劉強欣，林婷，王志超，李雅，王侃，劉芯成

綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310051）

甲醛（CH2O）又稱蟻醛，常溫下是一種無色具有強烈刺激氣味的物質[1]，它作為一種代謝成分普遍存在于生物體中，通過破壞生物體中的蛋白質和酶，使得組織細胞產生不可逆的損傷[2]。據(jù)相關研究報道，人體長期接觸甲醛會造成機體各種不良反應，可能會引起神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和肝臟的損傷[3]，研究發(fā)現(xiàn)部分老年癡呆癥狀與甲醛的攝入相關[4]。因此，國際癌癥研究機構（IARC）確認甲醛為第一類致癌物[5]，同時世衛(wèi)組織確定甲醛為致癌、致畸物質，世界各國都禁止將甲醛作為防腐劑在食品中使用[6]，美國環(huán)境環(huán)保局給出的建議是：甲醛每日的容許攝入量為每千克體重0.2 mg[7]，我國也明令禁止在食品中以任何形式添加甲醛，其限量規(guī)定為“不得檢出”[8]。

長久以來，火鍋作為中華民族的一種獨創(chuàng)美食，深受到廣大人民的喜愛且盛行于東亞地區(qū)。牛百葉作為一種含有豐富的營養(yǎng)成分，具有補益脾胃、補氣養(yǎng)血等功效的食品，在火鍋中屬于必備的食材。由于甲醛能夠使蛋白質變性，具有防腐性能，食品中加入甲醛可以起到防腐保鮮同時可以使食品表面色澤光亮，還可以增加韌性和脆感，改善食品口感[9-10]。近些年來，水產品及水發(fā)產品中檢出甲醛的報道時有發(fā)生[11-15]，常有一些不法商販為使水發(fā)食品不腐爛變質，又能保持好的感觀，在用火堿水溶液浸泡的同時，加一些甲醛。水產品以及水發(fā)產品中的甲醛即使清洗、烹調也無法根除。監(jiān)管部門為杜絕添加甲醛的水產品流入市場，加大監(jiān)督檢驗力度，以確保消費者的食用安全。參照SC/T 3025—2006《水產品中甲醛的測定》[16]，建立牛百葉中甲醛的揮發(fā)動力學模型，模擬不良商販對水發(fā)產品（牛百葉）添加甲醛后，甲醛的相關揮發(fā)狀況。為市場監(jiān)管部門對牛百葉中非法添加甲醛的狀況進行監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，默克）；二氯甲烷（色譜純，默克）；2, 4-二硝基苯肼（分析純，浙江長青化工）；磷酸（分析純，浙江長青化工）；鹽酸（分析純，浙江長青化工）；甲醛（100 mg/L，ANPEL）；Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5.0 μm，博納艾杰爾）；試驗用水（一級水，美國Millipore超純水儀制備）；混合微孔濾膜（0.22 mm）；牛百葉（陽性樣品）。

1.1.2 主要儀器與設備

高效液相色譜儀器（Shimadzu LC-2030C，配有二極管陣列檢測器，日本島津公司）；電子天平（BSA224S型，德國賽多利斯）；凱式定氮儀（Kjeltec 8400，foss）；多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機（ST16R，賽默飛世爾）；恒溫水浴鍋（HWS-28，上海一恒科學儀器有限公司）；全自動平行濃縮儀（AOTO EVA-60，?？苾x器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取10.00 g試樣置于50 mL燒杯中，轉移置于500 mL蒸餾瓶，用20 mL水分多次沖洗燒杯，洗滌液合并至蒸餾瓶中，用玻璃棒攪拌均勻后靜置30 min，加入10 mL磷酸溶液（取100 mL磷酸，加水定容至1 000 mL），過水蒸氣蒸餾，將250 mL容量瓶作為吸收液裝置，待蒸餾至約240 mL時取出，用水定容至刻度[16]。

取2 mL上述蒸餾液置于15 mL離心管中，加入0.4 mL 2, 4-二硝基苯肼溶液（準確稱取2, 4-二硝基苯肼100 mg溶解于24 mL鹽酸中，冷卻至室溫后，加水定容至100 mL），置于60 ℃水浴衍生15 min，取出冷卻至室溫后加入4 mL二氯甲烷，渦旋3 min于8 000 r/min離心3 min，取上清液再用2 mL二氯甲烷萃取2次，合并3次下層黃色萃取液。萃取液于40 ℃氮氣吹干，冷卻至室溫，2 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 mm混合微孔濾膜，進液相色譜儀測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相為甲醇-水（70∶30，V/V）；檢測器為二極管陣列檢測器；檢測波長338 nm；進樣量20 μL；流速1 mL/min。

1.2.3 標準溶液

標準中間溶液（100 mg/L）配制。準確吸取0.4 mL甲醛置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配成甲醛標準溶液（4 mg/L），現(xiàn)配現(xiàn)用。

標準工作液配制。分別準確吸取0.2 mL甲醛儲備液溶液及甲醛標準中間液2.000，0.500，0.050和0.025 mL，置于15 mL離心管中，加水定容至2 mL，配制成甲醛的系列標準溶液（10.00，4.00，1.00，0.10和0.05 mg/L）。

1.2.4 甲醛揮發(fā)動力學試驗設計

準確稱取73份陽性牛百葉樣品（試樣每份10 g），其中1份直接進行甲醛含量的測定（初始殘留量），其余72份均分為3組，分別放在4，15和35 ℃的恒溫裝置中。樣品在3種恒溫裝置下分別放置1，3，5，7，9，24，30和48 h，3種溫度下每個時間點取出3份試樣，用2, 4-二硝基苯肼衍生液液相色譜法測定每個時間點牛百葉中甲醛含量，每個樣品重復測定2次，統(tǒng)計6組數(shù)據(jù)并計算該組數(shù)據(jù)的平均值及相對標準偏差，得到牛百葉中甲醛在該溫度下的揮發(fā)情況。根據(jù)一級動力學模型定甲醛的揮發(fā)速率，建立式（1）。

式中：C為牛百葉樣品中甲醛含量，mg/kg；k為甲醛的衰減反應數(shù)率系數(shù)；t為時間，h。所以甲醛的衰減也可以描述為：

式中：y為牛百葉樣品中甲醛含量，mg/kg，C0為牛百葉中甲醛的初始濃度，mg/L。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的可靠性考察

在1.2.2的儀器條件下，以測定標準曲線上6個不同濃度甲醛與2, 4-二硝基苯肼衍生化生成的2, 4-二硝基腙峰面積，測定其線性回歸方程，相關系數(shù)，線性范圍見表1。

表1 線形回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍

通過液相色譜法試驗條件的優(yōu)化，按照1.2.3配制標準工作液（0.01～10 mg/L，即為牛百葉中甲醛含量0.1～100 mg/kg）。結果表明，線性關系良好，線性相關系數(shù)大于0.999，滿足模擬試驗甲醛的檢測要求，能夠準確測定牛百葉中甲醛濃度。

2.2 牛百葉中甲醛的揮發(fā)

2.2.1 牛百葉在4 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動力學

依據(jù)1.2的方法所測得的數(shù)據(jù)，以4 ℃時牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)與揮發(fā)時間作圖（見圖1）。

圖1 在4 ℃時牛百葉中甲醛的揮發(fā)動力學曲線

牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)隨時間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見圖2）。根據(jù)式（3）建立一級動力學模型，即為lny=-0.009 4t+4.577 3；R2=0.958 9。故4 ℃時牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k= 0.009 4。

圖2 4 ℃時牛百葉中甲醛揮發(fā)過程中時間與lnC的線性關系（0～9 h）

2.2.2 牛百葉在15 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動力學

依據(jù)1.2的方法所測得的數(shù)據(jù)，在15 ℃時牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)與揮發(fā)時間作圖（見圖3）。

圖3 在15 ℃時甲醛在牛百葉中揮發(fā)動力學曲線

牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)隨時間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見圖4）。根據(jù)式（3）建立一級動力學模型，即為lny=-0.046 7t+4.562；R2=0.973 3。故15 ℃時牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k= 0.046 7。

圖4 15 ℃時牛百葉中甲醛揮發(fā)過程中時間與lnC的線性關系（0～9 h）

2.2.3 牛百葉在35 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動力學

依據(jù)1.2的方法所測得的數(shù)據(jù)，在35 ℃時牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)與揮發(fā)時間作圖（見圖5）。

圖5 在35 ℃時甲醛在牛百葉中揮發(fā)動力學曲線

可見，牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)隨時間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見圖6）。根據(jù)公式（3）建立一級動力學模型，即為lny=-0.063 7t+ 4.613 7；R2=0.954 8。故35 ℃時牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k=0.063 7。

圖6 35 ℃時牛百葉中甲醛揮發(fā)過程中時間與lnC的線性關系（0～9 h）

2.2.4 不同溫度下對甲醛揮發(fā)性的影響

牛百葉試樣在1.2的試驗條件下處理，計算出牛百葉中甲醛的初始含量及各個不同貯藏條件下甲醛的殘留量及揮發(fā)情況，根據(jù)甲醛殘留量隨時間的變化情況繪制曲線（見圖7，圖8）。

圖7 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛殘留量隨時間的變化曲線

結果表明，在不同貯藏條件下（4，15和35 ℃），放置相同時間后，牛百葉中甲醛在35 ℃條件下殘留量顯著低于15 ℃條件下；15 ℃條件下甲醛殘留量明顯低于4 ℃條件下，說明牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率與放置時間和外界溫度有關。牛百葉中甲醛的殘留量隨溫度升高及放置時間增加而降低，在0～9 h之間有顯著的下降趨勢，在9～48 h之間，其揮發(fā)程度趨于穩(wěn)定。

由圖8可知，揮發(fā)量隨著溫度升高而增多。在9 h內牛百葉中甲醛快速揮發(fā)，其甲醛減少量占整個試驗過程甲醛減少總量的60%以上，之后隨著單位時間增加，甲醛揮發(fā)速率逐漸減少，牛百葉中甲醛含量趨于穩(wěn)定?？赡艿脑蚴羌兹┦蔷哂幸欢〒]發(fā)性有機物[17]，其氣態(tài)沸點為-19.5 ℃，當基質所處環(huán)境溫度高于其沸點時基質內的甲醛就會揮發(fā)，而且揮發(fā)速率隨著溫度升高而增加[18-19]。

從圖1～圖6可以看出，牛百葉中甲醛殘留量的對數(shù)與揮發(fā)時間基本呈線性相關性。數(shù)據(jù)表明：甲醛的揮發(fā)速率在0～9 h明顯；9～48 h趨于放緩，且試驗結果表明（圖8）隨著外界溫度升高甲醛的揮發(fā)速率增快。可能的原因是由于甲醛是一種易溶于水的物質，而牛百葉中甲醛的釋放過程是一個動態(tài)平衡的過程，隨著揮發(fā)時間增加，牛百葉中水分呈遞減趨勢，在0～9 h時牛百葉中水分基本保持穩(wěn)定，而在9～48 h牛百葉中水分發(fā)生明顯改變，導致牛百葉內部濕度發(fā)生改變，使得甲醛的釋放速率減慢趨于平緩，故選擇0～9 h時間范圍內數(shù)據(jù)作為揮發(fā)方程的參考值。

圖8 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)量

分別采用零級、一級和二級動力學方程對牛百葉中甲醛（0～9 h）進行揮發(fā)動力學模型擬合，通過各個擬合方程的r值比較各擬合模型效果，結果表明一級模型擬合時r值最大效果最好。因此可以得出，在試驗條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)過程符合一級動力學模型，計算得到的參數(shù)很好地反映不同溫度條件下牛百葉中甲醛的動力學情況，相關系數(shù)見表2。

由于食品中甲醛的含量在貯藏過程中會不斷變化，會受到各種內外在因素的影響，如溫度、時間等[20]。試驗表明自然揮發(fā)的主要影響因素是存放的溫度，隨著溫度升高，甲醛揮發(fā)數(shù)率增大（見表2），且隨著時間延長而增加。

表2 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)動力學方程及相關系數(shù)

3 結論

試驗模擬非法添加甲醛后牛百葉中甲醛的揮發(fā)殘留量，結果表明陽性樣品在不同溫度貯藏一定時間后甲醛殘留量有所減少，但是仍有部分殘留。牛百葉中甲醛的揮發(fā)基本符合一級動力學過程，牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率與溫度有關，溫度越高，揮發(fā)速率越快；同一外界環(huán)境下，在0～9 h的揮發(fā)速率顯著，放置9 h后揮發(fā)趨于平緩。試驗方法不足之處在于未能發(fā)現(xiàn)牛百葉中水分與甲醛揮發(fā)速率的相關性；因試驗所用牛百葉測試樣品均制成糜狀，未能驗證樣品不同狀態(tài)下對甲醛揮發(fā)速率是否存在影響；另外，甲醛試驗對象僅為牛百葉，未能涉及到其他水發(fā)產品，無法驗證甲醛揮發(fā)速率是否與樣品間的差異性相關。