魏玉倩，陳健鑫，鄭艷玲，王 芳，馬煥成*，伍建榕

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 國(guó)家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

攀枝花地區(qū)是典型的干熱河谷地區(qū)，位于26°51′32″N,101°34′46″E，四川省最南部，地處攀西裂谷中南段，夏季長(zhǎng)，旱季雨季分明晝夜溫差大，氣候干燥，降雨量集中在雨季[1]。攀枝花蘇鐵國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于金沙江北岸的巴關(guān)河西坡及格里坪后山，屬于典型的南亞熱帶半干旱河谷氣候類型，冬季氣候溫和，日照充沛，熱量豐富[2]。該地區(qū)地勢(shì)陡峭、河谷深切、地形封閉[3]。金沙江干熱河谷森林覆蓋率不足5%，生態(tài)環(huán)境惡劣，水土流失嚴(yán)重，植物難以在該地區(qū)建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的種群。

攀枝花蘇鐵(Cycaspanzhihuaensis)是中國(guó)特有的古老孑遺植物，與熊貓、恐龍合稱為“巴蜀三寶”,生存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2億a以上[4]。攀枝花蘇鐵最初發(fā)現(xiàn)于攀枝花市附近的巴關(guān)河西坡，繼而在毗鄰的格里坪后山及寧南、德昌、鹽源和云南華坪等縣的局部地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，是蘇鐵屬在東亞大陸分布緯度最北的種類。攀枝花蘇鐵能適應(yīng)干旱河谷的特殊生境能在河谷巖壁的石縫中建立自己的種群[5]，為適應(yīng)外界不良的環(huán)境，攀枝花蘇鐵與土壤微生物建立共生關(guān)系，進(jìn)化出了特殊的根系，包括主根、側(cè)根和特化的珊瑚狀根。目前對(duì)蘇鐵特殊根系的研究主要集中在由共生藍(lán)藻形成的珊瑚狀根上，大多數(shù)研究者認(rèn)為共生藍(lán)藻通過(guò)根系的裂縫、水孔、根系頂端及根系分支處開始侵染并延伸至藻胞層定殖[6-8]。研究指出攀枝花蘇鐵根系內(nèi)生菌有較高的多樣性，Zheng Y等[9]利用高通量技術(shù)對(duì)攀枝花蘇鐵不同組織和根際土壤中微生物物種多樣性和群落組成進(jìn)行分析表明，不同組織中的微生物群落均有高度的多樣性；研究表明自然生態(tài)系統(tǒng)中菌根真菌影響植物種群的競(jìng)爭(zhēng)能力，菌根真菌的多樣性決定著植物的生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)的變化以及植物的生產(chǎn)力[10]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)的一類專性活體營(yíng)養(yǎng)共生菌，能與陸地生態(tài)系統(tǒng)約80%以上的高等植物形成互惠共生體，通過(guò)共生體AMF能促進(jìn)植物對(duì)N、P、K等礦物質(zhì)元素及微量元素的吸收和利用，增強(qiáng)植物的抗旱、抗寒和鹽脅迫等的抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、加快幼苗成活、促進(jìn)農(nóng)林業(yè)發(fā)展，對(duì)生物多樣性的維持和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要的作用[11-12]。AMF主要以菌絲網(wǎng)和孢子的形式定殖于植物根際土壤中，同時(shí)以叢枝和泡囊的結(jié)構(gòu)共生于植物根系中[13]，有文獻(xiàn)報(bào)道，蘇鐵與AMF也存在共生關(guān)系，B.Jack和P.Andrew[14]在南美蘇鐵(Zamiapumila)和雙子鐵(Dioonedule)中描述了存在于根系皮層薄壁細(xì)胞的AMF，并提出了當(dāng)土壤P元素含量受限時(shí)，蘇鐵需要AMF才能成功地固N(yùn)，但攀枝花蘇鐵中是否有AMF定殖還未見報(bào)道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)于干旱貧瘠土壤的攀枝花蘇鐵根系土壤有大量的AMF孢子，然而對(duì)不同樹齡的AMF定殖情況及群落組成鮮見報(bào)道。本研究以不同樹齡的攀枝花蘇鐵根系及根際土壤為研究對(duì)象，從攀枝花蘇鐵根際土壤中分離AMF孢子，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類鑒定，并通過(guò)醋酸墨水染色法觀察AMF的定殖情況及計(jì)算定殖率，統(tǒng)計(jì)分析不同樹齡的攀枝花蘇鐵根內(nèi)及根際土壤中AMF種類及多樣性的變化趨勢(shì)，旨在為攀枝花蘇鐵菌根化育苗栽培及保育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2018年7月在四川省攀枝花市攀枝花蘇鐵國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，采用五點(diǎn)取樣法[15]，在每點(diǎn)分別采取8株14 a、8 a和3 a樹齡的攀枝花蘇鐵植株，每個(gè)植株在東西南北4個(gè)方位采集蘇鐵根系及土樣。取根樣時(shí)，先用75%乙醇擦拭枝剪，快速剪取須根后保存于FAA固定液中，同時(shí)挖取蘇鐵根際土壤，采集距地表5～20 cm的根際土壤1 000 g，裝入無(wú)菌塑料袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 根系A(chǔ)MF定殖率的測(cè)定

采用醋酸墨水染色方法觀察攀枝花根系菌根真菌定殖狀況。將根樣從FAA固定液中取出，流水緩慢沖洗2～3次后將根系剪成1 cm長(zhǎng)的根段，然后將根樣置于20% KOH中透明，置于5%醋酸中酸化，用5%醋酸墨水染色液染色，最后用清水浸泡脫色后即可鏡檢[16]。每個(gè)樣品采集50個(gè)根段，計(jì)算根段定殖率。

根段定殖率參照唐燕等[17]的方法，將AMF定殖強(qiáng)度劃分為強(qiáng)、中、弱3級(jí)，強(qiáng)定殖率為76%～100%，中定殖率為25%～75%，弱定殖率為0～24%。根段侵染率的計(jì)算公式如下：

根段定殖率(%)=∑(0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+……+100%×根段數(shù))/總根段數(shù)

(1)

1.3 AMF孢子的分離與密度統(tǒng)計(jì)

采用濕篩沉淀法[18]分離土壤中AMF孢子。稱取風(fēng)干土樣20 g置于250 mL廣口瓶中，將水加至200 mL，用玻璃棒將其充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置過(guò)夜，制備成土壤懸浮液。將懸浮液分別過(guò)20、100、140、200、300目的土壤篩，用自來(lái)水反復(fù)輕柔清洗，直至篩底流出的水澄清為止，將篩面篩出的物質(zhì)全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，加水至200 mL，靜置20 min后轉(zhuǎn)入梨形分液漏斗進(jìn)行沉降除沙，分液漏斗中靜置20 min后，打開活塞，待分液漏斗中所剩溶液為100 mL時(shí)，關(guān)閉活塞，所得的孢子懸浮液用布氏漏斗進(jìn)行過(guò)濾，經(jīng)真空抽氣泵抽氣于直徑為9 cm的墊有濾紙的培養(yǎng)皿上，20目的不過(guò)濾。并在體式顯微鏡下分別計(jì)數(shù)各篩面的孢子數(shù)目，統(tǒng)計(jì)每克土樣中含有的AMF孢子的數(shù)量計(jì)為AMF孢子密度[19]。

1.4 AMF孢子的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定方法：挑取單個(gè)AMF孢子置于載玻片上，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄，重點(diǎn)觀察孢子大小、形狀、顏色、連孢菌絲、孢子壁及發(fā)芽壁的層數(shù)和厚度、孢子壓破后的內(nèi)含物等特征。根據(jù)SCHENCK和PEREZ的《VA菌根真菌鑒定手冊(cè)》和INVAM(http://invam.caf.wvu.edu)提供的種的描述的圖片進(jìn)行種屬的檢索和鑒定，并將數(shù)量及相對(duì)多度較高的種計(jì)為優(yōu)勢(shì)種屬。

分子生物學(xué)鑒定方法：采用OMEGA公司MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取單孢子總DNA，參照李小林等[20]的方法，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增AMF 18SrDNA片段。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，正確的擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。雙向測(cè)通的序列通過(guò)DNAman進(jìn)行拼接并去除兩端低質(zhì)量序列，通過(guò)MEGA 6.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，依此確定菌株的分類地位。

1.5 攀枝花蘇鐵AMF多樣性及不同樹齡間的差異分析

參照包玉英等[21]的方法，采用孢子密度、物種豐富度、優(yōu)勢(shì)度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson生態(tài)優(yōu)勢(shì)度來(lái)描述攀枝花蘇鐵AMF多樣性，同時(shí)分析14年生、8年生和3年生攀枝花蘇鐵AMF的差異性。采用Excel統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并使用SPSS22.0軟件分析不同樹齡之間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 攀枝花蘇鐵根系A(chǔ)MF定殖情況

攀枝花蘇鐵根系染色后的樣本在光學(xué)顯微鏡下可見AMF侵染與定殖情況(圖1)，其中菌絲、泡囊是根系內(nèi)AMF的主要結(jié)構(gòu)。

通過(guò)表1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，不同樹齡攀枝花蘇鐵的根系A(chǔ)MF定殖情況存在一定差異，14年生攀枝花蘇鐵根系的AMF定殖率最高，達(dá)到高定殖強(qiáng)度，定殖結(jié)構(gòu)以泡囊為主(圖1a、圖1b)；8年生根系A(chǔ)MF定殖率中等，為中定殖強(qiáng)度，定殖結(jié)構(gòu)以泡囊和菌絲為主(圖1c、圖1d)；3年生的AMF定殖率較低，為弱定殖強(qiáng)度，定殖結(jié)構(gòu)以菌絲為主，泡囊結(jié)構(gòu)較少(圖1e、圖1f)。

注:a、b為14年生攀枝花蘇鐵；c、d為8年生攀枝花蘇鐵；e、f為3年生攀枝花蘇鐵；V為泡囊；H為菌絲；標(biāo)尺=20 μm。圖1 攀枝花蘇鐵根系A(chǔ)MF形態(tài)Fig.1 Morphology of AMF in roots of Cycas panzhihuaensis

表1 不同樹齡的攀枝花蘇鐵AMF的定殖情況Table 1 The colonization of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages %

2.2 不同樹齡階段的攀枝花蘇鐵AM真菌的鑒定

基于形態(tài)學(xué)特征鑒定，攀枝花蘇鐵根際土壤中共分離、鑒定得到6屬22種的AMF孢子(圖2)，包括球囊霉屬(Glomus)、無(wú)梗囊霉屬(Acaulospora)、近明球囊霉屬(Claroideoglomus)、斗管囊霉屬(Funneliforms)、盾巨孢囊霉屬 (Scutellospora)、硬囊霉屬(Sclerocystis)。球囊霉屬和無(wú)梗囊霉屬為攀枝花蘇鐵根際AMF的優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)多度分別為56.91%和28.23%。

注:1.黑球囊霉；2.澳大利亞球囊霉；3.蜜色無(wú)梗囊霉；4.雙網(wǎng)無(wú)梗囊霉；5.黑色盾巨孢囊霉；6.團(tuán)集球囊霉7.網(wǎng)狀球囊霉；8.近明球囊霉；9.斑點(diǎn)球囊霉10.多梗球囊霉；11.膨果球囊霉；12.地表球囊霉；13.地球囊霉；14.縮球囊霉；15.卷曲球囊霉；16.小果球囊霉；17.黑球囊霉；18.明球囊霉；19.雙網(wǎng)無(wú)梗囊霉；20.細(xì)凹無(wú)梗囊霉；21.幼套近明球囊霉；22.臺(tái)灣硬囊霉。圖2 攀枝花蘇鐵根際土壤叢枝菌根真菌孢子形態(tài)Fig.2 The morphology of AMF spores in rhizospheric soils of Cycas panzhihuaensis

由表2可見，3年生攀枝花蘇鐵根系中共鑒定出AMF 3屬，包括球囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬和盾巨孢囊霉屬。特有菌種為澳大利亞球囊霉(G.australe)、蜜色無(wú)梗囊霉(A.mellea)、黑色盾巨孢囊霉(S.nigra)；8年生蘇鐵根系中共鑒定出AMF 4屬，包括球囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬、近明球囊霉屬和硬囊霉屬。特有菌種為皺壁無(wú)梗囊霉(A.rugosa)；14年生蘇鐵根系中共鑒定出AMF 5屬，包括球囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬、近明球囊霉屬、硬囊霉屬和斗管囊霉屬，特有菌種為細(xì)凹無(wú)梗囊霉(A.scrobiculata)、幼套近明球囊霉(C.ctunicatum)、摩西斗管囊霉(F.mosseae)。

表2 不同樹齡的攀枝花蘇鐵根際土壤中AMF孢子種類組成Table 2 The community of AMF in rhizophere soil of Cycas panzhihuaensis with different ages

基于分子生物學(xué)方法，擴(kuò)增了AMF單孢子18SrRNA片段，通過(guò)鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，共鑒定了9種AMF孢子，包括3年攀枝花蘇鐵AMF孢子2種，8年生攀枝花蘇鐵AMF孢子2種及14年生攀枝花蘇鐵AMF孢子5種。

圖3 基于18Sr RNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 A phylogenetic tree developed by 18sr RNA gene

2.3 不同樹齡的攀枝花蘇鐵AMF多樣性及相關(guān)性分析

由表3可知，攀枝花蘇鐵AMF侵染率隨年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，14年生攀枝花蘇鐵根際土壤AMF孢子密度為16.02個(gè)/g，8年生攀枝花蘇鐵根際土壤孢子密度為14.13個(gè)/g，3年生攀枝花蘇鐵根際土壤孢子密度為13.3個(gè)/g，結(jié)果表明AMF孢子密度也隨樹齡的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。

表3 不同樹齡攀枝花蘇鐵AMF定殖率與AMF孢子密度的相關(guān)性Table 3 The correlation betweenthe colonization rate and spore density of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages

通過(guò)菌根定殖率與孢子密度的相關(guān)性分析，得到二者之間的相關(guān)性是0.873 9，呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。由此得出，隨著樹齡增加，菌根真菌定殖率、孢子密度、豐富度和多樣性指數(shù)均能夠增加。

3 結(jié)論與討論

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物能夠影響植物生長(zhǎng)、群落組成和種類多樣性，同時(shí)陸地植物也會(huì)影響土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)，兩者形成動(dòng)態(tài)相互作用的關(guān)系[22]。當(dāng)宿主植物發(fā)生改變時(shí)，土壤中的AM真菌種類和數(shù)量也會(huì)發(fā)生改變。本研究對(duì)干熱河谷攀枝花蘇鐵自然保護(hù)區(qū)的不同樹齡的攀枝花蘇鐵根際土壤AM真菌進(jìn)行分離、物種鑒定以及菌根定殖進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，土壤AMF定殖率、孢子密度、多樣性指數(shù)與樹齡密切相關(guān)，首次報(bào)道了AMF在宿主蘇鐵中的定殖率和多樣性，填補(bǔ)了空白。

本研究中，3年生、8年生和14年生的攀枝花蘇鐵AMF定殖率分別為21.10%、28.54%和36.13%，孢子密度分別為13.3、14.13個(gè)/g和16.02個(gè)/g，說(shuō)明蘇鐵種植8 a就達(dá)到了較穩(wěn)定的菌根真菌定殖率，這與樹齡越大，抗逆性越強(qiáng)是一致的。大量研究結(jié)果表明，AMF定殖率及群落組成受到生態(tài)環(huán)境中的氣候和土壤條件影響很大[23]，同時(shí)也受到植株年齡的影響[24]。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)年齡的攀枝花蘇根際土壤中AMF種類存在差異，14年生攀枝花蘇鐵孢子密度最高，且分離出的AMF種類也最多，鑒定出16個(gè)種的AMF；8年生的次之，共鑒定出14個(gè)種的AMF；而3年生攀枝花蘇鐵只有6個(gè)種的AMF。究其原因，一方面可能是因?yàn)锳MF能夠促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤養(yǎng)分等的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；另一方面宿主植物能夠?yàn)锳MF提供碳水化合物，與之互惠共生的AMF屬的數(shù)目也相對(duì)增加[25]。這在一定程度上表明樹齡越長(zhǎng)，越能夠?yàn)锳MF提供更適宜的生存和繁殖條件，不同的樹齡，隨生物量增加，AMF多樣性豐富，定殖率增高，抵抗不良環(huán)境，改善環(huán)境條件，土壤AMF多樣性增加，增加P的吸收，增加固N(yùn)作用，生物量增加。同時(shí)AMF對(duì)提高苗木和植物的總生物量、總根長(zhǎng)、根表面積、根投影面積和根體積具有積極作用。樹木能長(zhǎng)出更多的根，通過(guò)根直徑的函數(shù)改變根系增殖，以增加植物營(yíng)養(yǎng)中選擇性覓食的能力[26]。通過(guò)與植物形成共生體，AMF可以改變植物根系形態(tài)，主要增加根系生物量，從而提高根系覓食和吸收養(yǎng)分的能力，進(jìn)而改變植物的整體生長(zhǎng)潛力。不同樹齡的攀枝花蘇鐵土壤中，球囊霉屬的AMF相對(duì)豐度較高，這可能是因?yàn)榍蚰颐箤倬哂休^強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和獨(dú)特的繁殖特性[27]，較高的產(chǎn)孢率能夠使其在不同環(huán)境中定殖，因此分布廣泛。而3年生攀枝花蘇鐵中無(wú)梗囊霉屬相對(duì)豐度高于14年生攀枝花蘇鐵，無(wú)梗囊霉屬的AMF往往在酸性環(huán)境條件下的土壤中具有較高的產(chǎn)孢率[28]。

AM真菌的分離鑒定是保護(hù)以及利用微生物資源最基本也是最重要的工作。AM真菌幾乎可以存在于土壤中任何地方，且有豐富的物種多樣性。近年來(lái)，有關(guān)AM真菌物種多樣性研究越來(lái)越多，下一步試驗(yàn)中希望通過(guò)探究土壤理化性質(zhì)，從而了解土壤與AMF之間的相關(guān)性。通過(guò)完善植物AM真菌的種質(zhì)資源調(diào)查，對(duì)篩選高效菌種以及農(nóng)林業(yè)菌根真菌資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義。