高瑞川，胡 敏，李芳柏，陳冠虹，方利平

(1 中國科學(xué)院 廣州地球化學(xué)研究所, 廣東 廣州 510640； 2 廣東省科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境與土壤研究所,廣東 廣州 510650； 3 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

病毒在地表環(huán)境中無處不在，是世界上數(shù)量最多的生物實體。噬菌體是感染細菌、古菌等原核生物的病毒統(tǒng)稱，由于土壤中原核微生物數(shù)量遠高于真核生物，噬菌體被視為土壤中主要的病毒類群。有研究推測，全球病毒粒子的數(shù)量為4.80×1031，其中，在土壤中占比為10%、海洋水體中占比為2.7%[1]。相比于海洋等水生系統(tǒng)，土壤的異質(zhì)性更高，其組成在空間和時間尺度上差異很大。因此，盡管土壤中噬菌體的豐度非常高，但對其生態(tài)功能以及作用機理的研究相對滯后[2-4]。近年來，以宏病毒組結(jié)合高通量測序技術(shù)分析土壤噬菌體豐度變化、群落組成、功能注釋的研究逐漸增多，對土壤生態(tài)系統(tǒng)中的病毒，尤其是噬菌體的生態(tài)功能進行了一些探索，逐步揭開土壤噬菌體的神秘面紗。本文基于當(dāng)前土壤噬菌體的研究現(xiàn)狀，綜述了土壤噬菌體的分類和研究方法，揭示土壤噬菌體對宿主群落結(jié)構(gòu)、生命元素循環(huán)及重金屬轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控機制，闡明土壤噬菌體的生態(tài)功能及環(huán)境意義，并對土壤噬菌體未來研究重點進行了展望。

1 噬菌體分類及研究方法

1.1 噬菌體分類

噬菌體是一類個體微小、結(jié)構(gòu)簡單，能夠感染細菌、古菌等原核生物的病毒，其遺傳物質(zhì)包裹在被稱為衣殼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。噬菌體所攜帶的遺傳物質(zhì)主要分為雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈 RNA(dsRNA)和單鏈RNA(ssRNA) 4類。土壤環(huán)境中以攜帶雙鏈DNA的噬菌體為主[1,5]。

噬菌體形態(tài)各異，包括球狀、絲狀、桿狀、棒狀、水滴狀和多面體等,如圖1所示[6]。其中，有尾噬菌體有一條附著在衣殼上、可參與宿主識別和感染的蛋白質(zhì)尾巴[7-8]。有尾噬菌體占已知噬菌體的90%以上,根據(jù)其尾部的形態(tài)特征，可再細分為肌尾、長尾和短尾噬菌體。有尾噬菌體可侵染的宿主十分廣泛，涉及厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、藍細菌門Cyanobacteria、變形菌門Proteobacteria、廣古菌門Euryarchaeota等多個門類[9]。

圖1 侵染細菌域和古菌域的dsDNA噬菌體分類及形態(tài)示意圖Fig.1 Classification and morphological diagrams of dsDNA phages infecting bacterial and archaeal domains

由于噬菌體自身缺乏代謝功能，不能獨立繁殖，與合適的宿主細胞接觸并侵染是其繁殖的唯一途徑[10]。噬菌體生命周期根據(jù)其侵染周期作用于宿主細胞的方式，主要分為裂解循環(huán)(常見于烈性噬菌體和溫和噬菌體)和溶原循環(huán)(常見于溫和噬菌體)兩大類：裂解循環(huán)是指噬菌體侵染宿主細胞后破壞宿主原有代謝功能和結(jié)構(gòu)，進行大量子代噬菌體的增殖、裝配，最終使宿主細胞裂解的過程；溶原循環(huán)是指噬菌體侵染宿主菌后并不立即進行增殖，而是將其核酸整合至宿主菌基因組中并跟隨宿主核酸的復(fù)制而復(fù)制，最終隨細胞的分裂進行繁殖的過程[11]。隨后，又發(fā)現(xiàn)了慢性循環(huán)和假溶原循環(huán)[12-13]。慢性循環(huán)常見于絲狀噬菌體，可以在宿主細胞內(nèi)不斷復(fù)制并釋放，卻不會裂解宿主細胞[14]。假溶原循環(huán)的噬菌體在侵染宿主細胞后，自身既不復(fù)制，也不裂解宿主，處于“休眠”狀態(tài)[15-16]；這種現(xiàn)象常見于營養(yǎng)受限，宿主細胞難以進行DNA復(fù)制或蛋白質(zhì)合成的環(huán)境中。

土壤的異質(zhì)性限制了土壤噬菌體的分布和活動。pH、含水量、土壤類型、細菌豐度和群落組成結(jié)構(gòu)等非生物和生物因素都會對噬菌體群落結(jié)構(gòu)、豐度等造成不同程度的影響，進而影響其生態(tài)功能。在一定的誘導(dǎo)條件下，烈性噬菌體與溫和型噬菌體可發(fā)生轉(zhuǎn)換。有研究表明，前噬菌體(Prophage)仍然保留了啟動裂解循環(huán)的能力[17]。

1.2 噬菌體的研究方法

受限于大部分環(huán)境微生物的不可培養(yǎng)性，依賴于宿主細胞進行繁殖的病毒多樣性研究受到了較大的阻礙。由于沒有通用的標(biāo)記基因，早期對病毒群落及功能的研究常使用特定病毒家族中高度保守的標(biāo)記基因設(shè)計簡并性引物，以評估其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。此外，隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)[18]作為對未知序列基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)，被學(xué)者們應(yīng)用于土壤中病毒多樣性的研究中。近年來，使用宏基因組、宏病毒組等組學(xué)方法研究土壤噬菌體逐漸成為熱門。這些方法可以大量獲得相關(guān)種群的遺傳信息，且不受病毒培養(yǎng)的限制。土壤宏基因組的研究依賴于從整個宏基因組數(shù)據(jù)中鑒定出病毒序列[19-21]。但宏基因組數(shù)據(jù)中通常包含高比例非病毒序列，這些序列往往在下游分析中需要去除。研究表明，對富集后的噬菌體進行宏病毒組分析，獲得的目標(biāo)序列多樣性遠高于直接對土壤環(huán)境DNA進行宏基因組分析[22]。因此，對噬菌體進行洗脫、純化和富集成為了土壤噬菌體研究的重要一環(huán)[23]?？偟膩碚f，噬菌體的研究方法主要包括洗脫、純化、濃縮、核酸提取、數(shù)據(jù)分析等[24]，具體流程如圖2所示。

圖2 土壤噬菌體洗脫、富集、核酸提取流程圖Fig.2 Flowchart of elution, enrichment and nucleic acid extraction of soil phages

1.2.1 噬菌體的分離、富集與核酸提取 如何高效地洗脫吸附于土壤顆粒表面的噬菌體，是對土壤噬菌體進行分析的第1步。G?ller等[25]對鎂鹽緩沖液、檸檬酸鉀緩沖液、10%的牛肉膏、牛肉膏改良的磷酸鹽緩沖液等4種病毒洗脫液的洗脫效率進行了比較。有研究表明，緩沖液中鹽成分的主要作用是調(diào)節(jié)pH，作為病毒顆粒的穩(wěn)定劑[26]。牛肉浸膏中的蛋白質(zhì)成分提供了噬菌體的結(jié)合位點，使噬菌體更容易從土壤顆粒的吸附中剝離。

切向流過濾法(Tangential-flow filtration，TFF)和聚乙二醇沉淀法 (Polyethylene glycol，PEG)是從洗脫液中純化、富集噬菌體的常用方法[24,27-28]。TFF是一種液體流動方向與過濾方向垂直的方法，通過不斷地回流過濾，達到去除細菌等雜質(zhì)、截留和濃縮病毒粒子的目的。PEG則是通過破壞噬菌體外殼蛋白質(zhì)分子表面的水化層使其發(fā)生沉淀的方法。脫氧核糖核酸酶(DNase I)常用于去除濃縮液中的游離核酸以降低原核生物的核酸干擾。通過選擇各類核酸提取試劑盒[29-30]以及甲酰胺或CTAB結(jié)合苯酚/氯仿抽提法[27]可以完成噬菌體核酸提取。

獲得的噬菌體核酸濃度若未達到文庫構(gòu)建的要求，則還需要對其進行隨機擴增。常見的隨機擴增技術(shù)包括多重置換擴增技術(shù)[31]和連接擴增技術(shù)[32]等。值得注意的是，這些擴增技術(shù)的擴增產(chǎn)物通常會出現(xiàn)偏好[33]，并不能有效地還原土壤中真實的噬菌體群落組成。因此，如何不依靠擴增手段獲得足量噬菌體核酸被認為是前處理步驟中的一個研究重點。

1.2.2 土壤宏病毒組的分析方法 第2代測序技術(shù)是目前進行宏病毒組研究的主要測序技術(shù)[34-35]。面對測序下機后獲得的海量短序列，分析過程主要包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、短序列組裝、病毒序列鑒定、序列注釋、相對豐度計算等內(nèi)容。如何從海量數(shù)據(jù)中成功鑒定出病毒序列是后續(xù)解析病毒信息的關(guān)鍵。Chen等[31]利用宏病毒組學(xué)的方法研究了病毒群落與抗生素耐藥基因的關(guān)系，測序下機后的原始數(shù)據(jù)首先使用Trimmomatic[36]去除Illumina平臺的FastQC序列中的接頭，對原始雙端序列進行低質(zhì)量過濾；再使用Bowtie2[37]軟件與細菌、核糖體數(shù)據(jù)庫比對去掉宿主序列，使用Megahit[38]對宏病毒組數(shù)據(jù)中剩余的Clean reads進行序列組裝；利用VIBRANT[39]鑒定病毒序列，采用CD-HIT[40]獲得非冗余病毒序列集，保留長度10 kb以上的序列進行下游鑒定及注釋；最后，以95%相似度、80%最小覆蓋度為篩選條件進行聚類，獲得病毒操作分類單元(vOTUs)，并進行后續(xù)的病毒物種分類、病毒功能注釋等工作。

此外，ViromeQC[41]、Kraken2[42]、VirSorter[43]、Prodigal[44]、DRAMv[45]等軟件也是近年來各國學(xué)者開發(fā)并用于環(huán)境病毒宏基因組數(shù)據(jù)解析的軟件。ViromeQC是評估非病毒序列污染程度的軟件，它可以基于3種微生物分子標(biāo)記的豐度(SSU-rRNA、LSU-rRNA及31個原核單拷貝基因標(biāo)記)對病毒組整體序列給出病毒富集得分(Enrichment score)；Kraken2是對有效序列進行物種注釋預(yù)測的軟件，其數(shù)據(jù)庫包括古菌、細菌、真菌和病毒，其中，病毒參考序列主要來源于 RefSeq complete viral genomes/proteins，基于k-mer精確比對，并采用LCA法鑒定物種；VirSorter是DNA和RNA病毒的識別工具，常用以識別宏基因組數(shù)據(jù)拼接后的病毒序列；Prodigal是對細菌和古生菌基因組進行蛋白編碼基因預(yù)測的軟件，其縮寫源于 Prokaryotic dynamic programming genefinding algorithm，表示原核生物基因預(yù)測的動態(tài)規(guī)劃算法；DRAMv是 DRAM的病毒模式，它建立了識別病毒編碼的輔助代謝基因(Auxiliary metabolic genes, AMG)的規(guī)則；DRAMv可與Prodigal聯(lián)用，首先使用Prodigal鑒定所獲得病毒序列的開放閱讀框 (ORF)，然后對獲取的ORF集合進行功能注釋。

Roux等[46]發(fā)布了“未培養(yǎng)病毒基因組(Uncultured virus genomes，UViGs)的最少信息標(biāo)準(zhǔn)” (圖3)，為學(xué)術(shù)界提供對病毒進行宏基因/病毒組分析的參考標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)包括UViGs的回收、病毒序列的鑒定、組裝質(zhì)量評估、分析與注釋、分類和宿主預(yù)測等多方面。采用該標(biāo)準(zhǔn)將有助于改善公共數(shù)據(jù)庫中非培養(yǎng)病毒組的報告，進而有助于全球病毒領(lǐng)域的系統(tǒng)探索。

圖3 未培養(yǎng)病毒基因組的識別Fig.3 Identification of uncultured virus genomes (UViGs)

2 土壤噬菌體的生態(tài)功能解析

關(guān)于噬菌體在水體環(huán)境中的研究已開展多年。研究發(fā)現(xiàn)，海洋中病毒顆粒(VLPs)的數(shù)目與豐度都十分驚人，且與生態(tài)系統(tǒng)中的微生物死亡關(guān)聯(lián)密切[47-48]。據(jù)估計，海洋水體中20%～40%的細菌種群都會受到噬菌體裂解的影響。除水體系統(tǒng)以外，土壤[49]、哺乳動物胃腸道[50]、極端環(huán)境(沙漠、極地[19])、甚至是古代樣品(木乃伊[51]等)環(huán)境中，病毒、噬菌體都隨處可見。因此，噬菌體的感染無處不在，影響了微生物群落結(jié)構(gòu)、物種進化以及細菌與其他生物體之間的相互作用。

盡管土壤噬菌體數(shù)量巨大，但由于提取難度大，對土壤噬菌體的認知尚剛剛起步。研究表明，土壤噬菌體的生態(tài)功能包括自上而下調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)、侵染宿主微生物導(dǎo)致其裂解、加速生命元素循環(huán)、加速微生物群落更替以保持其活力、促進微生物間的基因水平轉(zhuǎn)移[52]、攜帶輔助代謝基因輔助宿主菌生長等[53]。

針對烈性噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體群落的變化與其對應(yīng)宿主的物種豐度密切相關(guān)，且能對宿主豐度變化產(chǎn)生迅速、積極的響應(yīng)[54-55]。Chevallereau等[56]和Thingstad[57]研究表明，烈性噬菌體受宿主群落密度的影響，符合“殺死優(yōu)勝者(Kill-the-winner,KtW)”模型，抑制、裂解生態(tài)系統(tǒng)中作為主導(dǎo)的一些細菌群落，從而使豐度較低的群落占比提高。這種調(diào)控主要是通過降低優(yōu)勢物種的增殖從而保持細菌群落的多樣性。該模型下，溫和噬菌體被認為與宿主更多的是產(chǎn)生互利共生行為，因此對細菌種群動態(tài)的影響有限。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，溫和噬菌體可以將自身基因整合至宿主細胞中，放棄快速增殖，避免與其他病毒或噬菌體競爭，最終產(chǎn)生了隨著宿主細菌豐度增加，病毒與細菌比例顯著下降的現(xiàn)象，噬菌體的這一生長過程符合“搭乘優(yōu)勝者(Piggyback-the-winner, PtW)”模型[12]。在細菌快速生長期間，病毒與宿主細菌整合獲利更多，同時獲得了更好的生長條件，是一種“聰明”的寄生行為?？偟膩碚f，KtW和PtW 模型并不沖突，應(yīng)將其結(jié)合以充分了解噬菌體-宿主之間的相互作用，進而發(fā)掘噬菌體在環(huán)境中的生態(tài)學(xué)意義[58]。

噬菌體對其宿主微生物群落結(jié)構(gòu)的控制，會進一步影響土壤系統(tǒng)的生態(tài)功能，如圖4所示[59]。當(dāng)宿主細菌群落介導(dǎo)生態(tài)系統(tǒng)中生命元素循環(huán)時，這些細菌的豐度、群落結(jié)構(gòu)、功能和代謝將受到噬菌體的裂解影響，最終影響土壤中的養(yǎng)分周轉(zhuǎn)；當(dāng)宿主為重金屬轉(zhuǎn)化相關(guān)功能菌時，噬菌體的裂解將影響功能群落相關(guān)基因的整體表達，從而調(diào)控土壤的解毒功能[60]。此外，土壤生態(tài)功能的改變也會對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生反饋作用。以噬菌體療法進行病害防治為例，噬菌體通過裂解宿主病原菌，減少土傳病害的傳播，促進作物的生長[61]；而作物生長產(chǎn)生的大量根際熱區(qū)，如植物根系、真菌菌絲、蚯蚓的影響區(qū)域，有利于營養(yǎng)、水分的匯集，從而產(chǎn)生微生物的活動熱點，為噬菌體與宿主進行基因交流、轉(zhuǎn)導(dǎo)提供條件，最終形成噬菌體-宿主共同進化的發(fā)育模式[62]。

圖4 噬菌體調(diào)控土壤微生物概念模型Fig.4 The conceptual model for regulating soil microbes by phages

2.1 影響生命元素循環(huán)

土壤微生物驅(qū)動著全球生命元素循環(huán)。土壤有機質(zhì)是最大的陸地有機碳、氮儲庫，也是其他營養(yǎng)元素的主要來源?；钴S的土壤微生物通過代謝功能推動土壤有機質(zhì)周轉(zhuǎn)，死亡的土壤微生物細胞內(nèi)殘余的化學(xué)成分不斷積累并最終轉(zhuǎn)化為土壤有機質(zhì)，增加土壤中的有機質(zhì)庫存[63]。因此，噬菌體對微生物宿主的裂解是影響生命元素循環(huán)的重要推動力。噬菌體裂解微生物群落，釋放出大量碳、氮、磷、硫等生命元素，并最終被其他細菌或植物所利用的循環(huán)過程被稱為“病毒路徑 (Viral shunt) ”[1,64-65]。這種裂解機制與外源性捕食者(如原生動物等)的捕食機制不同，外源性捕食者會將細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)帶入更高營養(yǎng)級，從而降低營養(yǎng)物質(zhì)的周轉(zhuǎn)速率；噬菌體使細胞裂解后，促進了營養(yǎng)元素的累積、循環(huán)和轉(zhuǎn)化，因此，有學(xué)者認為從元素循環(huán)的角度，噬菌體的裂解效應(yīng)比原生動物等捕食者的捕食更加關(guān)鍵[60]。

土壤生態(tài)系統(tǒng)中，病毒路徑影響生命元素地化循環(huán)的模型如圖5所示。噬菌體群落對特定宿主專性裂解，細胞成分(細胞膜)、含氮化合物(氨基酸、葡萄糖)和各種胞外產(chǎn)物(EPS、酶、糖蛋白)被重新釋放回土壤環(huán)境中，并作為有機質(zhì)儲存；子代噬菌體相比于宿主細菌富含氮、磷成分，會導(dǎo)致化學(xué)計量學(xué)上的差異，細菌細胞中有大約 10%的碳、15%的氮和 33%的磷營養(yǎng)轉(zhuǎn)變成病毒顆粒成分，難以被其他生物利用，間接影響土壤系統(tǒng)中的養(yǎng)分循環(huán)[4]；噬菌體裂解促進了微生物群落的更替，使大部分細菌都處于活躍的狀態(tài)，代謝功能旺盛，有利于土壤功能群落長期保持活力并最終推動土壤有機質(zhì)的周轉(zhuǎn)。

圖5 病毒路徑影響土壤生態(tài)系統(tǒng)示意圖Fig.5 The diagram of viral shunt influencing soil ecosystem

Emerson等[19]對病毒如何影響永久凍土層中的微生物生態(tài)學(xué)和碳代謝過程進行了研究，結(jié)果表明病毒感染會不同程度地影響微生物對氣候變化的反應(yīng)；病毒編碼的糖苷水解酶包括具有功能活性的甘露聚糖內(nèi)切酶，病毒影響了該生態(tài)系統(tǒng)中復(fù)雜的碳降解，且這些病毒的豐度被視為甲烷動力學(xué)的重要預(yù)測因子。說明病毒可能會影響氣候關(guān)鍵型土壤的生態(tài)系統(tǒng)功能，并對土壤碳循環(huán)具有多種潛在的貢獻。Wei等[66]通過在滅菌土壤中接種不同濃度的土壤懸濁液，培養(yǎng)6周后，以CO2排放量以及16S rRNA和g23基因拷貝數(shù)作為指標(biāo)，判斷T4型噬菌體對土壤有機碳礦化的影響效應(yīng)，結(jié)果表明土壤有機碳礦化受細菌種群大小的調(diào)節(jié)，而細菌種群可能受到了噬菌體自上而下的控制；通過殺死宿主細菌，減少了土壤中CO2的產(chǎn)生，進而降低了土壤有機碳的礦化。

除碳元素以外，生態(tài)系統(tǒng)中的噬菌體也可能在氮、硫、磷等生命元素循環(huán)中發(fā)揮重要作用。Braga等[67]研究了不同組合的噬菌體群落對土壤細菌群落和有效態(tài)氮的影響，并嘗試量化噬菌體驅(qū)動的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化和功能表達，通過16S rRNA擴增子基因測序評估細菌群落的變化，比較活性噬菌體和高壓滅活噬菌體的接種效果，結(jié)果表明噬菌體具有調(diào)節(jié)土壤功能的作用，噬菌體改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，接種活性噬菌體有助于提高土壤銨濃度。Williamson等[59]提出，根際噬菌體對豆科植物-根瘤菌共生的影響可能會影響土壤氮含量。感染根瘤菌的噬菌體是大多數(shù)土壤的原生物種，這些噬菌體與宿主的相互作用決定了土壤中根瘤菌種群能力的強弱，包括有效固氮根瘤菌菌株的生存或死亡、結(jié)瘤的成功與否、以及最終的共生有效性和固氮率。Gao等[68]對不同深度尾礦樣品的病毒群落多樣性及其功能角色進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尾礦深度變化強烈影響了病毒群落的結(jié)構(gòu)、多樣性以及生活方式，深層尾礦病毒攜帶了同化性硫酸鹽還原基因，揭示了病毒在尾礦硫循環(huán)中的重要作用。Kieft等[69]對噬菌體的硫輔助代謝生態(tài)學(xué)開展了相關(guān)研究，結(jié)果表明硫代謝微生物被噬菌體感染后，這些噬菌體可以編碼輔助代謝基因(AMGs)以改變宿主細胞內(nèi)的硫代謝過程；通過分析AMGs的豐度和表達等數(shù)據(jù)顯示，噬菌體對淡水湖泊和海洋中硫、硫代硫酸鹽的氧化有顯著貢獻，并對水熱環(huán)境中硫濃度的變化有敏感的反應(yīng)。

雖然噬菌體被認為可以改變微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成[70]，但這種影響的程度在不同土壤環(huán)境中有著較大的差異[71]。進一步研究生物和非生物因素如何影響病毒對微生物群落的調(diào)控作用，將有利于闡釋噬菌體調(diào)控功能微生物群落的原理和機制。

2.2 影響重(類)金屬轉(zhuǎn)化

噬菌體對重金屬的轉(zhuǎn)化、解毒過程有著重要的影響[72]。噬菌體可以通過與微生物宿主間的水平基因轉(zhuǎn)移 (Horizontal gene transfer, HGT)調(diào)控細菌對重金屬的代謝過程以適應(yīng)環(huán)境的變化[16]。Huang等[30]以不同程度鉻污染的土壤為樣本，研究了噬菌體與宿主微生物群落的共進化動態(tài)，結(jié)果顯示鉻污染對噬菌體以及細菌群落的豐度、多樣性和組成均產(chǎn)生了不利影響；在環(huán)境壓力的脅迫下，溶原性噬菌體的占比與鉻污染水平呈正相關(guān)，噬菌體與細菌的共生作用增強；高鉻污染土壤中，攜帶重金屬抗性基因的噬菌體豐度增加，并顯著地促進了重金屬抗性基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳播，輔助調(diào)節(jié)微生物的解毒過程。 Tang等[29]在砷污染土壤中收集了耐砷細菌胞內(nèi)的噬菌體，從其基因組中發(fā)現(xiàn)了砷抗性基因ArsC和砷甲基化基因arsM，且噬菌體砷功能基因的相對豐度與對應(yīng)的土壤細菌群落中這些基因的豐度呈正相關(guān)；將富集后的噬菌體加入土壤中，其ArsC和arsM基因的相對豐度比對照土壤分別提高了122和575倍，證明噬菌體可以進行砷氧化還原過程的介導(dǎo)，協(xié)助砷還原，并在甲基化的功能微生物群落中發(fā)揮作用，改變土壤中砷的形態(tài)，調(diào)節(jié)土壤砷脅迫的狀態(tài)。

生態(tài)系統(tǒng)中的噬菌體對重(類)金屬循環(huán)具有潛在的調(diào)控作用。以砷的生物地球化學(xué)循環(huán)為例，它是由砷代謝微生物介導(dǎo)的一系列氧化還原反應(yīng)組成，其微生物代謝機制的研究較為完善，主要包括As(V)還原、As(III)氧化和砷甲基化。從噬菌體生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，噬菌體對砷污染土壤解毒功能的調(diào)控主要是通過以砷功能菌為宿主的各類噬菌體發(fā)生侵染，如烈性噬菌體裂解功能微生物細胞以控制微生物群落結(jié)構(gòu)；溫和噬菌體攜帶功能微生物宿主抗性、解毒基因進行水平基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而提高土壤微生物群落整體解毒水平，完成對土壤解毒功能的調(diào)控 (圖6)[11]。

圖6 噬菌體對土壤解毒功能調(diào)控示意圖Fig.6 The diagram of regulating soil detoxification function by phage

實際上，如果將視野擴大到整個生態(tài)系統(tǒng)，以其他功能群落為宿主的噬菌體同樣可能對土壤解毒功能起著潛在的調(diào)控作用。鐵與砷的生物地球化學(xué)循環(huán)耦合關(guān)系最為密切，砷鐵礦的轉(zhuǎn)化是影響砷的生物可利用性的一個重要因子，鐵在氧化條件下生成的Fe(III)礦物能夠顯著地固定砷，進而降低砷的生物可利用性。噬菌體與鐵的關(guān)聯(lián)同樣十分緊密，如“鐵”洛伊木馬(Ferrojan horse)假說[73-74]所提出，部分有尾噬菌體可以利用其宿主的鐵攝取機制，在噬菌體尾部復(fù)合鐵絡(luò)合物，吸引宿主細胞膜表面的鐵受體與其強烈結(jié)合，提供噬菌體遺傳物質(zhì)進入細胞質(zhì)的途徑。噬菌體也有可能附著在鐵礦物上，并隨著礦物的形成、轉(zhuǎn)化、溶解及一系列氧化還原反應(yīng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移，改變噬菌體在土壤中的分布，加強與細菌群落間的接觸與關(guān)聯(lián)。Gao等[75]針對我國酸性礦山環(huán)境中病毒多樣性和生態(tài)功能的研究結(jié)果表明，鐵離子與病毒多樣性和生態(tài)功能多樣性呈正相關(guān)。因此，在進行噬菌體影響砷生物地球化學(xué)循環(huán)的研究中，影響鐵氧化還原等相關(guān)功能的噬菌體對重(類)金屬循環(huán)同樣具有潛在的調(diào)控作用；除直觀的研究目標(biāo)微生物群落與對應(yīng)噬菌體的關(guān)系外，與砷的地化循環(huán)過程耦合的其他元素(如鐵、碳、氮、硫)相關(guān)的噬菌體發(fā)揮了何種作用也值得關(guān)注。

學(xué)術(shù)界對土壤噬菌體的生態(tài)功能和環(huán)境意義的認知也在不斷發(fā)展。多年來，對噬菌體的研究關(guān)注重心放在了噬菌體-宿主的拮抗作用上，而最新的試驗?zāi)Ｐ秃屠碚撨M展表明，這種針對宿主變化、環(huán)境因素影響的感染策略的反饋是動態(tài)且持續(xù)的。Correa等[76]指出，噬菌體對宿主進行感染應(yīng)當(dāng)看作噬菌體與宿主不斷對抗、互助等關(guān)聯(lián)過程中的一個小單元。研究噬菌體與微生物的宿主關(guān)系，應(yīng)擴大關(guān)注的周期，從更宏觀的角度看待長期感染對種群、生態(tài)系統(tǒng)的作用。

3 展望

21世紀以來對海洋病毒生態(tài)學(xué)的重視，噬菌體對海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要作用被逐步認知，推動了土壤噬菌體研究的開啟。土壤噬菌體由于個體微小且無完整的細胞結(jié)構(gòu)，在以往的研究中經(jīng)常被忽視，土壤病毒領(lǐng)域的研究起步落后于海洋病毒領(lǐng)域近20年。土壤是一個固相、液相、氣相組成的高度異質(zhì)性的復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)，這種空間結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了豐富的微生境，從而為細菌等微生物的發(fā)育提供了廣泛的生態(tài)位。除了由土壤結(jié)構(gòu)引起的空間異質(zhì)性以外，農(nóng)業(yè)活動如耕作產(chǎn)生的植物根際也被視作微生物的活動熱點。對土壤噬菌體生態(tài)功能及環(huán)境意義的研究有待進一步深化，今后的研究重點可以關(guān)注如下幾個方面：

1) 通用高效的土壤噬菌體提取方法。不同于海洋水生系統(tǒng)，不同類型的土壤理化性質(zhì)差異巨大，目前仍缺乏針對不同類型土壤的通用高效的噬菌體提取方法。有效提取土壤噬菌體并獲得足夠量噬菌體核酸是深入研究的前提。

2) 裂解性噬菌體與溫和噬菌體的共同關(guān)注。從土壤中洗脫的噬菌體絕大部分為裂解性噬菌體，以洗脫作為前處理工序的研究方法或弱化了溫和型噬菌體的研究；而提取DNA后通過宏基因組識別前噬菌體則主要是針對溫和噬菌體，且測序數(shù)據(jù)量要求較大。今后需要共同關(guān)注土壤中各類噬菌體的生態(tài)功能。

3) 土壤噬菌體與宿主之間的耦合關(guān)系。揭示環(huán)境因子、噬菌體群落、宿主群落三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，從病毒生態(tài)學(xué)角度揭示噬菌體感染土壤微生物、原生動物的環(huán)境與生態(tài)效益，有助于深化對土壤噬菌體生態(tài)功能的認知，尋找通過土壤噬菌體調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)功能的有效途徑。

4) 噬菌體療法。噬菌體療法已被應(yīng)用于如青枯病等植物病害的防治中。今后應(yīng)重點研究噬菌體調(diào)控土壤微生物群落進而調(diào)控生命元素循環(huán)與污染物的脫毒轉(zhuǎn)化，推動該方法在土壤污染治理、面源污染控制、土壤質(zhì)量提升等方面的廣泛應(yīng)用。