沈娛汀，傅昭粵，宋 云，李 娟，方 亮，薛 桐，張 舒，陳麗華

(空軍軍醫(yī)大學(xué)： 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 2航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

現(xiàn)代高性能飛機(jī)具有敏捷的機(jī)動(dòng)能力，能夠在空中順利完成各種復(fù)雜的高難度動(dòng)作。當(dāng)飛機(jī)做盤旋、觔斗和俯沖改出等動(dòng)作時(shí)，飛行員受到由足向頭的加速度作用，稱為正加速度(+Gz)。在飛行過程中正加速度可高達(dá)+9 Gz，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)15～45 s，并可反復(fù)出現(xiàn)[1]，嚴(yán)重威脅飛行安全[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，+Gz的生理影響主要表現(xiàn)為機(jī)體視重增加，內(nèi)臟器官沿慣性力方向發(fā)生移位和變形，血液受慣性力作用向下半身轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致多種生理功能障礙[3-4]。+Gz暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為血液由頭向下半身轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腦血壓下降，使腦部出現(xiàn)缺血缺氧的癥狀。學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級(jí)功能，腦缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力下降。研究表明加速度的改變會(huì)影響腦的相關(guān)功能[5-6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠和大鼠模型中，+Gz刺激會(huì)導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)能力以及記憶力的變化[7-9]。為應(yīng)對(duì)高+Gz暴露所帶來(lái)的不良影響，飛行員會(huì)通過預(yù)先+Gz的暴露訓(xùn)練來(lái)提高其+Gz的耐受能力，進(jìn)而降低執(zhí)行任務(wù)時(shí)高+Gz所帶來(lái)的影響[10]。

既往關(guān)于+Gz影響機(jī)體生理功能的研究較多，但+Gz重復(fù)暴露對(duì)機(jī)體認(rèn)知和心理狀態(tài)影響的研究尚不多見[11]。因此，研究高+Gz重復(fù)暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其相關(guān)機(jī)制尤為重要。本研究以連續(xù)性暴露于+15 Gz條件下的小鼠為研究對(duì)象，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)+15 Gz重復(fù)暴露后小鼠空間學(xué)習(xí)能力、焦慮恐懼心理狀態(tài)和場(chǎng)景性恐懼記憶能力的變化，旨在為進(jìn)一步探究+Gz重復(fù)暴露對(duì)飛行安全的影響提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性6～8周C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)共分為兩組：+15 Gz組(+15 Gz離心15 min/d，連續(xù)7 d)和對(duì)照組(同窩小鼠不進(jìn)行高+Gz離心)，每組各9只。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證編號(hào)：20180101)。

1.2 方法

1.2.1 +Gz暴露 采用動(dòng)物離心機(jī)進(jìn)行+Gz暴露，利用小鼠固定器將小鼠水平固定于離心機(jī)的轉(zhuǎn)臂上，頭部朝向離心機(jī)轉(zhuǎn)臂軸心。+15 Gz組小鼠進(jìn)行+15 Gz暴露，峰值作用時(shí)間為15 min。對(duì)照組小鼠僅放置于固定器中15 min，但不進(jìn)行+Gz暴露。小鼠完成連續(xù)7 d，每天暴露24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，由位于水池正上方的攝像機(jī)記錄每只小鼠的游泳活動(dòng)，使用視頻跟蹤系統(tǒng)用來(lái)收集小鼠運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)，包括逃避潛伏期、游泳距離及在目標(biāo)象限中的總游泳時(shí)間。其中逃避潛伏期和游泳距離用于評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)能力；在目標(biāo)象限中的總游泳時(shí)間用于評(píng)估小鼠的記憶能力。實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段在隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中連續(xù)進(jìn)行6 d，每日訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水中，記錄小鼠從入水到找到水中平臺(tái)并站立其上所需時(shí)間，稱為潛伏期。小鼠找到平臺(tái)后，讓其站立在平臺(tái)10 s。若入水60 s后小鼠仍未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中拖上平臺(tái)，并停留10 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。在第7日撤除平臺(tái)，將小鼠由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中自由探查60 s，記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限(原先放置平臺(tái)的象限)總游泳時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以評(píng)估其記憶保留能力。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用來(lái)反映小鼠對(duì)陌生環(huán)境的探索和伴隨的情緒變化，進(jìn)入曠場(chǎng)這一陌生環(huán)境后，小鼠對(duì)新環(huán)境的恐懼會(huì)使其主要在曠場(chǎng)周邊區(qū)域活動(dòng)，而小鼠的探索特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的動(dòng)機(jī)，因此在中心區(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離及停留時(shí)間能夠代表小鼠的焦慮恐懼情況。場(chǎng)地由一個(gè)方形的黑色有機(jī)玻璃盒子組成(30 cm×30 cm×25 cm)，中心區(qū)域15 cm×15 cm。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，每只小鼠被放入同一個(gè)角落，并在其中適應(yīng)1 min。隨后進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，觀察5 min內(nèi)小鼠的總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離以及中心區(qū)域停留時(shí)間。

1.2.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架由兩個(gè)相對(duì)開臂和兩個(gè)相對(duì)閉臂組成，閉臂的上部是敞開的。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將小鼠從中央?yún)^(qū)域面向閉臂放入迷宮，然后釋放它們自由探索迷宮5 min，并記錄小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)以及總時(shí)長(zhǎng)。由于小鼠天生害怕開闊的空間，因此進(jìn)入開臂的次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)能夠用來(lái)判定小鼠的恐懼和焦慮情緒。

1.2.5 場(chǎng)景性恐懼條件化模型檢測(cè) 僵立為小鼠表達(dá)恐懼的方式，表現(xiàn)為除呼吸外的肢體活動(dòng)均消失，其總的僵立時(shí)間與恐懼記憶的強(qiáng)弱呈正相關(guān)。人們常用僵立時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的百分比來(lái)表示小鼠的恐懼程度。實(shí)驗(yàn)過程共分為適應(yīng)、訓(xùn)練和測(cè)試3個(gè)階段。第1日為適應(yīng)階段，即將兩組小鼠分別放入恐懼箱中適應(yīng)10 min，不加任何處理。第2日為訓(xùn)練階段，訓(xùn)練時(shí)首先將小鼠分別放于恐懼箱中適應(yīng)1 min，隨后間斷給予5次足底電擊(1 s，0.8 mA)，每次間隔60 s，完成后在箱內(nèi)停留1 min放回飼養(yǎng)籠。第3日為測(cè)試階段，訓(xùn)練結(jié)束24 h后將小鼠分別放于恐懼箱中，不給予任何刺激自由活動(dòng)5 min，由圖像自動(dòng)采集系統(tǒng)追蹤記錄小鼠的活動(dòng)及僵立時(shí)間。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均需用750 mL/L乙醇擦拭場(chǎng)地，充分晾干。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

+15 Gz連續(xù)7 d暴露24 h后，我們運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)以及記憶能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是對(duì)照組還是+15 Gz組，小鼠的逃避潛伏期以及游泳距離均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明水迷宮訓(xùn)練有效。與對(duì)照組相比，在訓(xùn)練的第5日和第6日+15 Gz組小鼠的逃避潛伏期和游泳距離明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖1 A～B)，說明+15 Gz暴露后小鼠的空間學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)。此外，在水迷宮訓(xùn)練的第7日通過無(wú)平臺(tái)空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，+15 Gz組小鼠在目標(biāo)象限中的總游泳時(shí)間明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1C)，表明+15 Gz暴露增強(qiáng)了小鼠的記憶能力。圖1D為水迷宮訓(xùn)練時(shí)兩組小鼠的代表性游泳軌跡。以上結(jié)果證實(shí)，持續(xù)的+15 Gz暴露能夠增強(qiáng)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

A：連續(xù)6 d訓(xùn)練中小鼠的平均逃避潛伏期(n=6， bP<0.01 vs對(duì)照組)；B：連續(xù)6 d訓(xùn)練中小鼠的平均游泳距離(n=6， aP<0.05 vs對(duì)照組)；C：小鼠在目標(biāo)象限中的總游泳時(shí)間(n=6， bP<0.01 vs對(duì)照組)；D：水迷宮訓(xùn)練時(shí)兩組小鼠的代表性游泳軌跡(大圓代表水池，綠色圓圈代表隱藏平臺(tái))。圖1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了研究+15 Gz暴露對(duì)于小鼠焦慮和恐懼情緒的影響，我們?cè)谶B續(xù)7 d，每日24 h +15 Gz暴露后對(duì)對(duì)照組以及+15 Gz組小鼠進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。在中心區(qū)域花費(fèi)的時(shí)長(zhǎng)以及總的活動(dòng)距離被用于判定小鼠的焦慮和恐懼狀態(tài)。與對(duì)照組相比，+15 Gz組小鼠處于中心區(qū)域的時(shí)間明顯延長(zhǎng)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)，而其總的活動(dòng)距離無(wú)顯著差異和變化趨勢(shì)(圖2B)。以上結(jié)果表明，持續(xù)的+15 Gz暴露能夠減少小鼠的焦慮恐懼情緒。

A：小鼠在中心區(qū)域花費(fèi)時(shí)長(zhǎng)(n=6， bP<0.01)；B：小鼠的總活動(dòng)距離(n=6)。圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步證明+15 Gz暴露對(duì)于小鼠恐懼和焦慮情緒的影響，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了對(duì)照組和+15 Gz 組小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)以及總時(shí)長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，+15 Gz組小鼠處于開臂的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01，圖3A)，而處于閉臂的時(shí)間與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(圖3B)。此外，在進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)方面，+15 Gz組小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)明顯增多(P<0.01，圖3C)，而進(jìn)入閉臂的次數(shù)則無(wú)顯著差異(圖3D)。這些結(jié)果證明，持續(xù)+15 Gz暴露后能夠顯著減少小鼠的恐懼和焦慮情緒。

A：小鼠進(jìn)入開臂的總時(shí)間(n=6， bP<0.01 vs對(duì)照組)；B：小鼠進(jìn)入閉臂的總時(shí)間(n=6)；C：小鼠進(jìn)入開臂的總次數(shù)(n=6， bP<0.01 vs對(duì)照組)；D：小鼠進(jìn)入閉臂的總次數(shù)(n=6)。圖3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過曠場(chǎng)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的焦慮和恐懼情緒進(jìn)行評(píng)估后，為進(jìn)一步探究小鼠的恐懼記憶能力，我們對(duì)對(duì)照組和+15 Gz組小鼠進(jìn)行了場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)。僵立為小鼠表達(dá)恐懼的行為方式之一，表現(xiàn)為除呼吸外其他的肢體運(yùn)動(dòng)均消失，其總時(shí)長(zhǎng)稱為僵立時(shí)間，僵立時(shí)間的長(zhǎng)短與恐懼記憶的強(qiáng)弱呈正相關(guān)。足底電擊后24 h進(jìn)行場(chǎng)景恐懼記憶檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠相比，+15 Gz組小鼠總僵立時(shí)間以及10 min內(nèi)僵立時(shí)間百分比均顯著降低(P<0.01)，而僵立次數(shù)無(wú)明顯差異(圖4A～C)。表明持續(xù)+15 Gz暴露后小鼠的場(chǎng)景性恐懼記憶能力下降。

A：小鼠的總僵立時(shí)間(n=9， bP<0.01 vs對(duì)照組)；B：小鼠的僵立次數(shù)(n=9)；C：10 min內(nèi)僵立時(shí)間百分比(n=9， bP<0.01 vs對(duì)照組)。圖4 場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

隨著高性能戰(zhàn)斗機(jī)的大量列裝，持續(xù)性+Gz暴露可能誘發(fā)的安全問題已成為航空醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[12]。學(xué)習(xí)和記憶是動(dòng)物和人類賴以生存的重要腦功能，既往研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度+Gz單次或重復(fù)暴露可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)學(xué)習(xí)功能受損和記憶功能障礙，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腦不可逆性損傷[13]。但是有關(guān)+Gz對(duì)于小鼠心理狀態(tài)影響的研究報(bào)道尚不多見。在本研究中，我們通過動(dòng)物離心機(jī)對(duì)小鼠進(jìn)行+15 Gz離心15 min/d，連續(xù)7 d的處理。在完成重復(fù)暴露24 h后，運(yùn)用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究+15 Gz重復(fù)暴露對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶和焦慮恐懼情緒的影響。水迷宮實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的一種方法，通過訓(xùn)練時(shí)的逃避潛伏期和游泳距離判斷小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，利用無(wú)平臺(tái)探索時(shí)在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間評(píng)估小鼠的記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，+15 Gz組小鼠在訓(xùn)練第5日和第6日的逃避潛伏期及游泳距離明顯降低，同時(shí)在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間延長(zhǎng)，表明+15 Gz連續(xù)暴露能夠顯著增強(qiáng)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，在中心區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間和活動(dòng)距離被用于判定小鼠的焦慮狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，+15 Gz組小鼠在中心區(qū)域花費(fèi)的總時(shí)間延長(zhǎng)，而其活動(dòng)距離無(wú)明顯差異，提示+15 Gz連續(xù)暴露能夠減少小鼠的焦慮樣行為。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)主要反映小鼠的恐懼和焦慮情緒，基于小鼠天生害怕開闊空間這一特點(diǎn)，小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)能夠用來(lái)檢測(cè)小鼠的恐懼和焦慮狀態(tài)。結(jié)果顯示，+15 Gz組小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和總時(shí)長(zhǎng)明顯增多，而進(jìn)入閉臂的次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)無(wú)明顯差異，說明+15 Gz連續(xù)暴露能夠減弱小鼠的恐懼和焦慮情緒。在場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)中，僵立時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的百分比常用來(lái)表示小鼠的恐懼程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，+15 Gz組小鼠總僵立時(shí)間和僵立時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的百分比顯著降低，提示+15 Gz連續(xù)暴露能夠降低小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶能力。

在本次實(shí)驗(yàn)中，+Gz對(duì)于機(jī)體學(xué)習(xí)和記憶能力的影響結(jié)果與以往研究報(bào)道結(jié)果有所差異[14-16]。既往研究表明，實(shí)驗(yàn)對(duì)象在高+Gz作用下，其學(xué)習(xí)記憶能力均顯著下降，而本次的研究發(fā)現(xiàn)在+15 Gz連續(xù)暴露7 d后，小鼠在后續(xù)的水迷宮訓(xùn)練中表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)和記憶能力增強(qiáng)，其可能的原因主要有兩點(diǎn)：一是實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同，既往研究中大多采用大鼠作為研究對(duì)象，小鼠和大鼠對(duì)于+Gz的耐受能力不同，小鼠的半數(shù)致死量為20 G，而大鼠的半數(shù)致死量只有10.19 G，小鼠的+Gz耐受能力遠(yuǎn)高于大鼠[17]。以往研究常對(duì)大鼠進(jìn)行+10 Gz暴露，已達(dá)到大鼠的耐受極限[18]。而本次實(shí)驗(yàn)的+15 Gz對(duì)小鼠來(lái)說處于生理耐受范圍之內(nèi)，尚未達(dá)到耐受極限。二是實(shí)驗(yàn)方法不同，既往研究中，對(duì)大鼠進(jìn)行+Gz重復(fù)暴露時(shí)間間隔較短，一般采用1 d之內(nèi)連續(xù)暴露多次，且在暴露完成后即刻開展行為學(xué)檢測(cè)[19-20]。而在本研究中，對(duì)小鼠進(jìn)行+15 Gz暴露15 min/d，連續(xù)7 d的處理，暴露完成24 h后才進(jìn)行心理狀態(tài)的檢測(cè)和與認(rèn)知檢測(cè)相關(guān)的訓(xùn)練工作，這也是造成本研究結(jié)果與既往報(bào)道有所差異的重要原因。

在+15 Gz暴露對(duì)于小鼠心理狀態(tài)影響方面，本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)7 d +15 Gz暴露后小鼠的焦慮與恐懼情緒減弱，同時(shí)其場(chǎng)景恐懼記憶能力下降。分析其原因，可能是由于在給予小鼠正常生理耐受范圍內(nèi)的高強(qiáng)度連續(xù)刺激之后，小鼠對(duì)高強(qiáng)度刺激逐漸適應(yīng)并產(chǎn)生了一定程度的耐受[21]，隨后再對(duì)其進(jìn)行低強(qiáng)度刺激(如高空、曠場(chǎng)和電擊等)時(shí)小鼠心理承受能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出的焦慮及恐懼行為減少，其具體原因及機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。既往研究多數(shù)集中于+Gz暴露時(shí)或暴露后即刻對(duì)認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制，而本次研究發(fā)現(xiàn)小鼠+15 Gz重復(fù)暴露后當(dāng)其再次處于水迷宮建立的危險(xiǎn)環(huán)境中時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠能夠較快地適應(yīng)低強(qiáng)度威脅的挑戰(zhàn)，在訓(xùn)練后期表現(xiàn)出較對(duì)照組顯著優(yōu)異的學(xué)習(xí)和記憶能力，這是否是由于+15Gz重復(fù)暴露后小鼠的焦慮和恐懼狀態(tài)變化所帶來(lái)的繼發(fā)效應(yīng)，也有待于進(jìn)一步研究闡明。綜上所述，本研究結(jié)果表明，一定強(qiáng)度的+Gz重復(fù)暴露刺激對(duì)小鼠的心理和認(rèn)知能力可能存在正性調(diào)控作用，這對(duì)指導(dǎo)相關(guān)訓(xùn)練提供了新的思路與數(shù)據(jù)支撐，具體調(diào)整機(jī)制值得深入研究。