孟 麗 朱 艷 徐彥楠 馬 冬 周晨明

河北醫(yī)科大學(xué) 1 電鏡實(shí)驗(yàn)中心 2 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北省石家莊市 050017； 3 華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

腹主動(dòng)脈瘤(Abdominal aortic aneurysm, AAA)是一種常見(jiàn)的老年退行性血管疾病，大多數(shù)AAA患者常無(wú)癥狀，然而瘤體一旦破裂預(yù)后極差，病死率高達(dá)90%，目前其發(fā)病機(jī)制仍不明確，未見(jiàn)有效預(yù)防和治療的藥物[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子KLF5是血管重塑相關(guān)重要因子[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠髓系細(xì)胞KLF5表達(dá)缺失能夠抑制AAA的形成[4]，而細(xì)胞血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)中KLF5表達(dá)缺失將對(duì)AAA的表型產(chǎn)生何種影響尚鮮有研究報(bào)道。因此，本研究采用CaPO4誘導(dǎo)VSMCKLF5-/-小鼠和野生型小鼠(Wild type，WT)AAA模型并對(duì)瘤體組織進(jìn)行病理分析、基因芯片篩查和差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證，探討VSMC中KLF5表達(dá)在早期AAA發(fā)病中的分子機(jī)制，為尋找潛在治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性的C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)分為VSMCKLF5-/-組和WT組。VSMCKLF5-/-組為3只6～8周齡雄性VSMCKLF5-/-小鼠；WT組為3只6～8周齡雄性WT小鼠，均由本實(shí)驗(yàn)室繁殖提供。購(gòu)買血管平滑肌特異性表達(dá)Cre重組酶工具小鼠與引進(jìn)的KLF5flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得Cre-flox/+/KLF5-cre小鼠。再利用Cre-flox/+/KLF5-cre小鼠互相交配，獲得血管平滑肌特異性KLF5基因條件敲除(VSMCKLF5-/-)小鼠。鼠尾采血PCR法鑒定基因型，Western blot證實(shí)血管組織中KLF5表達(dá)的缺失。

1.2 方法

1.2.1 CaPO4誘導(dǎo)小鼠AAA模型[5]:將小鼠進(jìn)行持續(xù)麻醉，無(wú)菌條件下進(jìn)行腹部手術(shù)，暴露腹主動(dòng)脈血管，分離腎動(dòng)脈分支至髂總動(dòng)脈血管，先后包裹浸有CaCl2和PBS的無(wú)紡布條10min和5min，取出布條后用生理鹽水沖洗，縫合。術(shù)后14d，再次以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，剖腹，分離小鼠腹主動(dòng)脈，并測(cè)量腹主動(dòng)脈最大直徑(d2)和瘤旁血管直徑(d1)，以計(jì)算出d2/d1小鼠腹主動(dòng)脈直徑膨脹度，此比值≥2為模型構(gòu)建成功的客觀指標(biāo)。隨后取出腹主動(dòng)脈組織進(jìn)行石蠟包埋和液氮凍存。

1.2.2 蘇木精—伊紅染色(Hematoxylin-Eosin staining):對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行切片，厚度4μm。取主動(dòng)脈瘤部位切片，將切片脫蠟至水。參考試劑盒說(shuō)明書稀釋染液并進(jìn)行染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。采用×50和×400放大倍數(shù)進(jìn)行鏡檢。

1.2.3 血管組織總RNA的提取及mRNA表達(dá)譜的檢測(cè)：剪碎小鼠損傷腹主動(dòng)脈組織，置于RNA-Solv的勻漿套管中勻漿(冰盒中操作)，試劑盒提取總RNA濃度>1μg，OD260/280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)?；蛐酒瑱z測(cè)由康成生物有限公司完成。

1.2.4 差異表達(dá)基因的富集分析：將芯片篩查的Fold Change Absolute>2的全部上調(diào)基因或下調(diào)基因輸入Metascape在線分析網(wǎng)站，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG pathway富集分析，分別得到差異基因在生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分三個(gè)方面的富集分析和KEGG通路富集分析(P值分別設(shè)為0.01和0.05)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：取瘤樣病變血管組織50mg，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑冰浴勻漿，離心取上清，BSA法測(cè)定總蛋白濃度。取蛋白樣品加5×電泳緩沖液，加熱至變性，后凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，一抗采用兔抗Stk3、Rassf4、Wwtr1抗體4℃孵育過(guò)夜(Proteintech)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗孵育，洗脫、發(fā)光，曝光顯色。采用Image J軟件進(jìn)行光密度掃描進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察VSMC中KLF5基因缺失對(duì)AAA的膨脹變化 HE染色結(jié)果顯示VSMCKLF5-/-組和WT組小鼠膨脹度均達(dá)到AAA標(biāo)準(zhǔn)，VSMCKLF5-/-組術(shù)后膨脹度明顯大于WT組(3.25±0.35 VS 2.31±0.27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1～2。

圖1 腹主動(dòng)脈HE染色切片a.WT組(第一張×50, 第二張×400) b.VSMCKLF5-/-組(第一張×50, 第二張×400)

圖2 腹主動(dòng)脈直徑膨脹度測(cè)量結(jié)果與WT組相比，*P<0.01，n=3

2.2 CaPO4損傷小鼠腹主動(dòng)脈組織中mRNA表達(dá)譜分析 mRNA表達(dá)譜前50個(gè)基因表達(dá)差異熱圖分析結(jié)果如圖3所示，排名前10的上調(diào)和下調(diào)差異基因的表達(dá)倍數(shù)見(jiàn)表1。組織芯片結(jié)果顯示：與WT組比較，VSMCKLF5-/-組Hippo信號(hào)通路失調(diào)相關(guān)基因Stk3、Rassf4、Wwtr1分別表達(dá)上調(diào)3.73、2.34、2.06倍。

表1 VSMCKLF5-/-和WT小鼠AAA組織mRNA表達(dá)譜

圖3 CaPO4誘導(dǎo)VSMCKLF5-/-和WT小鼠AAA組織差異表達(dá)基因熱圖分析a.前50個(gè)上調(diào)差異基因表達(dá)的熱圖 b.前50個(gè)下調(diào)差異基因表達(dá)的熱圖

2.3 GO功能和KEGG pathway富集分析 為了探討VSMC中KLF5調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因在AAA形成中的生物學(xué)功能，利用Metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析。分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能主要富集在轉(zhuǎn)錄共激活因子活性、細(xì)胞骨架重塑等。下調(diào)差異表達(dá)基因的學(xué)功能主要富集在前體代謝產(chǎn)物和能量的產(chǎn)生等。為了篩查VSMC中KLF5調(diào)節(jié)相關(guān)基因參與AAA形成中的信號(hào)通路，筆者對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathway分析，結(jié)果如圖4所示：上調(diào)差異基因KEGG分析中，Hippo信號(hào)通路富集最為顯著；下調(diào)基因KEGG分析中，碳代謝、丙酮酸代謝、線粒體代謝、檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等與細(xì)胞能量代謝相關(guān)的通路富集顯著。

圖4 差異基因的KEGG pathway分析a.上調(diào)基因KEGG的pathway分析 b.下調(diào)基因KEGG的pathway分析

2.4 Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的蛋白表達(dá)分析 為了進(jìn)一步證實(shí)VSMC中KLF5調(diào)節(jié)相關(guān)基因影響AAA形成的重要分子通路，采用Western blot 進(jìn)一步證實(shí)，與CaPO4誘導(dǎo)的WT小鼠AAA組織比較，Stk3、Rassf4、Wwtr1在CaPO4誘導(dǎo)的VSMCKLF5-/-小鼠AAA血管組織中表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)來(lái)自小鼠CaPO4損傷的血管組織中Stk3、Rassf4、Wwtr1蛋白表達(dá)與WT組比較，*P<0.05， **P<0.01，n=3。

3 討論

KLFs家族作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，在細(xì)胞發(fā)育、分化、生長(zhǎng)及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。KLF5屬于其中一員，調(diào)控多種與心血管相關(guān)基因的表達(dá)，先前的研究表明KLF5在應(yīng)對(duì)外部壓力及心血管重構(gòu)中起著重要的作用[7]。也有研究證實(shí) KLF5在巨大的未破裂動(dòng)脈瘤中高表達(dá)[8]。提示KLF5與AAA的形成和發(fā)展有關(guān)。VSMC在維持動(dòng)脈功能方面起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)功能的失調(diào)導(dǎo)致正常收縮狀態(tài)的喪失以及增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡的打破均是促進(jìn)動(dòng)脈瘤形成的原因[9]。本課題組通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠髓系細(xì)胞KLF5表達(dá)缺失能夠抑制AAA的形成[4]，而VSMC中KLF5表達(dá)缺失將對(duì)AAA表型產(chǎn)生的影響尚未有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)CaPO4誘導(dǎo)VSMCKLF5-/-和WT小鼠產(chǎn)生的AAA模型進(jìn)行KLF5 在VSMC中表達(dá)的作用機(jī)制的研究。

HE染色結(jié)果顯示，VSMKLF5-/-組和WT組小鼠膨脹度均達(dá)到AAA標(biāo)準(zhǔn)，且血管正常結(jié)構(gòu)破壞，中膜變薄，VSMCKLF5-/-組術(shù)后膨脹度明顯大于WT組。提示VSMC中KLF5表達(dá)缺失可促進(jìn)AAA的形成。通過(guò)mRNA芯片篩查并對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Hippo信號(hào)通路中Stk3、Rassf4、Wwtr1蛋白表達(dá)參與AAA的形成。通過(guò)GO分析顯示上調(diào)差異基因在生物學(xué)功能方面富集于轉(zhuǎn)錄共激活因子活性、微管正端結(jié)合、細(xì)胞骨架、紡錘體等；下調(diào)基因在生物學(xué)過(guò)程中富集在前體代謝產(chǎn)物和能量的產(chǎn)生等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路在AAA形成中受KLF5調(diào)節(jié)影響最為顯著，該通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、能量代謝在器官生長(zhǎng)、發(fā)育、干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、癌癥和心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]，Hippo信號(hào)通路主要由MST1/2、LATS1/2、YAP、TAZ(WWTR1)組成[11]，其中YAP誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)換，參與主動(dòng)脈壁的重構(gòu)，促進(jìn)由收縮表型的 VSMCs向合成表型的VSMCs轉(zhuǎn)化，主要改變?yōu)槭湛s功能消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器增多，合成和分泌功能增強(qiáng)[12-14]，導(dǎo)致膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成增加，而這兩者都可以促進(jìn)膠原蛋白的沉積和彈性蛋白的降解，因而造成主動(dòng)脈壁的彈性下降，最終導(dǎo)致主動(dòng)脈瘤[15]。為了進(jìn)一步證實(shí)VSMC中KLF5調(diào)節(jié)相關(guān)基因影響AAA形成的重要分子通路，本研究選擇Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因蛋白Stk3、Rassf4、Wwtr1進(jìn)行分析。MST激酶(MST1/2，其中MST2即STK3)通過(guò)調(diào)控LATS激酶促進(jìn)心血管細(xì)胞凋亡[16-17]，并且影響YAP的磷酸化；Rassf4通過(guò)激活MST1[18-19]來(lái)對(duì)主動(dòng)脈瘤起作用；Wwtr1和YAP功能相似[20]，Wwtr1表達(dá)上調(diào)可能會(huì)影響YAP的表達(dá)及磷酸化，但尚未有研究證實(shí)。通過(guò)Western blot證實(shí)Stk3、Rassf4、Wwtr1在VSMCKLF5-/-組中表達(dá)明顯升高，提示VSMCKLF5-/-組小鼠VSMC中敲除KLF5后通過(guò)上調(diào)Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因蛋白Stk3、Rassf4、Wwtr1促進(jìn)AAA的形成。

另外，本研究結(jié)果與課題組前期關(guān)于小鼠髓系KLF5缺失研究結(jié)果正好相反，提示不同細(xì)胞中KLF5基因表達(dá)變化在AAA形成中的生物學(xué)功能是不同的。因此，在進(jìn)行關(guān)于KLF5的表達(dá)和細(xì)胞生物學(xué)功能在心血管疾病中的研究中應(yīng)考慮到異種細(xì)胞的差異性。

綜上所述，本研究利用VSMCKLF5-/-小鼠、高通量基因芯片篩查和生物信息學(xué)分析方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管平滑肌細(xì)胞中敲除KLF5后，通過(guò)上調(diào)Stk3、Wwtr1和Rassf4的表達(dá)參與Hippo信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)AAA的發(fā)生，即血管平滑肌細(xì)胞中KLF5可能通過(guò)調(diào)控Hippo通路維持血管穩(wěn)態(tài)并抑制AAA的形成。這也為AAA的發(fā)病機(jī)制及靶向藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。