季鴻飛， 楊國平,3， 張 琇， 吳凱華， 沈婷婷， 齊玉璽

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 寧夏 銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室， 銀川 750021；3.寧夏五豐農(nóng)業(yè)科技有限公司， 銀川 750021)

播種前使用消毒劑處理種子是一種必要的作物綜合管理方法[1]。消毒劑處理種子會提高種子出苗率、種子活力以及防止種子和土壤傳播真菌病原體[2]，然而消毒劑對種子發(fā)育也有一定的影響。種子消毒劑會影響種子淀粉酶活性，進(jìn)而引起種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的變化[3]。有些消毒劑對作物發(fā)育會造成一定的損傷，為避免來自消毒劑的傷害，作物會上調(diào)某些關(guān)鍵酶，如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等，防止過量活性氧和過氧化氫導(dǎo)致的膜質(zhì)變質(zhì)，并減少有害物質(zhì)如丙二醛(MDA)等的積累，增強作物的抗氧化能力[4]。

玉米是中國第一大糧食作物，2010—2020年間，玉米年均產(chǎn)量增長率為2.66%[5]。由于玉米耐貧瘠、抗旱，對環(huán)境要求低，在中國的種植面積僅次于小麥。國內(nèi)玉米主要用于飼料、工業(yè)和口糧，其中飼料需求和工業(yè)需求約占90%以上[6]，玉米產(chǎn)業(yè)對保障國家糧食安全具有重要的意義。玉米種子表面的病害菌會影響種子的萌發(fā)，通常玉米在種植前需要進(jìn)行種子消毒，種子消毒是玉米健康種植的重要環(huán)節(jié)之一。目前，對于玉米種子消毒的研究大多是在消毒效果和萌發(fā)指標(biāo)上，對玉米幼苗生長以及相關(guān)酶活性影響的研究較少。

本實驗以NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚和乙醇等5種消毒劑對玉米種子進(jìn)行浸種消毒，分析消毒劑對玉米種子消毒效果、萌發(fā)指標(biāo)、幼苗生長和生理生化的影響，旨在篩選出對玉米種子效果最佳的消毒劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為寧單33號玉米種子。種子消毒劑分別為6% NaClO溶液，1% CuSO4溶液，0.1% HgCl2溶液，4%苯酚溶液，75%乙醇溶液。種子培養(yǎng)基為0.8%瓊脂。

1.2 方 法

1.2.1種子萌發(fā)和消毒實驗

選擇大小均勻、飽滿、無損傷、無霉變的玉米種子，放入無菌燒杯中，用75%乙醇沖洗10 s后，再分別用NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇浸泡12 min，以無菌水作為對照組(ck)，各消毒劑處理完后用無菌水沖洗4～5次，將各處理種子浸入無菌水中，放入4 ℃冰箱。浸種12 h，然后將種子接種于無菌瓊脂培養(yǎng)基上，每處理接種40粒，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(18 ℃)。

試驗期內(nèi)，每天對接種后的玉米種子萌發(fā)和污染數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，共統(tǒng)計5 d。種子出現(xiàn)菌毛或種子周邊發(fā)生菌圈，記做污染，并將其余未污染的種子接入新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)觀察。當(dāng)胚根長至0.5 cm時，視為萌發(fā)。

污染率(%)=(累計污染粒數(shù)/總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(累計萌發(fā)粒數(shù)/總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(日最高發(fā)芽種子數(shù)/總粒數(shù))×100%。

1.2.2淀粉酶測定

取第5天發(fā)芽的玉米種子測定淀粉酶活性，測定方法采用DNS顯色法[7]。

1.2.3幼苗根長、株高、鮮重、莖粗的測定

將6種處理已萌發(fā)的種子分別接種于含有無菌沙粒的塑料杯中，進(jìn)行盆栽試驗，每個杯子接種4粒，每個處理重復(fù)3次，置于16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(18 ℃)條件下培養(yǎng)，定期補充植物營養(yǎng)液，并觀察植物的生長狀況，于生長12 d后測量其根長、株高、莖粗和鮮重。

1.2.4SOD、CAT及MDA的測定

12 d后取植物材料，SOD測定采用氮藍(lán)四唑法[8]，CAT測定采用紫外分光光度法[9]，MDA測定參照張春梅[10]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用IBM SPSS Statistics 25.0和GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Tukey法分析顯著性差異，設(shè)定顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對玉米種子發(fā)芽和污染的影響

隨著培養(yǎng)時間的增加，玉米種子的污染率和發(fā)芽率也逐漸增加(圖1)。不同消毒處理間存在顯著性差異，各處理組在第1天污染率都為0，第2天除HgCl2處理組外，其余消毒劑處理均出現(xiàn)污染，第3天到第5天NaClO、ck污染率顯著上升，分別增加了44.16%和36.67%。CuSO4、苯酚處理組的污染率隨天數(shù)呈平穩(wěn)的上升趨勢，乙醇處理組第4天到第5天時污染率顯著上升，增加了22.5%。到第5天HgCl2處理才出現(xiàn)種子染菌，培養(yǎng)5 d后，NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇、ck處理組污染率分別為48.33%、13.33%、1.67%、17.5%、44.17%、50%，HgCl2處理組染菌率最低。培養(yǎng)5 d后，NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇、ck處理組萌發(fā)率分別為96%、100%、95%、60%、93%、96%。苯酚處理組會抑制種子的萌發(fā)，發(fā)芽率和發(fā)芽勢最低(圖1、圖2)，其余消毒劑處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率沒有顯著差異。綜合來看，HgCl2不影響種子的萌發(fā)，且染菌率最低，其消毒效果要優(yōu)于其他4種消毒劑。

圖1 消毒劑對玉米種子發(fā)芽率和污染率的影響Fig.1 Effects of disinfectant on germination rate and contamination rate of maize seeds

圖2 不同處理玉米種子的發(fā)芽勢Fig.2 Germination potential of maize seeds under different treatments

2.2 消毒劑對玉米種子淀粉酶的影響

不同消毒劑處理的玉米種子淀粉酶活性差異明顯(圖3)，各處理組α-淀粉酶活性為：乙醇>NaClO>ck>苯酚>CuSO4>HgCl2，乙醇、NaClO處理組均會提高α-淀粉酶活性，與ck相比沒有顯著差異。苯酚、CuSO4處理組會降低α-淀粉酶活性，但與ck相比沒有顯著差異。HgCl2處理組α-淀粉酶活性最低，與ck相比存在顯著差異，酶活性較ck降低了68.92%。各處理組β-淀粉酶活性為：ck>苯酚>乙醇>HgCl2>NaClO>CuSO4。5種消毒劑處理均會降低β-淀粉酶活性，其中苯酚處理組β-淀粉酶活性與ck相比沒有顯著差異，乙醇、HgCl2、NaClO、CuSO4處理組β-淀粉酶活性與ck相比存在顯著差異，酶活性較ck分別降低了27%、38%、45.1%、51.41%，CuSO4處理組β-淀粉酶活性最低。HgCl2處理會顯著降低α-淀粉酶活性；乙醇、HgCl2、NaClO、CuSO4處理會顯著降低β-淀粉酶活性，HgCl2會顯著抑制玉米種子淀粉酶活性，對淀粉酶活性影響最大。

圖3 消毒劑對玉米種子淀粉酶活性的影響 Fig.3 Effects of disinfectant on amylase activity of maize seeds

2.3 消毒劑對玉米幼苗根長、株高、鮮重、莖粗的影響

在無菌瓊脂培養(yǎng)基上生長5 d后，玉米種子幼根生長存在差異，NaClO處理組對幼根有一定促進(jìn)作用，HgCl2和乙醇處理組對幼根有一定的抑制作用，CuSO4和苯酚對幼根的抑制現(xiàn)象明顯。

5種消毒劑處理12 d的玉米幼苗生長指標(biāo)也存在差異(表1)，苯酚、CuSO4和乙醇處理會抑制玉米幼苗根的生長，苯酚處理與ck相比沒有顯著差異，CuSO4和乙醇處理與ck相比根的長度顯著減小，分別降低23.5%和20.9%。5種消毒劑對玉米幼苗株高影響不大，沒有顯著差異。各消毒劑處理均會降低玉米幼苗的鮮重，其中乙醇處理會顯著降低玉米幼苗的鮮重，與ck相比降低了26.2%，其余組與ck相比沒有顯著差異。CuSO4、NaClO和HgCl2處理會提高玉米幼苗的莖粗，乙醇和苯酚處理會降低玉米幼苗的莖粗，但是都沒有顯著差異。從上述5種消毒劑對玉米幼苗的生長指標(biāo)來看，NaClO對玉米幼苗生長的影響最小，其次是HgCl2，乙醇、苯酚和CuSO4都會對玉米幼苗的生長產(chǎn)生一定的影響。

表1 消毒劑處理玉米種子幼苗的根長、株高、鮮重、莖粗Table 1 Root length,plant height,fresh weight and stem diameter of corn seeds treated with disinfectants

2.4 消毒劑對玉米幼苗SOD、CAT活性和MDA含量的影響

試驗組均會提高玉米幼苗SOD活性(圖4 A)，CuSO4和乙醇處理組SOD活性較ck相比顯著上升，分別增加了89.13 U/g和108.15 U/g。HgCl2、NaClO和苯酚處理組SOD活性會略有上升，但與ck相比沒有顯著差異。CuSO4和乙醇處理組會顯著提高玉米幼苗葉片的SOD活性。

圖4 消毒劑對玉米幼苗SOD、CAT和MDA含量的影響Fig.4 Effects of disinfectant on activities of SOD,CAT and MDA content in maize seedlings

由圖4 B可知，NaClO處理CAT活性最高，酶活性較ck增長了84%，存在顯著差異。HgCl2處理較ck相比酶活性增加61.28%，具有顯著差異。乙醇處理略高于ck，無顯著差異。CuSO4、苯酚處理酶活性與ck相差無幾，沒有顯著性差異。NaClO、HgCl2、乙醇處理均會提高玉米幼苗SOD活性，其中NaClO處理活性提高最為明顯。

HgCl2、乙醇、苯酚處理組的玉米幼苗葉片MDA含量與ck相比沒有顯著差異(圖4 C)。與ck相比，CuSO4處理組MDA含量提高了0.003 4 μmol/g，但是差異不顯著。NaClO處理組MDA含量最高，達(dá)到了0.021 2 μmol/g，與ck相比提高了72.3%，差異顯著，NaClO處理會顯著增加玉米幼苗葉片中的MDA含量。其他消毒劑對MDA含量的影響較小，幾乎不會累積MDA。

3 討 論

探討了消毒劑對玉米種子的消毒效果、種子萌發(fā)、幼苗生長和相關(guān)酶活性的影響。NaClO、CuSO4、HgCl2、乙醇等種子消毒劑，常被應(yīng)用于蔬菜、作物及其他經(jīng)濟(jì)植物種子的消毒[11-13]，苯酚則常應(yīng)用于醫(yī)療器械的消毒[14]。種子消毒效果通常用污染率[12]、發(fā)芽率和發(fā)芽勢來評價[15]。

欒博宇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿種子用HgCl2消毒時，種子發(fā)芽率會降低；NaClO對頭花蓼種子消毒后，發(fā)芽率顯著降低[17]；乙醇處理毛紅椿種子會使種子活力下降，但CuSO4會提高種子活力[18]，這與本試驗結(jié)果有所差別。本試驗結(jié)果表明，苯酚會抑制種子的萌發(fā)，降低種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，其余4種消毒劑對玉米種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響較小。其原因可能是苯酚不易溶于水，在沖洗的過程中很難完全去除，在玉米種子表面有殘留，其他消毒劑水溶性較好，在種子表面殘留較少，對種子萌發(fā)的影響較小，同時玉米種子沒有外殼，更易于萌發(fā)。苯酚作為醫(yī)療器械的消毒劑并不適宜于玉米種子的消毒。

祿亞洲等[19]通過比較不同消毒劑對西藏龍膽種子消毒效果，發(fā)現(xiàn)HgCl2消毒效果最好；NaClO處理煙草種子不僅不會影響種子的發(fā)芽，消毒效果也最佳[11]；其他試驗結(jié)果表明，CuSO4是更適合小桐種子的消毒劑[20]。本試驗結(jié)果表明，0.1%HgCl2對玉米種子消毒效果最好，污染率最低，而這可能與玉米種子體積較大表面光滑的特性有關(guān)。

試驗結(jié)果表明，苯酚、CuSO4和乙醇處理會抑制玉米幼苗根的生長。研究發(fā)現(xiàn)，某些種子在萌發(fā)過程中會產(chǎn)生苯酚類抑制物，此外在一些連作障礙植物的根際土壤中也會存在苯酚類的抑制物，對種子萌發(fā)和根的生長有顯著抑制影響[21-22]，同時銅離子還會抑制幼苗根尖的有絲分裂，使胚根的生長受到抑制[23]，這可能也是苯酚和CuSO4抑制玉米幼根生長的原因。高玉蓮等[24]發(fā)現(xiàn)，高濃度的乙醇提取物會抑制高粱根的長度，而其他研究表明，乙醇提取物不僅會對植物根的生長產(chǎn)生抑制，也會對植物的鮮重產(chǎn)生一定的影響[25]。本試驗中乙醇處理會減少玉米幼苗根的長度和鮮重可能與上述研究原因相似。

玉米等禾谷類植株幼苗萌發(fā)生長所需要的主要碳源儲存在胚乳或子葉等種子器官中，作為淀粉儲備[26]。在玉米種子萌發(fā)過程中，種胚向胚乳分泌天然赤霉素。這些激素誘導(dǎo)糊粉層中水解酶的發(fā)育，其中就包含淀粉酶[27]。淀粉酶分解儲備的淀粉，以蔗糖的形式運輸?shù)缴L中的胚芽和胚根中，促進(jìn)種子的呼吸作用，為胚根、胚芽生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源[28]。植物體的淀粉酶根據(jù)水解淀粉產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)型可分為α-淀粉酶或者β-淀粉酶[29]。α-淀粉酶是種子萌發(fā)初期最重要的水解酶[30]，水解玉米種子中約90%的淀粉[31]。β-淀粉酶分解淀粉產(chǎn)生麥芽糖和有限糊精，在禾谷類種子萌發(fā)過程中，同樣起到重要的作用[32]。結(jié)果表明，CuSO4和HgCl2消毒處理會降低玉米種子的淀粉酶活性。已有研究發(fā)現(xiàn)證實，一定濃度的銅離子和汞離子會抑制種子淀粉酶活性[33-34]。

非生物脅迫(干旱、溫度、鹽堿、光照、重金屬等)會引發(fā)植物次級氧化脅迫,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成體內(nèi)大量ROS和MDA的積累，進(jìn)而引起SOD和CAT活性升高來清除ROS[35-36]。趙奇等[37]發(fā)現(xiàn)，一定濃度的CuSO4會提高玉米幼苗的SOD活性；Li等[38]通過乙醇處理草莓發(fā)現(xiàn)，乙醇能夠提高草莓SOD活性。楊小胡等[39]研究發(fā)現(xiàn)，NaClO水浴處理會提高板栗的CAT活性，同時會引起MDA的積累；其他研究也表明，一定濃度的汞離子會提高植物CAT活性[40]。本試驗結(jié)果表明，不同消毒劑處理過的玉米幼苗抗氧化酶活性存在差異，CuSO4和乙醇處理的玉米幼苗SOD活性較高，NaClO和HgCl2處理玉米幼苗CAT活性較高，同時NaClO處理MDA積累量最高，推測消毒劑浸泡會對植物造成一定的脅迫，會造成抗氧化酶活性的上調(diào)，同時也會引起一些有害物質(zhì)的積累。

4 結(jié) 論

通過使用5種消毒劑對玉米消毒，通過萌發(fā)指標(biāo)、生長指標(biāo)和相關(guān)生理指標(biāo)的測定和分析，HgCl2處理組染菌率低，其消毒效果最好，同時HgCl2對玉米萌發(fā)影響較小，對玉米幼苗的影響較小。雖然HgCl2會對種子的淀粉酶產(chǎn)生一定的影響，但是不會對玉米的后續(xù)生長產(chǎn)生脅迫，對POD、CAT活性和MDA含量影響較小。因此，在對玉米種子消毒時，采用75%乙醇預(yù)處理10 s加0.1% HgCl2浸泡12 min為宜。