王譯彬，劉 瑞，劉南南，楊小軍*，劉艷利*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2. 廣饒縣畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 東營(yíng) 257300)

當(dāng)肝內(nèi)脂肪超過肝重量的5%或50%以上肝細(xì)胞有脂肪變性時(shí)，就稱之為脂肪肝，目前脂肪肝已成為世界上最廣泛存在的慢性疾病，并伴有許多并發(fā)癥，會(huì)增加2型糖尿病、心血管(cardiovascular disease, CVD)、心臟病和慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。脂肪肝主要影響肝臟結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭，且脂肪肝患者的大多數(shù)死亡原因?yàn)镃VD，嚴(yán)重影響了人類健康。在籠養(yǎng)蛋雞養(yǎng)殖過程中，蛋雞脂肪肝綜合征是造成其死亡的主要原因，且在蛋雞產(chǎn)蛋期，患脂肪肝的雞群產(chǎn)蛋率一般上升到85%左右便逐漸下降，不會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋高峰，且降低蛋重、雞蛋受精率和受精蛋的孵化率，給畜牧產(chǎn)業(yè)造成了一定經(jīng)濟(jì)損失。有研究對(duì)比分析了種公雞和種母雞患脂肪肝后其后代脂肪肝的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)患脂肪肝種公雞的后代脂肪肝的發(fā)病率更高，表明蛋雞脂肪肝具有一定的父系遺傳效應(yīng)。奶牛圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡導(dǎo)致脂肪動(dòng)員過多，游離脂肪酸堆積至肝臟也容易發(fā)生脂肪肝疾病，導(dǎo)致肝臟功能受損影響奶牛健康。在畜禽養(yǎng)殖過程中，遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)和激素等因素都可導(dǎo)致畜禽動(dòng)物脂肪肝的發(fā)生，該疾病的發(fā)展是一個(gè)受多因素調(diào)控的復(fù)雜過程。

另一方面，脂肪肝發(fā)病是一個(gè)慢性的病理過程，從最初只是甘油酯沉積、并無(wú)炎癥發(fā)生的簡(jiǎn)單脂肪變性，到有明顯炎癥浸潤(rùn)出現(xiàn)的脂肪性肝炎，再到不同程度纖維化的肝硬化，肝硬化又會(huì)慢慢演化成肝癌；每個(gè)階段大約有10%～20%的幾率往下一階段演變，但也有少許比例的患病可逆，尤其是在簡(jiǎn)單脂肪變性和脂肪性肝炎階段，當(dāng)消除肝內(nèi)多余堆積脂肪后，肝功能將恢復(fù)正常，因此很多研究人員通過建立脂肪肝模型來(lái)開展相關(guān)研究，旨在探究脂肪肝的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防治療靶點(diǎn)。因此了解動(dòng)物脂肪肝模型的構(gòu)建非常有必要，本文主要介紹了目前科學(xué)界常見的動(dòng)物脂肪肝構(gòu)建模型，期望能夠?yàn)榻窈笕祟惡托笄葜靖蜗嚓P(guān)疾病的研究提供參考依據(jù)。

1 動(dòng)物脂肪肝發(fā)病機(jī)理

脂肪肝的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，具有多樣性與異質(zhì)性，主要因素是代謝紊亂造成的肝細(xì)胞脂質(zhì)積累，及其與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞死亡的相互作用等。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)肝臟合成脂質(zhì)的速率超過分解代謝和胞外轉(zhuǎn)運(yùn)速率時(shí)，就會(huì)引起脂肪變性。而脂肪變性的病因與營(yíng)養(yǎng)異常、胰島素抗性密切相關(guān)，并進(jìn)一步導(dǎo)致了肝損傷和炎癥。被廣泛認(rèn)可的“多重打擊”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，脂肪肝的發(fā)病與兩次打擊有關(guān)，最初的打擊是胰島素抵抗(insulin resistance, IR)引起以甘油三酯形式儲(chǔ)存的游離脂肪酸的攝取和合成增加，從而導(dǎo)致簡(jiǎn)單的脂肪變性，進(jìn)一步包括氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)、凋亡攻擊等多次攻擊可能會(huì)使疾病向更晚期發(fā)展。產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞需要合成卵黃中所含的脂類物質(zhì)，且雞脂質(zhì)合成主要發(fā)生在肝臟中，產(chǎn)蛋后期的蛋雞有著較高的脂肪沉積，可能會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)代謝失調(diào)、氧化性損傷等一系列生理健康問題，易引發(fā)脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLHS)等代謝疾病；奶牛圍產(chǎn)期體力不足導(dǎo)致采食量不足，引起能量負(fù)平衡，致使機(jī)體發(fā)生大量體脂動(dòng)員，造成游離脂肪酸增多，這兩種情況均易引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致脂肪肝相關(guān)疾病的發(fā)生。很多研究也從脂質(zhì)合成與分解層面探究與脂肪肝發(fā)生相關(guān)的代謝通路，主要包括Insulin-AKT通路、葡萄糖-ChREBP通路、PPARγ通路、AMPK通路、SIRT1通路、cAMP通路等。

2 脂肪肝模型構(gòu)建原理

根據(jù)脂肪肝發(fā)病機(jī)理，可將構(gòu)建原理分為以下5類：(1)通過改變?nèi)占Z營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，使動(dòng)物攝入或合成過多脂肪，或?qū)θ占Z進(jìn)行特殊處理，使動(dòng)物肝臟受損，構(gòu)建脂肪肝模型；(2)尋找自然發(fā)生的特定基因突變，或靶向基因修飾，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生肥胖、肝臟脂肪變性等癥狀；(3)使用藥物或激素，干預(yù)動(dòng)物脂肪合成與代謝過程，模仿脂肪肝癥狀；(4)日糧與基因敲除或藥物多種模型混合誘導(dǎo)，使脂肪肝模型構(gòu)造周期縮短，癥狀更加全面；(5)使用天然動(dòng)物細(xì)胞作為脂肪紊亂模型，無(wú)需額外藥物試劑誘導(dǎo)。

3 動(dòng)物活體模型

3.1 日糧誘導(dǎo)模型

日糧模型是最常用的誘導(dǎo)方式，相對(duì)簡(jiǎn)單，操作方便，但往往需要的誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)，常用來(lái)誘導(dǎo)肥胖和IR相關(guān)脂肪肝病的日糧類型包括以下幾種。

3.1.1 高脂日糧誘導(dǎo) 高脂日糧(high fat diet, HFD)模型是最基礎(chǔ)的非酒精性脂肪肝病造模方式，此模型大致模擬了西方日糧。HFD中含有較多的脂肪合成原料，可促進(jìn)肝臟脂肪生成，過度堆積脂肪，從而導(dǎo)致脂肪肝。長(zhǎng)期喂食HFD后，動(dòng)物主要會(huì)出現(xiàn)肥胖、IR、單純脂肪變性等癥狀。常見的HFD包含71%脂肪、11%碳水化合物和18%蛋白質(zhì)。最早的研究使用雄性大鼠構(gòu)建了經(jīng)典HFD模型，處理時(shí)長(zhǎng)為3周，造成炎癥程度較輕。也有研究通過飼喂19周齡的蛋雞高脂日糧連續(xù)6周，通過肝臟HE和油紅O染色可明顯看到脂肪肝現(xiàn)象。炎癥嚴(yán)重程度與處理時(shí)間成正比，目前對(duì)于非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)模型，大部分研究的HFD誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為12～20周。

3.1.2 高果糖日糧模型 果糖與脂肪肝的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，研究表明高果糖(high fructose, HF)擾亂了肝臟的碳水化合物代謝，導(dǎo)致甘油三酯合成率提高，加速脂肪生成，也能促進(jìn)肝臟炎癥和細(xì)胞應(yīng)激，如氧化和內(nèi)質(zhì)應(yīng)激，導(dǎo)致單純脂肪變性發(fā)展為NASH。有研究對(duì)雄性Wistar大鼠使用含10%果糖的飲用水和日糧飼喂8周，發(fā)現(xiàn)大鼠表現(xiàn)出脂肪肝的特征，體重、IR、血清肝毒性標(biāo)志物和脂質(zhì)顯著增加(<0.05)，鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇信號(hào)通路被破壞，且出現(xiàn)了一定的組織病理學(xué)變化。

3.1.3 高脂高糖日糧模型 高脂高糖(high-fat and high-fructose, HFHF)日糧結(jié)合了HFD與高果糖日糧模型，是構(gòu)建脂肪肝炎和2型糖尿病模型的理想選擇。有研究對(duì)8月齡雄性大鼠飼喂HFHF(55%脂肪、35%碳水化合物和10%蛋白質(zhì))日糧8周，與HF組相比，出現(xiàn)了更嚴(yán)重的肝臟氧化應(yīng)激，肝巨噬細(xì)胞聚集增加，誘導(dǎo)持續(xù)高胰島素血癥和空腹高血糖，加重了肝纖維化。而HF組與HFHF組的體重和脂肪質(zhì)量均有所增加，NADPH氧化酶通路改變導(dǎo)致肝臟糖原水平下降，且出現(xiàn)了脂肪變性和IR。同時(shí)有研究表明6周齡F8基因敲除雄性小鼠在30%脂肪、18%粗蛋白和50%(w/w)果糖日糧飼喂14周后發(fā)生肝臟脂肪變性，并顯示出較低的能量代謝，較高的骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)，血小板計(jì)數(shù)減少，新的脂肪酸合成上調(diào)，脂質(zhì)積累和膠原蛋白沉積，炎癥標(biāo)志物的表達(dá)一致升高，G6Pase顯著上調(diào)(<0.01)，提示肝臟處于高血糖狀態(tài)，但無(wú)IR發(fā)生。研究表明HFHF日糧飼喂小鼠超過26周后可模擬人類NASH的關(guān)鍵特征，30周后可誘導(dǎo)更嚴(yán)重的肝纖維化和炎癥。

3.1.4 高脂高膽固醇日糧模型 高膽固醇攝入可誘發(fā)血脂異常和IR，誘導(dǎo)脂肪肝機(jī)制與HFHF模型類似。對(duì)受精后8 d的斑馬魚幼魚飼喂含12%脂肪、50%粗蛋白和5%(w/w)膽固醇的高膽固醇日糧，在1或2周可建立典型的非酒精性脂肪性肝病模型，3周可建立NASH模型。而更為常見的是高脂高膽固醇(high fat and high cholesterol diet, HFHC)日糧，使用含1.25%膽固醇，15%可可脂和0.5%膽酸的HFHC日糧飼喂10周齡雌性C57BL/6J小鼠，6周后發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏的HFHC小鼠脂肪性肝炎更嚴(yán)重。對(duì)6周齡雄性SD大鼠飼喂80.5%標(biāo)準(zhǔn)日糧、2%膽固醇、7%豬油、10%蛋黃粉和0.5%膽酸鈉，8周后體重增長(zhǎng)為201.48±22.60 g，與接受普通飼料的大鼠的體重增長(zhǎng)(207.24±24.05 g)沒有顯著差異(>0.05)，但發(fā)生了血脂異常和肝損傷，可以確定為NASH。使用含10%大豆油、1.25%膽固醇的HFHC日糧飼喂雄性白兔持續(xù)8周，通過HE染色、測(cè)定總膽固醇和甘油三酯等物質(zhì)含量可發(fā)現(xiàn)脂肪肝癥狀。

3.1.5 高能低蛋白日糧模型 家禽FLHS的外部特征是體重增加、產(chǎn)蛋量減少，常見于蛋雞、病理組織學(xué)特征為腹部脂肪過多、脂肪肝、肝臟和血腫中的毛細(xì)血管出血。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的HF或低蛋白(low protein, LP)日糧對(duì)蛋雞的肝臟顏色評(píng)分、肝臟出血評(píng)分或肝臟脂肪含量無(wú)顯著影響(>0.05)，且所有表示肝損傷的血漿酶僅在LPHF日糧組中發(fā)現(xiàn)較高水平，表明提供較高代謝能的LPHF日糧可能是誘發(fā)該綜合征的病理自然方式。常見的高能量低蛋白(high energy and low protein, HELP)日糧主要添加了70%玉米、15%豆粕和4%大豆油，含13.0 MJ/kg能量和12%粗蛋白，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為9周。研究表明，HELP日糧可激活PI3K/Akt/TOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)蛋雞微泡性脂肪變性，并導(dǎo)致高水平的IR、氧化應(yīng)激和炎癥，與FLHS癥狀相似。

3.1.6 蛋氨酸和膽堿缺乏日糧模型 蛋氨酸和膽堿在脂肪酸β氧化和脂蛋白的合成中必不可少，脂蛋白在脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，所以蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine-and choline- deficient, MCD)日糧也常被用來(lái)誘導(dǎo)NASH模型。常見的MCD日糧含40%蔗糖、10%脂肪，但缺乏蛋氨酸和膽堿。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)8～10周齡雄性小鼠飼喂MCD 2～3周，肝臟巨噬細(xì)胞亞群中Tim-3表達(dá)顯著增加(<0.05)，其嚴(yán)重程度與肝脂聯(lián)素抵抗和肝細(xì)胞的成脂轉(zhuǎn)化有關(guān)，因此MCD模型對(duì)肝臟損害較大，但未導(dǎo)致肥胖等癥狀。并且此模型對(duì)雄性小鼠的影響比雌性小鼠更嚴(yán)重。也有研究使用高能量低膽堿(high-energy and low-choline, HELC)日糧(16%粗蛋白、12.2 MJ/kg、0.06%膽堿)飼喂80周齡蛋雞8周，發(fā)現(xiàn)其肝臟腫大，顏色呈淡黃色或黃褐色，且PPAR-ACAD/ACOT和PPAR-LXRα-SREBP1c-ACC/FAS/FAT通路被激活，脂質(zhì)合成提高，呈現(xiàn)明顯的FLHS癥狀，包括破裂、出血等。

3.2 基因編輯誘導(dǎo)模型

遺傳模型作為常見的脂肪肝誘導(dǎo)模型，能夠使動(dòng)物產(chǎn)生肥胖、脂肪變性、IR等癥狀，無(wú)時(shí)間限制，可以相對(duì)清晰解釋某些基因在脂肪肝發(fā)生中的作用機(jī)制，但一般不會(huì)自發(fā)產(chǎn)生炎癥，因此需結(jié)合日糧模型才能相對(duì)完整的模仿脂肪肝癥狀。

3.2.1和肥胖基因(obese gene,)所表達(dá)的瘦素通過影響新陳代謝和食欲來(lái)調(diào)節(jié)體重和脂肪沉積，其含量與脂肪沉積程度成反比，瘦素受體是由糖尿病相關(guān)基因(基因)編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，基因所編碼的瘦素受體缺失容易引起高血糖癥或IR?；蛐∈笙却嬖陔[性突變，先天缺少顯性或基因，無(wú)法編碼瘦素或瘦素受體，其特征是肝臟脂質(zhì)積累增多，不自發(fā)產(chǎn)生炎癥和纖維化，表現(xiàn)出脂肪肝的明顯代謝特征，是脂肪肝的良好遺傳模型，兩者不同之處在于，小鼠可以抵抗肝纖維化，而小鼠卻不抵抗肝纖維化。然而，先天性瘦素缺乏或基因突變引起的瘦素抵抗在肥胖或NASH患者中并不普遍，因此和小鼠模型在反映動(dòng)物肥胖或NASH的成因方面能力有限。

3.2.21基因編碼的蛋白在微管組織，特別是在纖毛的形成和維持中發(fā)揮作用，該基因的突變?cè)谂R床會(huì)導(dǎo)致Alstrom綜合征，具體表現(xiàn)為感覺缺陷、心臟疾病，代謝型肥胖和2型糖尿病。小鼠具有突變的1基因，其肝臟甘油三酯含量增加，但血清中含量變化不大，其表型為暴食導(dǎo)致的病態(tài)肥胖。研究表明，1基因突變的BALB/c小鼠和C57BL6/J小鼠相比，脂肪肝相關(guān)癥狀較輕。有研究對(duì)小鼠注射二乙基亞硝胺，發(fā)現(xiàn)在12周齡出現(xiàn)肝臟脂肪變性、IR、異常增生肝細(xì)胞數(shù)量增加、肝結(jié)節(jié)等脂肪肝典型特征。

3.2.3-小鼠被認(rèn)為是適合于人類非胰島素依賴性糖尿病的多基因模型，等位基因(-)的引入會(huì)加劇病理生理狀況，從而導(dǎo)致明顯的糖尿病伴隨高胰島素血癥，而糖尿病患者中約50%可發(fā)生脂肪肝。-小鼠模型下丘腦食欲抑制受損，易導(dǎo)致暴飲暴食，自發(fā)肥胖，血漿胰島素水平在2至4個(gè)月齡明顯增加，尿糖和微量白蛋白水平以及白蛋白與肌酐的比率隨年齡增長(zhǎng)而增加，且對(duì)MCD日糧誘導(dǎo)的NASH表現(xiàn)出更高的易感性。

3.2.4-過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，)基因所編碼的PPARs影響參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及免疫和炎癥反應(yīng)的目標(biāo)基因的表達(dá)，共有3種亞型(α、β/δ和γ)。其中PPAR-α是動(dòng)物肝臟中過氧化物酶體、線粒體和微粒體脂肪酸氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此-基因敲除小鼠的脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)降低，出現(xiàn)脂肪肝表型。

3.2.5法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)在調(diào)節(jié)膽汁酸、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用?；蚯贸∈髸?huì)自發(fā)地發(fā)生肝腫瘤，有研究使用基因敲除小鼠作為模型，發(fā)現(xiàn)和的相互作用可能在脂肪肝的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

3.2.6基因所編碼的載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)主要在肝臟中合成，血漿ApoE水平升高可能預(yù)示了脂肪肝的發(fā)生?；蚯贸∈笕狈poE蛋白，小鼠發(fā)育正常，但血漿膽固醇水平顯著增加(<0.05)，表現(xiàn)出脂肪肝的典型癥狀，且發(fā)生了自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化病變。

3.2.7 OLETF大鼠模型 OLETF(Otsuka Long- Evans Tokushim a Fatty)大鼠由肥胖大鼠近交育成，是自發(fā)持續(xù)高血糖動(dòng)物模型，其特征包括肥胖、脂肪變性、IR和血脂異常等，癥狀與人類2型糖尿病類似，而2型糖尿病通常伴有一些代謝性疾病，如脂肪肝和高血壓等，因此也被作為脂肪肝動(dòng)物模型，其對(duì)照組通常使用LETO大鼠。

3.2.8 肥胖型Zucker大鼠模型基因是瘦素受體的顯性基因，基因失去了與瘦素受體的結(jié)合能力，是由基因發(fā)生突變的隱性基因。肥胖型Zucker大鼠的基因型為，不能表達(dá)正常的瘦素受體。而瘦型Zucker大鼠的基因型為或，能夠正常表達(dá)瘦素受體，常與肥胖型Zucker大鼠做對(duì)照試驗(yàn)。肥胖Zucker大鼠是一種自發(fā)性遺傳性肥胖模型，標(biāo)準(zhǔn)日糧自由采食的情況下在5周齡已經(jīng)發(fā)生明顯的體重和脂肪增加，由于IR，其通過增加胰島素的合成和分泌形成高胰島素血癥從而代償性地維持血糖，處于II型糖尿病早期階段，表現(xiàn)為暴飲暴食、高胰島素血癥和高血脂，是脂肪肝的良好模型。

3.2.9 日糧與基因編輯結(jié)合模型 基因編輯模型無(wú)法獨(dú)立發(fā)展為脂肪肝，因此許多動(dòng)物模型結(jié)合自然發(fā)生的基因突變或靶向基因修飾與日糧誘導(dǎo)兩種方法，使模型的組織病理學(xué)和病理生理學(xué)更接近于動(dòng)物脂肪肝。例如，對(duì)雌性小鼠飼喂含0.0、0.2或2.0%(w/w)膽固醇的HFD 12或24周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽固醇喂養(yǎng)的小鼠肝臟膽固醇含量和ALT水平成正比，表明游離膽固醇積累的增加與脂肪肝進(jìn)展相關(guān)，且此混合模型更能模仿人類的脂肪肝狀況。通過給8～12周齡和小鼠飼喂MCD日糧(10%脂肪、40%蔗糖、缺乏蛋氨酸和膽堿)，4周后觀察到肝臟中的脂肪浸潤(rùn)嚴(yán)重，硫代巴比妥酸反應(yīng)物水平和亞硝酸鹽的增加，且小鼠比和野生型小鼠有明顯更高的血清ALT水平和更嚴(yán)重的肝臟炎癥和纖維化。由于肝組織的脂肪變性和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，這些變化可能促進(jìn)了動(dòng)物的NASH。有研究對(duì)30周齡OLETF大鼠飼喂含60%果糖的HF日糧，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生了血脂異常和炎癥等癥狀，BiP、p-IRE1α和t-IRE1α蛋白表達(dá)量顯著增加，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路被激活。也有研究對(duì)小鼠飼喂高鐵元素日糧，觀察到日糧中的鐵超載可以加速動(dòng)物脂肪肝向NASH的發(fā)展進(jìn)程。

3.3 藥物干預(yù)模型

藥物干預(yù)模型是常見的脂肪肝誘導(dǎo)方式之一。大部分藥物干預(yù)模型可能會(huì)導(dǎo)致炎癥，但不會(huì)導(dǎo)致肥胖。

3.3.1 地塞米松干預(yù)模型 地塞米松是一種人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用，是臨床廣泛使用的藥物，但長(zhǎng)期給藥有許多副作用，可能會(huì)導(dǎo)致肥胖、肝脂肪沉積和血脂異常等不良反應(yīng)，甚至?xí)霈F(xiàn)致命的潰瘍伴出血和直腸出血等癥狀。較早的研究發(fā)現(xiàn)，在50～100周齡的白萊航蛋雞肌肉中注射醋酸地塞米松、黃體酮、皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)，可降低其采食量、體重、產(chǎn)蛋量和蛋重，增加肝臟重量和卵黃中丙二醛、膽固醇的濃度。也有研究發(fā)現(xiàn)每日在大腿肌肉注射4 mg/kg地塞米松磷酸鈉連續(xù)7 d，或飼喂含地塞米松4 mg/kg日糧12周，可引起24～36周齡蛋雞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。將斑馬魚幼魚受精5 d后暴露于12.5和25.0 μg/mL地塞米松24 h，可誘導(dǎo)其肝腫大和脂肪變性，是應(yīng)激誘導(dǎo)肝衰竭的有效模型。

3.3.2 雌二醇干預(yù)模型 高水平雌激素與蛋雞FLHS有關(guān)，雌二醇可增加與脂質(zhì)代謝相關(guān)的mRNA表達(dá)，上調(diào)脂肪酸和三?；视偷暮铣珊透闻K脂質(zhì)的積累。在第1、4、7、10和13天對(duì)60周齡海蘭白蛋雞肌肉注射7.5 mg β-雌二醇和0.5 mL/kg玉米油，可顯著提高其肝臟總脂含量(<0.05)、肝出血評(píng)分和FLHS發(fā)生率(<0.05)，并降低產(chǎn)蛋能力(<0.05)。

3.3.3 日糧與藥物結(jié)合 由于單純?nèi)占Z誘導(dǎo)所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此許多動(dòng)物模型使用了日糧與藥物結(jié)合誘導(dǎo)的方法。例如有研究對(duì)蛋雞使用地塞米松和HFD混合(51%脂肪、18%粗蛋白和1.5 mg/kg地塞米松)飼喂連續(xù)1周，證明了-3脂肪酸對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下蛋雞腸道形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率有有益影響，但并不能減輕應(yīng)激狀態(tài)對(duì)產(chǎn)卵方面的負(fù)面影響。

4 體外脂肪肝模型

對(duì)于脂肪肝疾病來(lái)說(shuō)，動(dòng)物模型并不能完全模擬整個(gè)疾病發(fā)生的病理過程，并且動(dòng)物模型往往個(gè)體差異較大，不同的誘導(dǎo)模型產(chǎn)生的病理狀態(tài)也有很大區(qū)別，為了最大程度上確保試驗(yàn)條件的一致性，肝臟細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞也是體外用來(lái)研究脂肪肝疾病的良好模型。體外脂肪肝模型一般將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)并分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，通過藥物誘導(dǎo)成脂，以模擬病理環(huán)境，此模型可在最大程度確保無(wú)關(guān)變量一致。有研究者使用脂肪酸如油酸和棕櫚油能夠模仿高脂日糧所產(chǎn)生的脂肪肝模型，也有對(duì)細(xì)胞通過基因敲除、藥物誘導(dǎo)等方法來(lái)模擬脂肪肝，還有研究者使用天然細(xì)胞模型模擬動(dòng)物脂代謝紊亂。

4.1 脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞模型

脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞模型模仿了動(dòng)物在高脂日糧飼喂的情況，油酸處理可促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂滴沉積，顯著提高甘油三酯水平(<0.05)，并且油酸介導(dǎo)的人類HepG2細(xì)胞反應(yīng)再現(xiàn)了脂肪肝的許多其他方面，如氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和炎癥因子。也有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)奶牛肝細(xì)胞饑餓處理12 h后使用0.25 mmol·L的油酸鈉處理9 h可誘導(dǎo)奶牛原代肝細(xì)胞脂肪變性，炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)水平顯著升高(<0.05)，表明細(xì)胞受到了一定損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，用油酸和棕櫚酸以2:1的比例處理HepG2肝細(xì)胞系，會(huì)導(dǎo)致過度的脂質(zhì)積累和炎癥細(xì)胞因子的上調(diào)，包括TNF-α、IL-6和IL-8。

4.2 地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞模型

有研究提取3周齡雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使用肝細(xì)胞分化培養(yǎng)基持續(xù)處理14 d，然后用不同濃度的地塞米松(0、100、500 和 2 500 nmol/L)處理細(xì)胞3 d，發(fā)現(xiàn)地塞米松抑制miR-122、增加肝細(xì)胞YY1的表達(dá)，導(dǎo)致了ACE2-MAS1信號(hào)通路的抑制，使甘油三酯合成相關(guān)基因表達(dá)增加，氧化相關(guān)基因表達(dá)降低，增加了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。

4.3 天然細(xì)胞模型

研究表明，雞胚肝臟脂肪從E16開始顯著增加，而出殼后整體逐步下降。剛出殼雛雞分離得到的原代肝細(xì)胞含脂量較高，無(wú)需額外藥物試劑的誘導(dǎo)，是良好的開展體外脂質(zhì)沉積研究的天然模型，有研究利用此特征，將1日齡雛雞肝臟分離出原代肝細(xì)胞作為肝臟脂代謝紊亂的模型，發(fā)現(xiàn)葉酸處理能夠顯著抑制雞原代肝細(xì)胞中的脂肪酸從頭合成，并協(xié)同促進(jìn)甘油三酯的水解和代謝。

5 展 望

肝臟中的脂質(zhì)積累及其與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞死亡和自噬的相互作用是脂肪肝發(fā)生的主要原因，然而其確切機(jī)制在很大程度上仍是未知的。動(dòng)物模型為脂肪肝的深入研究提供基礎(chǔ)，并為脂肪肝提供了治療靶點(diǎn)。

目前的動(dòng)物模型無(wú)法完全模擬脂肪肝自然發(fā)生的病理過程，不同誘導(dǎo)方式導(dǎo)致基因表達(dá)不同，模仿了脂肪肝的不同致病機(jī)理與臨床癥狀。表1中對(duì)比了多種誘導(dǎo)方式的造模方式、造模周期和典型癥狀。有研究通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)進(jìn)一步比較了日糧、基因和藥物3種誘導(dǎo)方式的通路，發(fā)現(xiàn)3種誘導(dǎo)方式的共有差異基因很少，但與地塞米松相比，HSHF和db/db代謝相關(guān)的共有差異基因相對(duì)較多。在試驗(yàn)中需要根據(jù)研究目的，選擇最合適的方法構(gòu)建脂肪肝模型，才能相對(duì)準(zhǔn)確的解析其發(fā)病機(jī)理，提出最適合的預(yù)防和治療方案，進(jìn)而提升畜牧產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率。

表1 常見脂肪肝模型對(duì)比