陶鴿如， 秦樹存

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）泰山氫生物醫(yī)學(xué)研究院，山東 泰安 271000

自由基是細(xì)胞代謝的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等，其主要由線粒體在合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的過程中產(chǎn)生［1］。在生理?xiàng)l件下，ROS和RNS是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御病毒感染、調(diào)節(jié)氧化還原等細(xì)胞生物學(xué)過程中的重要組成成分［2］。然而，自由基的過量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能造成氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激實(shí)際上反映了ROS的生成與細(xì)胞降解有害中間產(chǎn)物能力之間的生理失衡，以及由此造成的損傷。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生與各種疾病相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病、癌癥等［1］。為了減少氧化自由基造成的組織損傷，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些抗氧化的藥物，并由此誕生了自由基醫(yī)學(xué)。但長(zhǎng)期大量使用抗氧化藥物帶來的真實(shí)益處比較有限。近年來，有研究表明，人工合成的抗氧化劑在動(dòng)物疾病模型中具有治療作用［3］，但這些抗氧化劑仍未廣泛應(yīng)用于臨床。因此，如何探尋更適宜的抗氧化劑，既能有效清除有害自由基，又不干擾細(xì)胞固有的生理性氧化還原反應(yīng)，已成為目前研究的難點(diǎn)。2007年，日本醫(yī)科大學(xué)的Ohsawa等［4］發(fā)現(xiàn)H2是一種新型的選擇性抗氧化劑，僅針對(duì)有害的氧化自由基，可有效避開對(duì)生理性氧化自由基的干擾。此外，吸入2%～4%安全劑量的H2即可對(duì)缺血性腦損傷起到保護(hù)作用。醫(yī)用氣體的生物安全性一直是其推廣應(yīng)用的前提，而H2的生物安全性在潛水醫(yī)學(xué)中已得到認(rèn)可［5］。

美國(guó)貝勒大學(xué)Bell等［6］早在1975年就報(bào)道過H2的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)作用，他們用8個(gè)大氣壓下的97.5%的H2吸入治療動(dòng)物模型的皮膚鱗癌，取得了明顯的效果。近年來，多學(xué)科科學(xué)家相繼開展了一系列的動(dòng)物模型研究，為H2治療提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并在關(guān)節(jié)炎［7］、代謝綜合征［8］等領(lǐng)域進(jìn)行了初步臨床試驗(yàn)，并得到了較好的結(jié)果。H2能夠減少呼吸道的阻力，從而提高氧氣進(jìn)入肺部的能力，在抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情中，H2也發(fā)揮了重要的作用［9］。然而，解析H2緩解各類疾病的分子機(jī)制仍是一個(gè)難點(diǎn)。在多年的基礎(chǔ)研究中，人們逐漸了解H2的作用并不是針對(duì)某個(gè)單一的分子，而是影響了復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，因此，闡明H2生物學(xué)效應(yīng)的作用對(duì)于全面理解其生物醫(yī)學(xué)作用具有重要意義。目前H2的研究主要集中于抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞器保護(hù)和自噬方面的細(xì)胞保護(hù)作用等方面（圖1）?；诖耍疚臍w納了近年來體外無細(xì)胞系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的研究進(jìn)展，并梳理了目前關(guān)于H2生物醫(yī)學(xué)機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展，以期為該領(lǐng)域的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 H2應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的主要生物學(xué)效應(yīng)Fig.1 The main biological effects of hydrogen molecular under oxidative stress

1 H2的抗氧化作用

1.1 H2對(duì)氧化自由基的清除作用

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，自由基的形成主要發(fā)生在線粒體呼吸鏈、溶酶體吞噬消化、前列腺素合成和細(xì)胞色素P450系統(tǒng)活化的過程中，除信號(hào)調(diào)控作用外，超氧化物和過氧化氫等物質(zhì)可以與多種大分子發(fā)生反應(yīng)，包括膜脂、蛋白質(zhì)和DNA等，因此，過量的氧化自由基會(huì)造成細(xì)胞損傷［10］。作為一種新型的抗氧化劑，H2被證實(shí)具有清除羥基自由基（·OH）的能力［4］。羥基自由基是O2-與H2O2在Fe2+或Cu+存在的情況下發(fā)生芬頓反應(yīng)生成的毒性最大的活性氧自由基。由于·OH不能被酶清除，需要依賴螯合游離金屬離子或?qū)2O2轉(zhuǎn)化為其他化合物。有研究證明，H2在無細(xì)胞系統(tǒng)中能夠與·OH直接反應(yīng)，并通過對(duì)過氧化產(chǎn)物的定量，可以減小在老齡化［11］、缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［12］等動(dòng)物模型中的氧化自由基。然而，因?yàn)椤H與H2的反應(yīng)速率（·OH+H2=H2O+H·）較大多數(shù)自由基-自由基反應(yīng)更慢，這種·OH消除作用是否通過簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)還有待進(jìn)一步確定。以上研究表明，H2能夠降低病理過程中細(xì)胞內(nèi)的·OH等氧化自由基。

1.2 H2對(duì)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用

研究表明，H2也可增強(qiáng)內(nèi)源抗氧化酶的表達(dá)，從而進(jìn)一步改善氧化應(yīng)激，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）將超氧化物陰離子（ROS的主要產(chǎn)物）轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的H2O2；過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）將H2O2還原為H2O，構(gòu)成細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的第一道防線［3］。研究表明，在高血壓［13］和腎損傷［14］動(dòng)物模型中，H2處理升高了SOD、CAT和GPx的表達(dá)。同時(shí)，在自發(fā)性高血壓大鼠的腎損傷［14］和破骨細(xì)胞分化因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化［15］研究中，H2能夠降低某些類型免疫細(xì)胞在吞噬過程中由NADPH氧化酶（NADPH oxidases，NOX）的表達(dá)，從而減少其產(chǎn)生的自由基。線粒體ROS對(duì)促進(jìn)細(xì)胞死亡至關(guān)重要，但僅由線粒體產(chǎn)生的ROS并不能引發(fā)細(xì)胞死亡，而是需要通過后續(xù)的NOX作用持續(xù)積累ROS。以上研究表明，H2可能并不僅是一種簡(jiǎn)單的自由基清除劑，還可能是一種信號(hào)調(diào)節(jié)因子。

1.3 H2對(duì)Nrf2抗氧化通路的激活作用

紅系衍生核因子2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)抗氧化能力，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激和炎癥引發(fā)的損傷。Nrf2通路的激活可啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)，包括通過SOD誘導(dǎo)超氧化物和過氧化物分解代謝、氧化輔助因子和蛋白再生、氧化還原轉(zhuǎn)運(yùn)增加等通過多種機(jī)制影響ROS和RNS的穩(wěn)態(tài)［16］。在探索 H2改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性［17］、敗血癥腦損傷［18］等機(jī)制的研究中，Nrf2通路在氧化應(yīng)激條件下被激活，而H2處理能夠進(jìn)一步增強(qiáng)Nrf2的活化。H2可以提高Nrf2的表達(dá)，從而促進(jìn)其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位［17］。因此，下游效應(yīng)分子包括HO-1、SOD和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)錄得到激活。此外，在體外研究中，利用小干擾RNA阻斷Nrf2可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)大量的ROS和器官損傷；同時(shí)，H2處理對(duì)Nrf2敲除小鼠的改善作用甚微，這表明H2的有益作用依賴于Nrf2通路的激活［18］。以上研究表明，H2能夠通過激活Nrf2通路從而上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá)。

2 H2對(duì)炎癥和細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的改善作用

在一項(xiàng)關(guān)于H2的早期研究中，將患有血吸蟲病相關(guān)慢性肝炎癥的大鼠放置在含有0.7 MPa H2的高壓室中2周，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）有所減少［19］。之后有研究者在煙霧吸入損傷［20］、結(jié)腸炎癥［21］中，使用濃度較低的H2或富氫鹽水均取得了相似的結(jié)果。TNF是一種多效細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、免疫應(yīng)答和凋亡的多方面細(xì)胞生物學(xué)過程。因此，涉及核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)合物是功能上相互依賴的信號(hào)因子，它們?cè)贖2的作用下也會(huì)發(fā)生表達(dá)或活性變化。NF-κB是促炎細(xì)胞因子的主要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞的分化和凋亡，同時(shí)也是H2系統(tǒng)調(diào)控的關(guān)鍵組成部分。線粒體產(chǎn)生的ROS是TNF-α和白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）激活NF-κB的第2信使，能夠上調(diào)NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中的活化、細(xì)胞核轉(zhuǎn)位進(jìn)而激活該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［22］。H2處理能夠降低 NF-κB的活化和NF-κB依賴性炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，使NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位減少，而駐留在細(xì)胞質(zhì)中的核因子 κB 的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）增加［23］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，H2處理降低了促炎細(xì)胞因子和趨化因子的水平，包括IL-1β、IL-6以及高遷移率組框 1（high-mobility group box 1，HMGB-1）和趨化因子CCL2，并上調(diào)了抗炎細(xì)胞因子IL-10［23］。以上研究證實(shí)了H2的抗炎作用，這是氫生物醫(yī)學(xué)最顯著的生物學(xué)效應(yīng)之一。

在使用多種人類疾病動(dòng)物模型的研究中，通過脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測(cè)和/或 Caspases的定量分析，使得H2的抗凋亡特性也得到了充分的證明，如在腎缺血再灌注損傷模型中，H2處理上調(diào)了Bcl-2/Bax（抗凋亡/促凋亡蛋白）的比值，并降低了Caspase-8（外源性途徑）、Caspase-9（內(nèi)源性途徑）和Caspase-3（內(nèi)源性途徑的結(jié)局）的表達(dá)，改善了內(nèi)源性及外源性的細(xì)胞凋亡［24］。同時(shí)，H2處理對(duì)線粒體也有保護(hù)作用：H2能夠通過抑制JNK通路，保護(hù)線粒體膜電位、緩解線粒體腫脹，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎中的細(xì)胞凋亡及人軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解［25］。

腫瘤細(xì)胞中過量的ROS不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成明顯的傷害，過量的ROS甚至可能激活細(xì)胞增殖和代謝的信號(hào)通路，但H2對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響是相反的，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，用H2降低ROS水平，會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，60% H2可促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549和H1975的凋亡，80% H2可誘導(dǎo)其快速凋亡［27］。

H2對(duì)自噬的影響在不同的病理?xiàng)l件下存在差異，如在大鼠血管性癡呆模型中，H2處理可降低LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1表達(dá)，誘導(dǎo)p62表達(dá)，抑制Foxo1-Atg7依賴的自噬［28］；在大鼠心肌 I/R 模型中，H2處理降低了Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，電鏡顯示自噬體明顯減少［11］。然而，在急性腎損傷誘導(dǎo)的腎纖維化模型的結(jié)果卻完全相反，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠雙側(cè)腎蒂阻塞35 min并隨后腹腔注射富氫生理鹽水，腎臟LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)水平較模型組進(jìn)一步上調(diào)［29］。此外，在非酒精性脂肪肝病的研究中，吸入H2也可通過促進(jìn)自噬從而緩解肝臟的脂質(zhì)蓄積［30］。一項(xiàng)利用H2和二甲雙胍聯(lián)合治療糖尿病性心肌病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，H2通過抑制細(xì)胞焦亡（pyroptosis）起到了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［31］，表明H2可能參與其他細(xì)胞程序性死亡。以上研究表明，H2對(duì)病理情況下的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，但可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；H2有可能通過調(diào)控其他程序性死亡，緩解組織器官的損傷。

3 H2對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用

H2具有信號(hào)分子的功能，對(duì)包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）及磷酸肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3k）/Akt等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有多方面的影響。

3.1 MAPK通路

包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的細(xì)胞應(yīng)激可能通過胞內(nèi)激酶的氧化修飾或MAPK磷酸酶的失活激活ERKs、JNKs或p38 MAPKs。MAPK家族不同成員的活化能夠?qū)е露喾N生物反應(yīng)。最近，關(guān)于I/R損傷的研究揭示了H2抑制MAPK通路的作用。在大鼠同種異體腎移植模型中，受體大鼠每日飲用富氫水，移植物的MAPKs包括JNK、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）相比飲用普通水大鼠的移植物有所緩解［32］。H2可抑制ERK1/2、p38和JNK的磷酸化，減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚［33］。然而，有研究在大鼠動(dòng)脈化靜脈移植模型中，飲用富氫水的受體大鼠，其靜脈移植物中發(fā)現(xiàn)了p38的激活，而沒有ERK1/2的激活［34］；在小鼠心臟I/R損傷模型中，H2降低了JNK磷酸化，但增加了p38 MAPK和ERK 磷酸化［35］。

3.2 AMPK和PI3K/Akt

AMPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝、自噬和細(xì)胞極性等方面發(fā)揮重要作用［36］。研究表明，H2可通過激活A(yù)MPK通路緩解氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)線粒體保護(hù)和內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT的轉(zhuǎn)錄［37］。近期一項(xiàng)研究表明，H2通過抑制AMPK/mTOR/NLRP3通路，緩解了糖尿病小鼠的心肌損傷［31］。

PI3k-Akt通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要組成部分，通常在癌細(xì)胞、干細(xì)胞和心肌細(xì)胞中活化，促進(jìn)其快速增殖［38］。在小鼠心臟 I/R損傷［35］及 LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷［39］中發(fā)現(xiàn)，H2處理后PI3K/Akt通路的激活與損傷減輕存在相關(guān)性。

3.3 H2重塑免疫細(xì)胞亞型

除H2的抗炎特性外，H2對(duì)免疫細(xì)胞亞型，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）和肥大細(xì)胞具有影響，如在L-精氨酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎小鼠模型中，H2治療恢復(fù)了外周血單核細(xì)胞和脾單核細(xì)胞中CD25+Foxp3+Tregs的損失［40］；在豚鼠過敏性鼻炎研究中，富氫生理鹽水恢復(fù)了Th1/Th2細(xì)胞的失衡，并上調(diào)了CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素10（interluekin-10，IL-10）、叉頭蛋白 3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGR-β）的表達(dá)增加［41］。膠原酶誘導(dǎo)腦出血的特點(diǎn)是血腦屏障破壞，Manaenko等［42］研究表明，吸入H2能夠通過抑制腦出血后肥大細(xì)胞的活化來維持血腦屏障的功能，且這種免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過改變細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。H2處理增強(qiáng)了Foxp3的表達(dá)，而Foxp3不僅是CD4+CD25+Foxp3+Tregs的特異性分子標(biāo)志物，而且還能夠調(diào)節(jié)胸腺的分化和外周血的功能（圖2）［41］。

圖2 H2在氧化應(yīng)激下調(diào)控信號(hào)通路的分子機(jī)制[41]Fig.2 The molecular mechanism of hydrogen regulating signaling pathway under oxidative stress[41]

4 H2調(diào)控的新機(jī)制

隨著研究的不斷深入，關(guān)于H2生理醫(yī)學(xué)作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究不斷取得新的突破，出現(xiàn)了氫的酶活化作用、氫改變離子通道作用以及氫的脂蛋白調(diào)節(jié)作用等理論。一項(xiàng)研究以胃蛋白酶為研究對(duì)象，采用酶促分析、原子力顯微鏡峰值力定量納米力學(xué)作圖和太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)證實(shí)，富氫水能夠改變胃蛋白酶的活性位點(diǎn)的空間構(gòu)象，從而顯著提高胃蛋白酶的活性［43］。對(duì)于其他生物酶如線粒體復(fù)合物Ⅰ、乙酰膽堿酯酶等，H2也可提高其生物學(xué)活性，從而影響線粒體及神經(jīng)細(xì)胞的膜電位［44-45］。此外，有研究者對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)H2處理顯著影響了皮層神經(jīng)細(xì)胞的閾值電壓、動(dòng)作電位間隔和輸入抗阻，而不改變神經(jīng)遞質(zhì)的含量，表明H2可能是通過該表細(xì)胞膜鈉、鉀等離子通道，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞興奮性的調(diào)節(jié)［46］。大量研究表明，H2對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用尤為突出［47］，H2不僅能夠降低血漿總膽固醇，還可有效降低低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的水平［7，17］，改善高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）顆粒的功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流并抑制低密度脂蛋白氧化［7，48-49］。H2還可通過降低脂蛋白相關(guān)酶的活性和表達(dá)，包括脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、對(duì)氧磷酶-1和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，發(fā)揮其脂蛋白調(diào)節(jié)功能［50］。以上研究表明，H2有可能直接與生物大分子相互作用，改變其功能與活性，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能。

5 展望

截至目前，H2的生物醫(yī)學(xué)作用已在細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型、人類疾病中得以證實(shí)。首先，H2可通過清除氧化自由基、提高內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用。其次，H2可作為信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞凋亡、炎癥等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生影響。同時(shí)，新的H2調(diào)控機(jī)制表明，H2可能通過與生物大分子，如酶的相互作用，增加其活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程。然而，由于H2分子質(zhì)量小、擴(kuò)散快、參與反應(yīng)多等因素，H2作用的靶分子仍未明晰，這給繼續(xù)深入研究和臨床推廣增加了難度。未來的研究需要利用新的理論和工具進(jìn)一步解析其上游效應(yīng)因子，來闡明H2恢復(fù)細(xì)胞和機(jī)體穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。