（如PAHs和農(nóng)藥等），二者聯(lián)合毒性可能是協(xié)同的、拮抗的或是抑制的。因此，CNs與環(huán)境中有機(jī)污染物對水生生物的聯(lián)合暴露毒性作用和相關(guān)機(jī)制亟待進(jìn)一步探究和評估。

魚類在人類的生產(chǎn)生活中占有重要地位，而斑馬魚是一種經(jīng)典的環(huán)境毒理學(xué)模式生物，同時也是研究納米材料和PAHs的水生態(tài)毒性的常用模型生物。多環(huán)芳烴受體（AhR）是斑馬魚應(yīng)對PAHs影響的受體之一，可用于PAHs對斑馬魚的毒性評估；細(xì)胞色素P4501A1（CYP1A1）酶的含量是衡量芳烴和類芳烴對生物影響的重要指標(biāo)，其含量和表達(dá)與AhR的活性密切相關(guān)。為考察GO與PAHs對水生生物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，本研究選取環(huán)境中常見的16種PAHs為代表，將環(huán)境預(yù)測濃度的GO與環(huán)境當(dāng)量濃度PAHs同時暴露于成年斑馬魚21 d，對暴露后斑馬魚腦組織的AhR活性、CYP1A1酶水平結(jié)合代謝組學(xué)進(jìn)行研究，從內(nèi)源代謝物層面深入闡述GO和PAHs復(fù)合暴露對成年斑馬魚腦組織毒性的影響，為全面評估GO在環(huán)境中的潛在毒理效應(yīng)提供技術(shù)方法和理論參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GO與PAHs的購置與配制

由已有研究可知，0.01 mg·L和0.1 mg·L的GO濃度更接近其環(huán)境濃度，故本研究中，斑馬魚成魚暴露的GO濃度選取0.01 mg·L和0.1 mg·L；參考近年來我國地表水體中各種不同PAHs的平均濃度，同時考慮到進(jìn)行低濃度亞急性毒性效應(yīng)測試（21 d），因此選擇了較低的斑馬魚成魚的暴露PAHs（16種優(yōu)控PAHs混標(biāo)）濃度，即每種PAHs的濃度均為5μg·L。GO和PAHs母液的具體配制過程如下：稱取50.00 mg GO加入到1 L濃度為60 mg·L的天然海鹽水中，冰浴超聲30 min，得到分散性較好的50 mg·LGO母液；PAHs在水中溶解度低，因此使用二甲基亞砜（DMSO）作為助溶劑，且為了使各暴露組中DMSO的最終濃度小于0.01%（質(zhì)量比），配制5 mg·LPAHs混標(biāo)溶液母液（即16種優(yōu)控PAHs中每種PAHs的濃度均為5 mg·L），用移液器準(zhǔn)確量取0.1 mL含有16種優(yōu)控PAHs的混標(biāo)溶液（濃度為2 000 mg·L）溶于39.9 mL DMSO中。在進(jìn)行21 d斑馬魚成魚毒性暴露實驗時，將上述配制得到的GO和PAHs母液用60 mg·L的天然海鹽水稀釋得到所需濃度。

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)與毒性暴露

1.2.1 斑馬魚的飼養(yǎng)

本研究暴露生物為6～8月齡AB型野生斑馬魚成魚，飼養(yǎng)于配備循環(huán)水泵的30 L水箱中，飼養(yǎng)水為60 mg·L天然海鹽水，水溫為（28±1）℃，光照程序為10 h黑暗/14 h光照。使用商業(yè)魚飼料（寸金，中國）進(jìn)行飼養(yǎng)，每天投喂兩次，投喂量以斑馬魚1 min內(nèi)吃完為宜。

1.2.2 斑馬魚毒性暴露實驗

開始暴露前，將斑馬魚置于人工氣候箱（博訊，SPX-400IC，中國）進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)，氣候箱溫度、光照程序以及喂食均與飼養(yǎng)環(huán)境一致。在兩周的適應(yīng)期結(jié)束后，36條健康且體型相近的斑馬魚被隨機(jī)分成6組，分別為對照組（CK）、0.01 mg·LGO暴露組（GO01組）、0.1 mg·LGO暴露組（GO1組）、5 μg·LPAHs暴露組（PAHs組）、0.01 mg·LGO＋5 μg·LPAHs復(fù)合暴露組（PAHs-GO01組）和0.1 mg·LGO＋5 μg·LPAHs復(fù)合暴露組（PAHs-GO1組），每組6條斑馬魚。暴露組每組置于相應(yīng)1 L燒杯中，燒杯中水深為（23±2）cm，水溫為（28.0±0.5）℃，光照周期為14 h光照/10 h黑暗。在為期21 d的暴露中，斑馬魚暴露液每隔1 d更換一次。

1.2.3 斑馬魚腦組織的獲取

完成21 d的暴露實驗后，使用3%三卡因（Sigma，99%，美國）對斑馬魚施行安樂死。然后，迅速使用冰冷的生理鹽水清洗斑馬魚，并將其置于解剖盤上進(jìn)行解剖。解剖過程中，迅速取出斑馬魚腦組織，使用冰冷的生理鹽水清洗干凈后裝入潔凈滅菌的離心管中，置于冰上備用。若當(dāng)時不使用組織，則將其置入液氮中3 min使其固定，固定后樣品存儲于-80°C冰箱備用。

1.3 GO和PAHs復(fù)合暴露對斑馬魚腦AhR活性和CYP1A1酶的影響實驗

將對照組和暴露組的斑馬魚腦組織轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入200 μL冰冷的生理鹽水，使用電動組織勻漿器將組織勻漿2 min，制成斑馬魚腦組織勻漿。將斑馬魚腦組織勻漿使用冷凍離心機(jī)在4℃、4 000 r·min條件下離心5 min，吸取上清液備用。斑馬魚腦組織AhR活性和CYP1A1酶的含量使用酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒（上海哈靈，中國）測定。測試過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，樣本為斑馬魚腦組織生理鹽水勻漿上清液。斑馬魚腦組織勻漿上清液蛋白質(zhì)含量由BCA蛋白試劑盒（南京建成，中國）測定，測定過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 斑馬魚腦組織代謝組學(xué)的分析

將暴露組和對照組的腦組織清洗完畢后迅速置入液氮中，3 min后將樣品取出，置于液氮上的潔凈研缽中將組織研磨成粉末后進(jìn)行代謝物提取，每個濃度包含3個平行樣品。代謝物提取過程：（1）在研磨好的樣品中加入5 mL提前保存于-20 °C中的提取混合溶液Ⅰ（甲醇-氯仿-水，體積比2.5∶1∶1）；（2）微波輔助萃取，40℃、30 min，萃取完成后離心，收集上清液，然后加入5 mL提前保存于-20℃中的提取混合溶液Ⅰ（甲醇-氯仿-水，體積比2.5∶1∶1），微波輔助萃取，40℃、15 min；（3）收集第二次上清液，并與第一次收集的上清液混合于15 mL離心管中，加入500μL滅菌后的去離子水，4 000 r·min離心5 min；（4）將離心管靜置，上層溶液是甲醇/水相，下層為氯仿相。甲醇/水相冷凍干燥，氯仿相用氮氣吹干；（5）樣品干燥后，采用兩步法進(jìn)行衍生化：①加入50μL用吡啶溶解的甲氧氨基鹽酸鹽（20 mg·mL），密封、渦旋、短暫離心，30℃溫浴90 min；②加入80μL硅烷化試劑N-甲基-N-（三甲基硅烷）-三氟乙酰胺（MSTFA），37℃溫浴30 min；（6）轉(zhuǎn)移已衍生化的樣品至適合氣相色譜質(zhì)譜儀（GC-MS）分析的內(nèi)襯管中。

衍生化后的斑馬魚代謝物使用GC-MS（6890A/5977A，Agilent，美國）分析。氣相色譜進(jìn)樣參數(shù)：進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣口溫度230℃，調(diào)整分流進(jìn)樣模式（1∶50），載氣為氦氣，流速2 mL·min，使用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣。氣相色譜參數(shù)：MDN-35毛細(xì)管色譜柱（30 m），溫度程序為80℃恒溫2 min，然后以15℃·min的速率升溫到330℃，持續(xù)6 min，傳輸線（Transfer Line）溫度設(shè)定為250℃。質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度設(shè)定為250℃，質(zhì)量掃描范圍/為70～600，采集速率為每秒掃描20次，質(zhì)譜電子轟擊源燈絲開啟時間在色譜溶劑延遲170 s后，檢測器電壓為1 700～1 850 V，質(zhì)譜虧損設(shè)置為0，燈絲偏置電流為70 V，儀器自動調(diào)諧。譜圖解卷積參數(shù)：力可公司自帶的商業(yè)軟件Chroma TOF，基線消除（Baseline Offset）設(shè)置為1（0.5～1）；譜圖平滑（Smoothing）為5數(shù)據(jù)點（3～7），峰寬（Peak Width）3 s（3～4 s）；信噪比S/N（Signal-Tonoise Ratio）為10（2～15）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的實驗組均設(shè)置3個或3個以上生物重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。所得實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，當(dāng)＜0.05時，認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。斑馬魚腦組織代謝物數(shù)據(jù)采用均一化處理（其中未檢出的代謝物使用0代替），以減小因數(shù)量級差距帶來的系統(tǒng)誤差。使用軟件MeV 4.9繪制代謝物熱圖，同時將篩選出的代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P11.5軟件包進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)先用無監(jiān)督統(tǒng)計模型主成分分析（Principal components analysis，PCA），得出對照組和暴露組之間代謝物的離散趨勢。斑馬魚腦組織的差異代謝物：當(dāng)某暴露組（GO1、PAHs和PAHs-GO1組）的一種代謝物峰面積平均值與同一對照組代謝物峰面積平均值比值＞1.50時，則該代謝物為顯著上調(diào)代謝物；當(dāng)比值＜0.67時，則該代謝物為顯著下調(diào)代謝物。將上述篩選出來的差異性代謝產(chǎn)物輸入至代謝分析網(wǎng)站（http：//www.metaboanalyst.ca/），點擊Pathway Analysis中（zebrafish）（KEGG）進(jìn)行斑馬魚腦組織代謝通路變化分析。數(shù)據(jù)條形圖和線圖均使用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚腦組織AhR活性和CYP1A1酶含量的變化

如 圖1a所 示，與CK組 相 比，GO01、PAHs和PAHs-GO01組均未引起斑馬魚腦組織AhR活性的顯著變化（＞0.05）。GO1組和PAHs-GO1組的AhR受體活性與CK相比顯著下降（＜0.05），但兩暴露組之間差異并不顯著。如圖1b所示，斑馬魚腦組織CYP1A1酶的含量表明，除PAHs處理組，GO01、GO1、PAHs-GO01和PAHs-GO1組暴露的斑馬魚腦組織中CYP1A1含量都出現(xiàn)了顯著性（＜0.05）的下降。其中，GO1組斑馬魚腦組織中CYP1A1酶含量的下降最為顯著，該結(jié)果與斑馬魚腦組織AhR活性結(jié)果趨勢類似。

圖1 斑馬魚腦組織AhR活性和CYP1A1酶含量分析Figure 1 Zebrafish brain AhR activity and CYP1A1 enzyme content analysis

2.2 斑馬魚腦組織代謝組學(xué)的變化

本研究共檢測出32種代謝物，包含10種氨基酸（如色氨酸、脯氨酸和纈氨酸等）、16種小分子酸和脂肪酸（如蘋果酸、硬脂酸和花生四烯酸等），以及6種其他小分子代謝物（如蔗糖、肌醇和膽固醇等），其相對含量可用代謝物熱圖（圖2a）表示。代謝物熱圖分析結(jié)果表明，經(jīng)GO1、PAHs和PAHs-GO1暴露后，斑馬魚成魚腦組織中的代謝物含量與CK組相比有所差異。為進(jìn)一步研究GO1組、PAHs組和PAHs-GO1處理對斑馬魚腦組織代謝組學(xué)的影響區(qū)別，將檢測出的斑馬魚代謝物水平進(jìn)行了PCA聚類分析，結(jié)果如圖2b所示，圖中紅色箭頭的長度指示暴露組與CK組之間的差異程度，與CK組之間差異的大小與箭頭長度成正比。對比GO1、PAHs和PAHs-GO1暴露組PCA分析結(jié)果，可知對斑馬魚代謝物影響最大的組為PAHs組，其次為PAHs-GO1組，而GO1組對斑馬魚腦組織代謝物的影響最小。

圖2 CK組、GO1組、PAHs組和PAHs-GO1組斑馬魚腦組織代謝物以及代謝物PCA分析Figure 2 Metabolites and their PCA analysis of zebrafish's brain tissues in CK，GO1，PAHs，and PAHs-GO1 groups

本研究將暴露組與CK組代謝物含量比值＞1.50或＜0.67分別視為顯著性上調(diào)或者下調(diào)代謝產(chǎn)物，以此為標(biāo)準(zhǔn)，可以獲得GO1組、PAHs組和PAHs-GO1組的顯著差異代謝物的類別、數(shù)量以及上下調(diào)情況，結(jié)果如表1所示。由表可知，在所有處理組中具有最多顯著差異代謝物的是PAHs組，共有26種，其主要組成為：9種下調(diào)氨基酸（如絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸和纈氨酸等）、13種脂肪酸和小分子酸（如檸檬酸、蘋果酸、壬酸和花生四烯酸等）和4種其他下調(diào)小分子代謝物（蔗糖、肌醇、尿素和尿嘧啶）。PAHs-GO1組中的顯著差異代謝物有21種，略少于PAHs組，其中包括6種顯著下調(diào)氨基酸，包括絲氨酸、脯氨酸、賴氨酸和DL-鳥氨酸等；12種脂肪酸和小分子酸，包括檸檬酸、蘋果酸、丙二酸和花生酸等；3種其他下調(diào)小分子代謝物，包括蔗糖、肌酐和尿嘧啶。顯著差異代謝物最少的是GO1組，主要包括4種氨基酸（絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸和DL-鳥氨酸）、9種脂肪酸和小分子酸（如檸檬酸、蘋果酸、癸二酸和十七烷酸等），以及2種其他小分子代謝物（肌醇和尿嘧啶），共15種。由以上結(jié)果可知，所有暴露組的顯著差異代謝物水平排序為GO1組＜PAHs-GO1組＜PAHs組。3個暴露組中的顯著差異代謝物既有相同也有不同，具體表現(xiàn)為：絲氨酸、甘氨酸、DL-鳥氨酸、乳酸、對苯二甲酸和尿嘧啶在3個暴露組中均顯著下調(diào)，而花生四烯酸在3個暴露組中均顯著下調(diào)；蘇氨酸、L-谷氨酸、纈氨酸、4-氨基丁酸、十五烷酸、肌醇和尿素僅在PAHs組中出現(xiàn)了顯著差異；脯氨酸、賴氨酸、丙二酸、蔗糖、壬酸和花生酸6種代謝物在GO1組中不是顯著差異物，而在PAHs組和PAHs-GO1組中均相比于CK有顯著變化；顯著下調(diào)代謝物脯氨酸、賴氨酸、丙二酸和蔗糖在PAHs組中的差異倍數(shù)均大于這5種代謝物在PAHs-GO1組的差異倍數(shù)。

表1 GO1組、PAHs組和PAHs-GO1組顯著差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計Table 1 Statistical number table of metabolites with significant differences in GO1，PAHs and PAHs-GO1 groups

2.3 斑馬魚腦組織代謝通路的變化

根據(jù)本研究中的顯著差異代謝物得到的GO1組、PAHs組和PAHs-GO1組的腦組織顯著變化（＜0.05）的代謝通路見表2。結(jié)果表明，PAHs組擁有最多的顯著差異變化的代謝通路，共8個；GO1組造成了斑馬魚腦組織3個代謝通路的顯著變化，PAHs-GO1組僅引起了2個代謝通路的顯著變化。以上代謝通路結(jié)果與代謝物差異分析結(jié)果（表1）一致。

表2 暴露組顯著變化代謝通路Table 2 The significantly changed metabolic pathways table in the exposure group

3 討論

有報道指出，在高濃度的兩種PAHs作用下斑馬魚幼魚的急性毒性反應(yīng)可通過AhR活性的變化來表現(xiàn)，同時P450抗氧化酶相關(guān)基因和也會受到影響。有研究表明，生物線粒體活性氧的產(chǎn)生與AhR相關(guān)，而活性氧又與生物的氧化損傷密切相關(guān)。本研究中，各處理組AhR活性變化趨勢（圖1a）與CYP1A1酶含量（圖1b）一致，說明兩者之間可能存在正向相關(guān)性。LI等的研究認(rèn)為GO對PAHs引起的水稻根部AhR活性變化有促進(jìn)作用，而本研究中GO1組與PAHs-GO1組的AhR活性與CYP1A1酶含量沒有顯著差異（＞0.05），其原因可能為：與植物根部直接與PAHs和GO接觸不同，成年斑馬魚血腦屏障會降低PAHs和GO對腦組織的影響；PAHs和GO在同一濃度下對不同物種的影響，尤其對動物和植物的影響程度可能不同。

有報道指出，PAHs可以擾亂生物的代謝通路。盡管在本研究中PAHs的暴露濃度明顯小于以往研究，但依然誘發(fā)了大量的脂質(zhì)和氨基酸變化，且代謝組學(xué)對PAHs的響應(yīng)相較于GO更明顯（PAHs組＞PAHs-GO1組＞GO1組，表1和表2）。盡管GO組誘發(fā)的差異變化脂肪酸數(shù)量小于PAHs組，但GO組差異代謝脂肪酸在總差異代謝物中的占比（60%）大于PAHs組（50%），說明在代謝物變化中GO對脂肪酸的影響更大。氧化酶的損傷是GO對生物的重要效應(yīng)之一，其變化也與脂質(zhì)的變化密切相關(guān)。GO1組中CYP1A1酶含量低于PAHs組（圖1b），這與上述暴露組代謝物中脂肪酸的變化趨勢一致。PAHs與石墨烯類納米材料的相互作用可能會改變納米材料表面的性質(zhì)，如SUN等認(rèn)為，PAHs與石墨烯類材料進(jìn)行相互作用時，PAHs會填充還原GO之間的孔隙，而納米材料的結(jié)構(gòu)和表面官能團(tuán)也是影響其毒性的重要指標(biāo)。而在本研究中，PAHs-GO1組的顯著差異代謝物的組成與GO組高度相似，說明在本研究濃度下，GO與PAHs對成年斑馬魚的復(fù)合暴露中，GO可能占據(jù)主導(dǎo)地位。但PAHs-GO1組誘發(fā)的顯著差異代謝物數(shù)量已經(jīng)超過了GO組，這可能是由于PAHs并沒有完全被GO吸附，當(dāng)PAHs濃度增大時其可能誘發(fā)的環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險仍不能忽視。

以上結(jié)果說明，在0.1 mg·L的GO與5μg·L的PAHs復(fù)合暴露時，對斑馬魚腦組織AhR活性和CYP1A1酶含量產(chǎn)生毒性效應(yīng)的物質(zhì)主要是GO。相比于單獨暴露的GO組和PAHs組，GO-PAHs復(fù)合暴露中AhR活性（圖1a）和CYP1A1酶含量都要高于GO組（圖1b），且GO-PAHs誘發(fā)的差異代謝通路數(shù)量少于GO和PAHs組（表2），說明PAHs與GO的復(fù)合暴露效應(yīng)為輕微的拮抗效應(yīng)。另外，PAHs誘發(fā)的顯著變化代謝物和代謝通路的數(shù)量和種類都超過了單獨GO暴露組和GO-PAHs復(fù)合組，說明低濃度PAHs水平暴露依然可以誘發(fā)斑馬魚腦組織的代謝毒性。以上結(jié)果提示，不應(yīng)僅根據(jù)常規(guī)指標(biāo)來對聯(lián)合毒性進(jìn)行研究，還應(yīng)結(jié)合更加靈敏的分子手段，對新型污染物與環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性進(jìn)行更為全面的評估和研究。本文研究的是GO與16種優(yōu)控PAHs混標(biāo)對斑馬魚成魚的毒理效應(yīng)的影響，而不同種類PAHs性質(zhì)差別很大，在未來研究中應(yīng)該加強(qiáng)GO與不同單一PAHs的復(fù)合毒性效應(yīng)研究，以加深對GO與不同性質(zhì)PAHs聯(lián)合暴露時的復(fù)合毒理差異的理解。

4 結(jié)論

（1）氧化石墨烯（GO）暴露對斑馬魚腦組織的影響重點在于氧化酶及相應(yīng)過程，而與多環(huán)芳烴（PAHs）的復(fù)合暴露對斑馬魚腦組織的影響側(cè)重于代謝物的變化。

（2）0.1 mg·LGO與5 μg·LPAHs組對斑馬魚腦組織的效應(yīng)與GO組對腦組織的效應(yīng)較為相似，說明該濃度的復(fù)合暴露中GO的作用占主導(dǎo)，但PAHs誘發(fā)的效應(yīng)也不容忽視。

（3）在0.1 mg·LGO與5 μg·LPAHs對斑馬魚腦組織復(fù)合暴露時，PAHs與GO的復(fù)合暴露效應(yīng)為輕微的拮抗效應(yīng)。