潘紅軍，茹先古麗·買買提依明，邢軍，艾合買提江·艾海提*，秦新政，劉軍*

1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊 830017）；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院微生物應(yīng)用研究所（烏魯木齊 830011）

石榴（Punica granatumL.）為石榴科石榴屬落葉灌木或者小喬木，又名安石榴、丹若、金嬰等，是一種珍奇的漿果，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等中西亞地區(qū)[1]。它長(zhǎng)期以來(lái)一直是中東和地中海飲食的一部分。羅馬人稱它為布尼克蘋果[2]。石榴的種植分布于美國(guó)、中國(guó)、巴西、土耳其等國(guó)家。在中國(guó)大面積種植于新疆喀什、安徽懷遠(yuǎn)、陜西臨潼、四川會(huì)理、云南蒙自、山東棗莊等[3]。石榴根據(jù)其口感的不同分為甜石榴和酸石榴2個(gè)大類，我國(guó)的石榴品種有100多種，作為食用的甜石榴就有90多種。石榴的果實(shí)器官包括果皮、隔膜、假種皮及石榴籽。假種皮也就是石榴的食用部分，富含水分和花色苷?；ㄉ蘸空急葲Q定假種皮的顏色不同。石榴汁是從假種皮中獲得的主要食品，約占水果總質(zhì)量的50%[5]。石榴汁呈紅紫色，中等酸性，平均含85.4%的水分和14.6%的干物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)石榴汁具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗菌[8]、抗骨質(zhì)疏松[9]、抗癌[10]等生理功效。

為增加果汁的產(chǎn)量及得到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富的果汁，普遍采用酶解技術(shù)對(duì)果汁進(jìn)行加工。孫小華等[11]以果膠酶和纖維素酶進(jìn)行酶解，無(wú)花果的出汁率達(dá)到72.15%，相對(duì)于未處理的提高75.46%。除了經(jīng)常在果汁加工使用的酶，如果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等，蛋白酶也逐漸被使用于果汁酶解。孫俊杰等[12]以果膠酶和酸性蛋白酶作為復(fù)合酶處理濁橙汁，果汁的出汁率達(dá)到83.27%。試驗(yàn)以果膠酶和木瓜蛋白酶作為復(fù)合酶確定澄清石榴汁的最佳酶解條件，并對(duì)其工藝采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴（購(gòu)于新疆喀什，運(yùn)回后儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱）；果膠酶（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；木瓜蛋白酶（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；碳酸鈉（分析純，上海源葉生物有限公司）；氯化鉀（分析純，上海源葉生物有限公司）；乙酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

XY-25B-13B型榨汁機(jī)（佛山市南海區(qū)九陽(yáng)廚具廠）；SPECORD PLUS型紫外分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；JE3002型電子天平（上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司）；H2-16K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；AUW120型電子天平（島津菲律賓工廠）；DZKW-2-12型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴汁酶解工藝

取若干石榴洗凈去皮去除隔膜，用榨汁機(jī)壓榨獲得石榴汁。準(zhǔn)確稱取25 g石榴汁于錐形瓶中，加入一定量的果膠酶與木瓜蛋白酶（W果膠酶∶W木瓜蛋白酶=1∶1）。將錐形瓶置于水浴鍋中提供相應(yīng)的條件使其開始酶解。酶解完后于65 ℃滅酶3 min，以8 000 r/min離心8 min獲得上清液即為石榴汁。

1.3.2 酶解單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酶添加量對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設(shè)定酶解時(shí)間60 min、酶解溫度45 ℃，比較不同復(fù)合酶添加量（0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%）對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.2.2 酶解時(shí)間對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設(shè)定復(fù)合酶添加量0.2%、酶解溫度45 ℃，比較不同酶解時(shí)間（30，60，90，120和150 min）對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.2.3 酶解溫度對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設(shè)定酶解時(shí)間60 min、復(fù)合酶添加量0.2%，比較不同酶解溫度（30，35，40，45和50 ℃）對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

優(yōu)選單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用Design Expert 11.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、計(jì)算，從而確定最佳復(fù)合酶酶解石榴汁工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表1所示。

表1 石榴汁響應(yīng)面編碼因素水平表

1.3.4 指標(biāo)的測(cè)定

澄清度測(cè)定。取離心后的石榴汁上清液在660 nm處測(cè)定透光度，純水為對(duì)照，以透光率（%）表示。

花色苷含量測(cè)定，采用pH示差法。吸取一定的石榴汁，分別用pH 1.0的緩沖溶液（125 mL 0.2 mol/L氯化鉀與375 mL 0.2 mol/L鹽酸混勻）和pH 4.5緩沖溶液（200 mL 1 mol/L乙酸鈉、120 mL 1 mol/L鹽酸和180 mL水混勻）稀釋10倍，分別在510 nm和700 nm下測(cè)其吸光度。按式（1）和（2）計(jì)算花色苷含量（CGE mg/L）。

式中：A510和A700為果汁在波長(zhǎng)510 nm和700 nm下的吸光度；A為不同pH環(huán)境下吸光度的差值；MW為矢車菊3-葡萄糖苷的分子量，449.2；F為稀釋倍數(shù)，10；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel和Design Expert 11.0進(jìn)行處理，使用Graph pad prism作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 酶添加量的影響

如圖1所示，隨著復(fù)合酶添加量增加，石榴果汁的澄清度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。復(fù)合酶添加量達(dá)到0.2%時(shí)，石榴汁的澄清度達(dá)到最高，其平均值為78.53%。酶添加量大于0.2%時(shí)，石榴汁的澄清度逐漸降低，這可能是因?yàn)槊柑砑恿窟^(guò)大后，隨著大分子物質(zhì)被分解為小分子物質(zhì)，如果膠被分解為單糖[13]，如葡萄糖、果糖；蛋白質(zhì)被分解為小分子肽或者氨基酸類物質(zhì)。水溶性小分子物質(zhì)的增多及分子間的相互鍵合形成絡(luò)合物也可導(dǎo)致石榴汁的澄清度下降[14]。也可能是因?yàn)槊柑砑恿窟^(guò)多，蛋白類物質(zhì)增多，導(dǎo)致果汁渾濁[15]?；ㄉ蘸侩S著酶添加量增加呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，該趨勢(shì)與聶銘等[16]的研究結(jié)果一致。酶解時(shí)花色苷含量從115.322 CGE mg/L降低到93.113 CGE mg/L，降低19.27%?；ㄉ兆鳛榕c顏色表現(xiàn)緊密相關(guān)的活性物質(zhì)，花色苷的降低也就會(huì)影響果汁顏色的變化，蔣朵朵等[17]的研究證明花色苷含量的變化與植物本身顏色的變化具有顯著相關(guān)性。由此，為獲得澄清型的石榴汁，最佳酶添加量為0.2%。

圖1 酶添加量對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.1.2 酶解時(shí)間的影響

如圖2所示，石榴汁的澄清度隨著酶解時(shí)間增加呈現(xiàn)先增大后降低趨勢(shì)。酶解時(shí)間60 min時(shí)石榴汁的澄清度達(dá)到最大值78.69%。時(shí)間小于60 min時(shí)，石榴汁的澄清度不高可能是因?yàn)槊概c底物作用不完全，大分子物質(zhì)不能完全分解，使得澄清效果不理想。酶解時(shí)間超過(guò)60 min后澄清度下降可能是由于果汁中的物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)使得果汁的澄清度降低?；ㄉ蘸侩S著酶解時(shí)間增加呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，最高達(dá)到176.270 CGE mg/L。其原因是花色苷作為大分子多酚類化合物，容易發(fā)生氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間的酶解容易造成花色苷的氧化及水解。因此為了保留更多的花色苷，應(yīng)該降低酶解時(shí)間。綜合考慮，選擇60 min作為最佳酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.1.3 酶解溫度的影響

如圖3所示，隨著溫度逐漸升高，石榴汁的澄清度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。酶解溫度35 ℃時(shí)，石榴汁的澄清度達(dá)到最大值。溫度較低時(shí)，可能是由于未達(dá)到復(fù)合酶的最佳溫度，酶解效率降低，使得果汁澄清度不高。溫度大于35 ℃時(shí)，澄清度逐漸降低，因?yàn)槊傅谋举|(zhì)為蛋白質(zhì)，溫度的升高引起酶的活性降低甚至失活，造成石榴汁的澄清度隨著溫度升高而遞減。而花色苷含量變化呈現(xiàn)隨溫度升高而逐漸降低趨勢(shì)，由107.840 CGE mg/L降低到94.532 CGE mg/L。其原因是石榴花色苷的耐溫性不高，溫度升高造成花色苷的分解及氧化生成其他化合物，使得花色苷含量降低[18]。因此在使用復(fù)合酶酶解石榴汁時(shí)最佳酶解溫度為35 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 結(jié)果與模型建立

根據(jù)2.1的試驗(yàn)結(jié)果，按照表1的因素與水平編碼進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其響應(yīng)值為石榴汁酶解后的澄清度（Y），試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過(guò)Design Expert 11.0軟件二次多項(xiàng)式回歸分析，得到石榴皮澄清度（%）對(duì)應(yīng)的酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）的回歸曲線方程：Y=-27.255+29.09A+ 0.442 95B+4.720 3C-0.020 833AB+0.975AC-0.000 217BC- 129.975A2-0.002 377B2-0.068 390C2。

表2 復(fù)合酶酶解石榴果汁響應(yīng)面結(jié)果表

2.2.2 方差分析以及顯著性檢驗(yàn)

通常使用F值和P值檢驗(yàn)回歸方程各因素的顯著性水平，表達(dá)各變量間的相互影響大小，P＜0.01表示模型具有極大的可信度。由表3中各F值可判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小，則其影響大小由大到小的排列順序?yàn)镃＞A＞B。由P＜0.000 1可知該模型可以很高程度對(duì)復(fù)合酶酶解石榴汁進(jìn)行模擬，而且該試驗(yàn)失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），失擬項(xiàng)一般被用于驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠衽c理論模型相符合。由其結(jié)果則可知該模型擬合度好，不會(huì)造成較高的試驗(yàn)誤差。

表3 二次多項(xiàng)式回歸方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

同時(shí)可根據(jù)表3中的P值判斷各因素對(duì)澄清結(jié)果的影響顯著程度，其中PA=0.019 2（P＜0.05）表示因素A（酶添加量）對(duì)澄清度的影響顯著，同理PC=0.008 8（P＜0.01）表示因素C（酶解溫度）對(duì)澄清度的影響極顯著，而PB=0.936 4（P＞0.05）則說(shuō)明因素B（酶解時(shí)間）對(duì)澄清度的影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

對(duì)于響應(yīng)面的分析就是采用平面等高線圖與三維立體圖來(lái)分析，平面等高線的曲線越接近于橢圓表示2個(gè)因素的交互影響作用越顯著，而在三維立體圖中，曲線的坡度越陡則表示兩個(gè)因素的交互影響作用越顯著[19-20]。由表3和圖4可知，交互項(xiàng)AC對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著（P＜0.05），剩余交互項(xiàng)AB、BC對(duì)響應(yīng)值Y影響均不顯著。

圖4 響應(yīng)面各因素交互作用三維圖

2.3 最佳酶解參數(shù)及驗(yàn)證

由試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂芍?，預(yù)測(cè)的最佳工藝為復(fù)合酶添加量0.214%、酶解時(shí)間60.468 min、酶解溫度35.743 ℃，此時(shí)石榴汁的透光率為79.954%?；谠囼?yàn)的容易操作性及提取效果的可行性，將數(shù)據(jù)調(diào)整為復(fù)合酶添加量0.22%、酶解時(shí)間60 min、酶解溫度35 ℃，此時(shí)石榴汁澄清度為77.94%，花色苷含量為174.154 CGE mg/L。理論值與實(shí)際數(shù)據(jù)誤差較小，則可視為該模型與實(shí)際擬合良好，可以使用。

3 結(jié)論

為獲得澄清型的石榴汁，以酶解工藝對(duì)石榴汁進(jìn)行澄清，測(cè)定酶解工藝對(duì)石榴汁透光率以及花色苷含量的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面對(duì)石榴汁酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得與實(shí)際較為擬合的模型。最佳石榴汁酶解工藝條件為復(fù)合酶添加量0.22%、酶解溫度35 ℃、酶解時(shí)間60 min，在此工藝條件下石榴汁的澄清度達(dá)到77.94%，花色苷含量為174.154 CGE mg/L。試驗(yàn)可為石榴汁的加工提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。