孟東方，李慧英，杜晨陽

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

股骨頭缺血性壞死(osteonecrosis necrosis of the femoral head,ONFH)是由多種原因?qū)е鹿晒穷^內(nèi)部血液供應(yīng)被破壞、股骨頭部位細(xì)胞壞死的病理過程，可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。激素性股骨頭壞死(steriod-inducd avascular necrosis of femoral heard,SANFH)屬非創(chuàng)傷性股骨頭壞死，多由于應(yīng)用激素后引起的股骨頭壞死[1]。骨保護(hù)素(OPG)是一種生長因子受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族。抵制核因子-κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL))可在成骨細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，起到激活破骨細(xì)胞的作用，而OPG 能夠與RANKL相結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞生成。OPG和RANKL所組成的反應(yīng)關(guān)系是骨質(zhì)吸收的共同通路，能夠調(diào)控破骨細(xì)胞分化和骨吸收進(jìn)程，直接影響破骨細(xì)胞功能[2]。中藥淫羊藿所含多種有效成分參與了骨的代謝，抑制破骨細(xì)胞活性是其重要作用之一。西醫(yī)學(xué)研究[3]表明，淫羊藿提取液能夠有效防治激素應(yīng)用后的骨質(zhì)疏松，促進(jìn)血液循環(huán)、降低血液黏稠度。研究[4]表明，骨碎補(bǔ)具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合的作用，能在一定程度上治療激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。補(bǔ)骨脂味辛、苦，性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣、止瀉的功效。川芎的主要作用是活血化瘀、行氣止痛,被視為“血中氣藥”。結(jié)合中醫(yī)整體辨證論治，股骨頭壞死的主要病機(jī)為腎氣虧虛、正氣不足為本，氣滯血瘀為標(biāo)。本課題組選取淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、川芎組成三補(bǔ)一活方，取其補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、行氣血的功效，基于骨保護(hù)素(orthopantomgraphy，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)信號通路探討其治療兔激素性股骨頭壞死的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

清潔級健康成年新西蘭兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量 2.5～3.0 kg，日齡75～90 d，由華蘭生物疫苗有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(豫)2015-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證號為41001700006074。動(dòng)物在河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)場所的使用許可證編號為SYXK(豫)2015-0005。每籠1只，每日定量給予兔飼料和飲用水。室內(nèi)溫、濕度適宜，通風(fēng)良好。喂養(yǎng)動(dòng)物1周，使其適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥品、試劑與儀器

三補(bǔ)一活方處方組成：淫羊藿10 g，骨碎補(bǔ)9 g，補(bǔ)骨脂9 g，川芎6 g。使用四川新綠色顆粒制劑，購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥房。按照《中國藥典》[5]所規(guī)定的每味藥物的用量并結(jié)合人與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用藥配比(人∶兔為1∶15)換算出每日每只動(dòng)物用藥量如下：淫羊藿顆粒4.3 g，骨碎補(bǔ)顆粒3.0 g，補(bǔ)骨脂顆粒4.3 g，川芎顆粒6.4 g。每次灌胃前將以上4味藥物充分混合，加水10 mL溶解后備用。馬血清注射液，南京同鑫林生物科技有限公司提供，批號2018050122；注射用甲波尼龍琥珀酸鈉(500 mg，以C22H30O5計(jì))，河南本草國藥館連鎖有限公司提供，批號2018040709；注射用青霉素鈉(1.96 g，C16H17N2NaO4S計(jì))，山西省芮城縣紅寶獸藥有限責(zé)任公司提供，批號2018050302。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總核糖核酸(RNA)提取試劑盒，均由南京諾唯贊生物科技有限公司提供，批號分別為Q711、R323、RC101；PBS緩沖液、胃蛋白酶、BSA、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、中性樹膠、二抗、DAB顯色劑，均由武漢賽維爾生物科技有限公司提供，批號分別為G0002、G0142、G5001、G1004、G1004、G1040、G1040、GB23303、G1211；anti-OPG 抗體、anti-RANK 抗體，博奧森公司提供，批號分別為BS-20624R、BS-2695R；anti-RANKL 抗體，博士德公司提供，批號為BA1323。LC-96熒光定量PCR儀，美國羅氏公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)5427R、移液器，德國艾本德股份公司產(chǎn)品；C1000 Touch核酸蛋白測定儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；KZ-II梯度PCR儀，武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；DM-BA300數(shù)碼生物顯微鏡，廈門麥克奧迪公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

按照參考文獻(xiàn)[6]制備模型。正常喂養(yǎng)兔1周后，隨機(jī)分為正常組10只和造模組20只。造模組首次使用10 μL/g 馬血清對所有造模組動(dòng)物經(jīng)兔耳緣靜脈注射，常規(guī)飼養(yǎng)3周后，再次注射馬血清，用量為6 μL/g；2周后，造模組動(dòng)物腹腔注射甲波尼龍琥珀酸鈉，用量為45 μg/g，1次/d，連續(xù)3 d。自注射激素第1天起，連續(xù)7 d對造模組動(dòng)物每天腹腔注射10萬單位青霉素以預(yù)防感染。其間對照組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)。造模過程中有2只兔出現(xiàn)死亡，考慮為激素的藥物反應(yīng)所致。采用空氣栓塞法處死造模組及正常組兔各2只，觀察、對比股骨頭組織病理學(xué)形態(tài)，以空骨陷窩比率>15%為激素性股骨頭壞死模型建立成功。

1.4 分組與給藥

將造模組余下的16只兔隨機(jī)分為模型組和三補(bǔ)一活方組，每組8只。另設(shè)正常組8只。三補(bǔ)一活方組給予三補(bǔ)一活方藥液10 mL灌胃，模型組和正常組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8周。

1.5 檢測指標(biāo)

灌胃結(jié)束，每組隨機(jī)選擇6只動(dòng)物以空氣栓塞法處死，取右側(cè)股骨，取中央部位的骨組織，迅速放置于液氮中保存，用于提取蛋白，進(jìn)行免疫組化及PCR檢測。

1.5.1 股骨頭組織中OPG mRNA、RANK mRNA和RANKL mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測。(1)總RNA提?。喝?00 mg液氮凍存組織徹底研磨均勻，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書的流程進(jìn)行。(2)RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：①基因組DNA去除；②配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；③進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)。(3)PCR反應(yīng)：①引物序列見表1；②在qPCR管中配制擴(kuò)增體系；③qPCR反應(yīng)程序設(shè)置。(4)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 引物序列

1.5.2 股骨頭組織中OPG、RANK 和RANKL 蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法檢測。(1)制作石蠟切片：①取材；②脫鈣；③脫水浸蠟；④包埋；⑤切片。(2)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)：①石蠟切片脫蠟至水；②抗原修復(fù)；③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；④血清封閉；⑤加一抗；⑥加二抗；⑦DAB顯色；⑧蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；⑨脫水封片；⑩顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。(3)免疫組化結(jié)果判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。計(jì)數(shù)方法：先在低倍鏡下找切片組織顯色反應(yīng)高密集區(qū),再在高倍鏡(200 ×)下觀察并隨機(jī)取 5 個(gè)視野，結(jié)合免疫組化圖片結(jié)果，將免疫組化圖片導(dǎo)入Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件中，進(jìn)行光密度校正，調(diào)節(jié)濾波處理后進(jìn)行陽性染色的平均光密度分析,得出的結(jié)果取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用Levene檢驗(yàn)對組間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，設(shè)定P>0.05為方差齊性假設(shè)成立；計(jì)量資料多組間比較。若數(shù)據(jù)服從方差齊性的正態(tài)檢驗(yàn)，則選用方差分析；若數(shù)據(jù)服從非正態(tài)分布，則選用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔股骨頭組織中OPG mRNA、RANK mRNA和RANKL mRNA表達(dá)對比

與正常組對比，模型組OPG mRNA表達(dá)量降低，RANK mRNA和RANKL mRNA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比，正常組和三補(bǔ)一活方組OPG mRNA表達(dá)量均升高、RANK mRNA和RANKL mRNA均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組對比，三補(bǔ)一活方組OPG mRNA表達(dá)量降低，RANK mRNA、RANKL mRNA表達(dá)量均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組兔股骨頭組織中OPG mRNA、RANK mRNA、RANKL mRNA表達(dá)對比mean±SD

2.2 各組兔股骨頭組織中OPG、RANK 和RANKL 蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果分析

與正常組對比，模型組OPG呈現(xiàn)低表達(dá)，RANK、RANKL均呈現(xiàn)高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比，三補(bǔ)一活方組OPG呈現(xiàn)高表達(dá)，RANK、RANKL均呈現(xiàn)低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組對比，三補(bǔ)一活方組OPG呈現(xiàn)較低表達(dá)，RANK、RANKL呈現(xiàn)較高表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此與PCR定量檢測數(shù)據(jù)趨勢相同。見表3。

表3 各項(xiàng)指標(biāo)免疫組化檢測結(jié)果分析mean±SD

3 討 論

3.1 激素性股骨頭壞死機(jī)制

目前激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制有各種學(xué)說，包括：脂肪代謝紊亂學(xué)說(包括脂肪栓塞學(xué)說、骨細(xì)胞脂肪變性學(xué)說、骨髓脂肪化學(xué)說)、骨質(zhì)疏松學(xué)說、骨內(nèi)高壓學(xué)說、血管內(nèi)凝血學(xué)說、細(xì)胞毒作用學(xué)說等[7-8]。

糖皮質(zhì)激素可增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性，從而降低骨小梁數(shù)量，減少新骨生成。破骨細(xì)胞的生存時(shí)間及活性隨著激素的應(yīng)用而延長、增強(qiáng)，可導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)及骨微結(jié)構(gòu)的破壞、骨量減少，從而進(jìn)一步引發(fā)骨質(zhì)疏松的出現(xiàn)[9]。研究表明，骨壞死晚期塌陷的出現(xiàn)與骨量減少、骨小梁的易折性增加有著密切聯(lián)系。過量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，股骨頭作為反應(yīng)敏感的解剖部位最易受到影響而引發(fā)骨微結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)骨量減少及骨脆性增加，最終導(dǎo)致股骨頭壞死，甚至塌陷[10]。

3.2 OPG/RANKL/RANK信號通路與破骨細(xì)胞的關(guān)系

成骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌OPG和RANKL。研究發(fā)現(xiàn)， RANK可以被 RANKL結(jié)合，而RANK存在于破骨細(xì)胞膜上，因此RANKL/RANK信號通路能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的活性及成熟分化過程[11]。RANK同樣可以和OPG相結(jié)合。這種競爭關(guān)系將會(huì)對RANKL / RANK 信號通路產(chǎn)生阻斷，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的生成及狀態(tài)[12]。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[13]，而高濃度的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子可使BMSCs抑制破骨細(xì)胞的活性[14]。由此說明，BMSCs 對破骨細(xì)胞活性狀態(tài)有著雙向調(diào)節(jié)能力，而具體調(diào)控方向會(huì)受骨微環(huán)境的影響。

3.3 三補(bǔ)一活方組方要義

該病主要由外邪侵襲、內(nèi)傷七情所致。長期或短期大量應(yīng)用激素可傷津耗氣，易致腎元虧虛，因腎主骨、肝主筋、肝腎同源，腎元虧虛、腎氣失充使氣血生化不足，精髓筋脈失養(yǎng)，不榮則痛；腎氣虧虛久之累及腎陽使其不足，陽虛則寒，發(fā)為怕冷；腎氣不足，納氣無力，氣虛無力行血而致血瘀，血瘀則氣滯，不通則痛；堵塞脈絡(luò)，氣血難行以致筋骨失養(yǎng)可致骨缺血性壞死。此中既有腎陽不足、腎氣不納所致氣血不榮，又有筋脈閉阻氣滯血瘀，屬虛實(shí)夾雜，因虛致實(shí)。

激素性股骨頭壞死病機(jī)是肝腎虧虛、腎陽不足、腎氣不納、筋骨不堅(jiān)為本，氣滯血瘀為標(biāo)。因肝腎同源，所以治則以補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、行氣活血為主。經(jīng)課題組篩選，將淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、川芎進(jìn)行組方。淫羊藿性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，為君藥，有溫腎壯陽之效。骨碎補(bǔ)性溫，味苦，歸肝、腎經(jīng)，為臣藥，有補(bǔ)腎強(qiáng)骨之效。補(bǔ)骨脂性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽之效；川芎性溫，味辛，歸肝經(jīng)，有活血行氣止痛之效。此兩者為佐使之藥。4味藥合用，共奏補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、行氣活血之效。三補(bǔ)指淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂這3味補(bǔ)腎陽藥物，一活指川芎這味活血、行氣藥物。長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可出現(xiàn)肢體水腫等類中醫(yī)陽虛癥狀，故用藥溫補(bǔ)陽行氣利水；大量使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞脂肪樣變，所謂局部血流不暢、氣滯血瘀，故用川芎行氣活血之效加強(qiáng)君藥淫羊藿的作用。

3.4 三補(bǔ)一活方治療機(jī)制探討

三補(bǔ)一活方中淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋壯骨作用，臨床上常被用于治療股骨頭壞死。現(xiàn)代藥理學(xué)分析淫羊藿的組成發(fā)現(xiàn)多種有效成分參與了骨的代謝過程[15]，其中淫羊藿總黃酮(TFE)能夠降低破骨細(xì)胞活性、抑制RANKL與RANK的結(jié)合，減慢巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成[16]。激素能誘導(dǎo)RANK及RANKL的表達(dá)，降低OPG的表達(dá)[17]；而淫羊藿能促進(jìn)OPG的表達(dá)，OPG可與RANKL競爭與RANK結(jié)合，降低破骨細(xì)胞活性從而降低骨質(zhì)疏松的發(fā)生[18]。

補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分包括香豆素、黃酮類、單萜酚類及苯并呋喃類等[19]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂中不同類別化學(xué)成分均有良好的抗氧化作用[20]，并且能抑制破骨細(xì)胞分離、抵制分離后的破骨細(xì)胞形成的陷窩的增加與擴(kuò)張[21]。RANKL可在成骨細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，起到激活破骨細(xì)胞的作用，而OPG能夠與RANKL競爭抑制結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞生成。補(bǔ)骨脂異黃酮可通過抑制RANKL介導(dǎo)的NF-κB通路激活,進(jìn)而調(diào)控破骨細(xì)胞分化并緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[22]。骨碎補(bǔ)有補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨功效，一直都是骨傷科的常用藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，骨碎補(bǔ)所含有的多種成分具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合的作用[23]。另有研究[24-25]表明，雌激素的減少會(huì)誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而應(yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮后可以影響OPG、RANK、RANKL的表達(dá)，提高OPG的表達(dá)，降低RANK、RANKL的表達(dá)，從而進(jìn)一步起到治療骨質(zhì)疏松的作用。

川芎有活血化瘀、行氣止痛作用。研究[26]證實(shí)：川芎通過調(diào)節(jié)抑制血小板源生長因子(PDGF-B)表達(dá)機(jī)制，對AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖產(chǎn)生抑制作用；在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，川芎嗪水平與細(xì)胞增殖活度、PDGF-B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，從而驗(yàn)證了川芎嗪對細(xì)胞的抑制作用。此外，有學(xué)者通過針對損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效果的相關(guān)研究，在一定層面上印證了川芎內(nèi)酯A對損傷的修復(fù)作用[27]。以上表明，川芎可增強(qiáng)三補(bǔ)藥物的藥效。

本研究中，三補(bǔ)一活方組OPG及OPG mRNA含量明顯高于模型組，RANK、RANKL及RANK mRNA、RANKL mRNA表達(dá)明顯低于模型組，且與正常組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明三補(bǔ)一活方可能通過影響OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細(xì)胞生成與功能，從而改善激素性股骨頭壞死的骨質(zhì)疏松癥狀。模型組RANK及RANKL陽性表達(dá)較明顯，三補(bǔ)一活方組表達(dá)弱陽性，呈現(xiàn)降低趨勢；模型組的OPG呈現(xiàn)表達(dá)水平下降，三補(bǔ)一活方組呈現(xiàn)抬高趨勢。此表明，激素沖擊時(shí)股骨頭內(nèi)破骨細(xì)胞活性被激活、OPG分泌減少，三補(bǔ)一活方的干預(yù)可提升OPG分泌量，競爭性抑制破骨細(xì)胞活性，從而降低股骨頭壞死的發(fā)生率。

綜上所述，三補(bǔ)一活方可以通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK通路影響破骨細(xì)胞的活性，并抑制應(yīng)用激素所誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，達(dá)到治療激素性股骨頭壞死的目的；其治療激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制可能存在多樣化、多靶點(diǎn)效應(yīng)。課題組因?qū)嶒?yàn)時(shí)間所限只取幾種中藥進(jìn)行了簡略探索，今后需在廣度及深度上進(jìn)一步完善其作用機(jī)制研究。