陳華錚，王僑，朱凱

(南京林業(yè)大學(xué)化工工程學(xué)院，江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

墨西哥柏木(Cupressuslusitanice)又可稱為露絲柏，具有耐干旱瘠薄、抗病蟲、生長(zhǎng)速度較快等特性，是優(yōu)良的速生用材樹(shù)種[1]。墨西哥柏木的莖葉果實(shí)中含有豐富的柏木精油，其具有抗氧化、抑菌殺菌及殺蟲驅(qū)蟲的作用。突尼斯柏(CupressussempervirensL.)精油[2]對(duì)2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(DPPH)和2,2′-疊氮基雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用。DPPH自由基的清除試驗(yàn)中CupressusarizonicaGreene精油[3]表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化活性。Tavares等[4]通過(guò)ABTS法研究分析，發(fā)現(xiàn)墨西哥柏木精油顯示出較好的抗氧化能力，清除效果為68%～70%。Hassanzadeh等[5]通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取的柏木油對(duì)蠟樣芽孢桿菌和黑曲霉表現(xiàn)出良好的抑制效果。Kuiate等[6]發(fā)現(xiàn)中柏木葉油對(duì)奧杜盎氏小孢子菌、蘭哥倫小孢子菌和紅色毛癬菌的最小抑菌濃度為275 μg/mL。Bett等[7]發(fā)現(xiàn)墨西哥柏木精油對(duì)菜豆象和麥蛾殺滅效果最好，接觸毒性的半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.11%，空間熏蒸的半致死體積分?jǐn)?shù)為4.07～7.02 μL/L。當(dāng)大果柏精油質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，對(duì)尖音庫(kù)蚊幼蟲的致死率達(dá)52%，同時(shí)也能使蛹和成蟲死亡[8]。

上述研究中多為考察不同樹(shù)種精油之間的差異，或只針對(duì)某單一生物活性指標(biāo)做研究。筆者則以不同化學(xué)類型的墨西哥柏木葉精油為研究對(duì)象，主要包括蒎烯型、石竹烯型、檜烯型、依蘭油型、檸檬烯型、香紫蘇型，并綜合研究分析其體外抗氧化能力和殺菌抑菌能力，以及通過(guò)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)來(lái)評(píng)估其殺蟲驅(qū)蟲活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料為本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行分類的墨西哥柏木葉精油[9]，主要分為蒎烯型、石竹烯型、檜烯型、依蘭油型、檸檬烯型、香紫蘇型6種類型。

1.2 柏木葉精油體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.1 ABTS+自由基清除能力試驗(yàn)

將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液按體積比1∶1混合，置于暗室中12～16 h。使用前無(wú)水乙醇稀釋，調(diào)節(jié)其在734 nm處的吸光度為0.700±0.002。配制一系列質(zhì)量濃度的精油乙醇溶液，并將精油溶液與ABTS工作液按體積比1∶1混合，避光放置6 min。乙醇為空白對(duì)照，丁基羥基茴香醚(BHA)為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)文獻(xiàn)[10]計(jì)算ABTS+自由基清除率。

1.2.2 DPPH自由基清除能力試驗(yàn)

配制0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液。配制一系列質(zhì)量濃度的精油乙醇溶液，并將精油溶液與DPPH工作液按體積比1∶1 混合，避光放置30 min。乙醇為空白對(duì)照，BHA為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)文獻(xiàn)[11]計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3 柏木葉精油抑菌活性測(cè)定

1.3.1 抑菌圈直徑測(cè)定試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)中，移取100 μL活化后菌液，加入至100 mL 60～70 ℃的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，隨后等量倒入一次性塑料培養(yǎng)皿中風(fēng)干。移取5 μL精油丙酮溶液滴加在直徑為6 mm濾紙片上，將濾紙片貼于固體培養(yǎng)基上(丙酮為空白對(duì)照)，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用十字測(cè)量法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗(yàn)

以丙酮作為稀釋劑配置精油溶液，用二倍稀釋法稀釋精油溶液為不同濃度梯度。每組準(zhǔn)備3支帶塞試管和培養(yǎng)基一起放入滅菌鍋滅菌，在每組第1支試管中分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的精油溶液和5 mL培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照。取750 μL菌液于培養(yǎng)基中稀釋100倍并混合均勻，在每組的第2支和第3支試管中分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的精油溶液以及5 mL混有菌液的培養(yǎng)基，進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分，酒精燈灼燒試管口，保持無(wú)菌操作環(huán)境。樣品質(zhì)量濃度從7.50至120.00 mg/mL 不等，以丙酮溶液作為對(duì)照組。將試管搖勻后置于37 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，以此記錄精油的最小抑菌濃度(MIC)。而后將試管置于搖床中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，以此記錄精油的最小殺菌濃度(MBC)。

1.4 柏木葉精油殺蟲驅(qū)蟲活性測(cè)定

1.4.1 秀麗隱桿線蟲同步化試驗(yàn)

待秀麗隱桿線蟲體內(nèi)含大量卵時(shí)，按照參考文獻(xiàn)[12]的方法對(duì)其進(jìn)行同步化。

1.4.2 即時(shí)毒殺試驗(yàn)

待同步化后的秀麗線蟲成長(zhǎng)至L4期時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有大腸桿菌OP50的新鮮培養(yǎng)基中，空白對(duì)照組加入2%二甲亞砜(DMSO)水溶液，處理組分別加入用2%DMSO水溶液配置的一系列濃度的柏木葉精油溶液，而后放入20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄死亡蟲數(shù)，每組重復(fù)3次。死亡率及校正死亡率計(jì)算參考文獻(xiàn)[13]。

1.4.3 體內(nèi)抗氧化酶活性試驗(yàn)

將同步化后的L4期秀麗隱桿線蟲用10和100 mg/L的精油溶液處理24 h后(2%DMSO水溶液為空白對(duì)照)，參考過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行體內(nèi)抗氧化酶活性測(cè)試試驗(yàn)。

1.4.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)試驗(yàn)

同步化后的L4期秀麗隱桿線蟲用100 mg/L的精油溶液處理24 h后(2%DMSO水溶液為空白對(duì)照)，將其轉(zhuǎn)移至含有大腸桿菌OP50的新鮮培養(yǎng)基中，加入5 mmol/L H2O2，在20 ℃培養(yǎng)5 h后，觀察記錄死亡蟲數(shù)，每組重復(fù)3次。死亡率及校正死亡率計(jì)算參考文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

對(duì)6種不同化學(xué)型的墨西哥柏木葉精油的體外抗氧化能力、殺菌抑菌能力，以及殺蟲驅(qū)蟲活性進(jìn)行了研究。

2.1 柏木葉精油體外抗氧化能力分析

2.1.1 柏木葉精油對(duì)ABTS+自由基清除結(jié)果

6種不同化學(xué)型的柏木葉精油對(duì)ABTS+自由基的清除效果見(jiàn)表1。

表1 6種不同化學(xué)型柏木葉精油對(duì)ABTS+自由基的LC10Table 1 Six C. lusitanice essential oils against ABTS+ at LC10

由表1可知，6種不同化學(xué)型的柏木葉精油對(duì)ABTS+自由基均具有一定的清除能力，其中香紫蘇型的效果最好，LC10(清除率為10%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度)為1.013 4 mg/mL，而后依次為依蘭油型、石竹烯型和蒎烯型、檸檬烯型，檜烯型的效果最差，LC10高達(dá)5.486 6 mg/mL。

2.1.2 柏木葉精油DPPH自由基清除結(jié)果

6種不同化學(xué)型的柏木葉精油對(duì)DPPH自由基的清除效果見(jiàn)表2。由表2可知，6種不同化學(xué)型的柏木葉精油對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力，其中依蘭油型的效果最好，LC10為0.893 1 mg/mL，而后依次為檸檬烯型、蒎烯型、香紫蘇型、檜烯型。石竹烯型的效果最差，LC10高達(dá)2.543 9 mg/mL。

表2 6種不同化學(xué)型柏木葉精油對(duì)DPPH自由基的LC10Table 2 Six C. lusitanice essential oils against DPPH at LC10

2.2 柏木葉精油抑菌活性分析

2.2.1 柏木葉精油的抑菌圈直徑試驗(yàn)結(jié)果

6種化學(xué)型的柏木精油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，依蘭油型對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑均在11 mm左右，屬于高敏[14]；檸檬烯型對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑在11 mm左右，屬于高敏；香紫蘇型對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制效果都較好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑均在11 mm左右，屬于高敏；檜烯型對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑均在9.6 mm左右，屬于中敏；石竹烯型對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制效果最好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑均在9.7 mm左右，屬于中敏；蒎烯型對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，抑菌圈直徑均在9.7 mm左右，屬于中敏。6種化學(xué)型的柏木精油中，香紫蘇型的效果最好，對(duì)4種菌都有較高的抑制作用，其次是依蘭油型和檸檬烯型。

表3 6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone of six C. lusitanice essential oils

2.2.2 精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

墨西哥柏木葉精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，6種化學(xué)型的柏木精油都表現(xiàn)出對(duì)枯草芽孢桿菌抑制滅殺活性最強(qiáng)，其中又以依蘭油型和香紫蘇型最佳，MIC和MBC分別為3.75和7.50 mg/mL。而檸檬烯型、檜烯型、石竹烯型和蒎烯型對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為7.50 mg/mL，MBC為15.00 mg/mL。Salem等[15]用水蒸氣蒸餾法提取了大果柏枝干部分的精油，其對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC分別為0.07和0.15 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.31和0.63 mg/mL，GC-MS分析得其以4-萜烯醇、α-水芹烯和α-香茅醇為主要成分。

表4 6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 4 MIC and MBC of six C. lusitanice essential oils

2.3 柏木葉精油殺蟲和驅(qū)蟲活性分析

2.3.1 即時(shí)毒殺能力

6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油對(duì)秀麗隱桿線蟲的致死率見(jiàn)圖1。從圖1可知，6種化學(xué)型的柏木精油對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒殺能力都隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。在低質(zhì)量濃度10 mg/L時(shí)，檸檬烯型的毒殺能力最強(qiáng)，線蟲的死亡率為29.90%，石竹烯型的毒殺效果最差，線蟲的死亡率僅為1.03%；當(dāng)質(zhì)量濃度大于200 mg/L時(shí)，對(duì)線蟲的毒性能力強(qiáng)弱則趨于穩(wěn)定，香紫蘇型>檸檬烯型>蒎烯型>檜烯型>依蘭油型>石竹烯型。

圖1 6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油作用后秀麗隱桿線蟲的死亡率Fig. 1 Mortality of C. elegans treated with six C. lusitanice essential oils

2.3.2 對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性影響

抗氧化酶活性在受到抑制的情況下，線蟲體內(nèi)氧化和抗氧化平衡被破壞，致使線蟲壽命縮短。6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)酶活性影響見(jiàn)圖2。由圖2可知：在10 mg/L質(zhì)量濃度下，蒎烯型、石竹烯型、檜烯型、依蘭油型和檸檬烯型對(duì)過(guò)氧化氫酶起促進(jìn)作用，而香紫蘇型則對(duì)過(guò)氧化氫酶起抑制作用；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，蒎烯型、石竹烯型、檜烯型依舊對(duì)過(guò)氧化氫酶起促進(jìn)作用，依蘭油型和檸檬烯型則表現(xiàn)出對(duì)過(guò)氧化氫酶的抑制作用，香紫蘇型則變化為提高了過(guò)氧化氫酶活性；6種精油都表現(xiàn)出對(duì)谷胱甘肽酶活性的抑制作用，蒎烯型、依蘭油型、檸檬烯型和香紫蘇型隨著質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，石竹烯型和檜烯型則隨著質(zhì)量濃度的升高抑制作用有所減弱；對(duì)于超氧化物歧化酶，6種精油也都起到了抑制的作用，蒎烯型、依蘭油型、檸檬烯型和香紫蘇型隨著質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，石竹烯型和檜烯型則隨著濃度的升高抑制作用有所減弱。質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，檸檬烯型對(duì)過(guò)氧化氫酶的抑制作用最強(qiáng)，香紫蘇型對(duì)谷胱甘肽酶的抑制效果最好，蒎烯型對(duì)超氧化物歧化酶的抑制作用最好。

圖2 6種不同化學(xué)型墨西哥柏木葉精油作用后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)酶活性Fig. 2 Enzyme activity of C. elegans treated with six C. lusitanice essential oils

2.3.3 對(duì)秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激影響

6種不同化學(xué)型柏木精油的氧化應(yīng)激能力結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)100 mg/L的6種不同化學(xué)型柏木精油處理過(guò)的秀麗隱桿線蟲，在暴露于大量的活性氧中時(shí)，死亡率較之空白對(duì)照組都有較大的提升，其中香紫蘇型的增幅最高，約為空白對(duì)照組的2倍，其次為檸檬烯型和蒎烯型，石竹烯型的增幅最少，約為空白對(duì)照組的1.24倍。

圖3 6種不同化學(xué)型柏木精油處理后線蟲的氧化應(yīng)激死亡率Fig. 3 Mortality from oxidative stress of C. elegans treated with six C. lusitanice essential oils

3 結(jié) 論

墨西哥柏木葉精油具有較強(qiáng)抗氧化性、抑菌性以及殺蟲活性。研究結(jié)果顯示，6種不同化學(xué)型柏木葉精油的抗氧化、抗菌殺菌和驅(qū)蟲殺蟲活性存在一定的差異性：

1)香紫蘇型對(duì)ABTS+自由基的清除效果最好，依蘭油型對(duì)DPPH自由基的清除效果最優(yōu)。

2)香紫蘇型、依蘭油型和檸檬烯型的抑菌殺菌效果最佳，又對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅能力最為突出。

3)香紫蘇型對(duì)秀麗隱桿線蟲的即時(shí)毒殺能力最強(qiáng)；檸檬烯型、香紫蘇型和蒎烯型抑制體內(nèi)酶活的能力較為突出；香紫蘇型能較強(qiáng)烈地破壞線蟲體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，加速線蟲死亡。

綜合考慮，在6種化學(xué)類型精油中，香紫蘇型具有最強(qiáng)的生物活性。墨西哥柏木葉精油具有較強(qiáng)生物活性，可以應(yīng)用于護(hù)膚品領(lǐng)域，亦可復(fù)配于抑菌劑、殺蟲劑中，綠色環(huán)保。研究墨西哥柏木葉精油生物活性，為拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。