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胃癌中TRIM11的表達(dá)及其對PI3K/Akt信號通路的影響

2022-08-04 06:22都向陽侯英勇
臨床與實驗病理學(xué)雜志 2022年6期
關(guān)鍵詞:孵育免疫組化試劑盒

都向陽,袁 偉,任 磊,侯英勇

胃癌是一種常見的惡性腫瘤,具有發(fā)病率、病死率高的特點[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示:2015年我國新發(fā)胃癌患者40萬,死亡患者約29萬,嚴(yán)重危害人類生命健康[3]。目前有關(guān)胃癌的治療方式主要包括手術(shù)和放、化療,其中手術(shù)治療仍然是胃癌患者獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵,然而胃癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜,病死率仍較高[4-5]。

三結(jié)構(gòu)域蛋白11(tripartite motif containing 11, TRIM11)是TRIM家族蛋白成員之一,廣泛參與細(xì)胞凋亡、增殖,對細(xì)胞周期調(diào)控起重要作用[6]。TRIM11作為一種促癌因子,可以通過多途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[7]。在分期較高的膠質(zhì)瘤中TRIM11呈高表達(dá),低分化以及預(yù)后良好的膠質(zhì)瘤中TRIM11呈低表達(dá)[8]。另外,TRIM11能夠通過激活MAPK信號或PI3K/Akt信號促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[9-10]。目前,有關(guān)TRIM11在胃癌中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)功能及其潛在的分子機制尚不清楚。因此,本文擬通過分析胃癌組織中TRIM11的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性,并進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實驗探討TRIM11對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其潛在分子作用機制,以期為胃癌患者提供新的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2018年1月~2021年1月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行手術(shù)腫瘤切除治療,且隨訪資料和病理資料均完整的胃癌標(biāo)本120例。胃癌癌組織及其癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣3 cm以上)樣本經(jīng)手術(shù)切除后迅速分塊放置于液氮罐內(nèi)凍存或經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋保存。患者病理信息由我院病理醫(yī)師復(fù)診確診。

1.1.2主要試劑 免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司);qTR-PCR檢測試劑盒(日本Takara公司);引物設(shè)計與合成(上海生工生物工程公司);轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州銳博公司);TRIM11兔單克隆抗體、PI3K小鼠多克隆抗體、Akt兔多克隆抗體(英國Abcam公司);HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒、BCA試劑盒、ECL顯影液(碧云天公司)。

1.1.3儀器 細(xì)胞勻漿儀(武漢泰普拓公司,型號TWK-FST32);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技中國公司,型號Micro17R);倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司,型號GPJ9-TS100-F);全自動多功能酶標(biāo)檢測儀(賽默飛世爾科技中國公司,型號FC);電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司,型號1658033);ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化檢測TRIM11表達(dá) 石蠟樣本4 μm厚切片,按照免疫組化EnVision法染色試劑盒進(jìn)行操作。3%H2O2孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶,85 ℃抗原修復(fù),加入10%BSA封閉20 min。加入TRIM11小鼠單克隆抗體(稀釋比1∶200),4 ℃孵育過夜。加入對應(yīng)HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,室溫下孵育30 min。滴加DAB顯色液顯色,其中TRIM11陽性區(qū)域存在明顯的棕色顆粒沉著。免疫組化結(jié)果判定:細(xì)胞膜無陽性著色或著色<10%為陰性;細(xì)胞膜著色≥10%為陽性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購于北京腫瘤研究所,人胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、BGC-82購自ATCC公司,將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)AGS細(xì)胞生長融合度達(dá)60%~70%時,使用質(zhì)粒3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染TRIM11無關(guān)片段(TRIM11-NC組)以及TRIM11干擾片段(TRIM11-siRNA組)。依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作,其中TRIM11-NC序列:5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGU-3′;TRIM11-siRNA序列:5′-GCG UGCAAGUGGACGUUAATT-3′。Control組細(xì)胞常規(guī)(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h。

1.2.3qRT-PCR檢測TRIM11 mRNA表達(dá)水平 取液氮罐內(nèi)凍存的胃癌組織樣本,經(jīng)液氮研磨后,加入TRIzol裂解液提取組織樣本總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行TRIM11 mRNA表達(dá)擴(kuò)增,以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算得出TRIM11 mRNA的相對表達(dá)量。TRIM11引物序列:上游5′-TGCCAGCTGCTTAAA CATTC-3′,下游5′-GTGGCTGAGCTCTTCTGTCG-3′。β-actin引物序列:上游5′-CCATCACCATCTTCCAG GAG-3′,下游5′-CCTGCTCACCACCTTCTTG-3′。以胃癌組織TRIM11 mRNA表達(dá)平均值為界,將TRIM11 mRNA表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2.4EdU染色檢測胃癌細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞,按照(0.4~1)×104個/孔接種至96孔板內(nèi),培養(yǎng)至正常生長階段。(1)EdU標(biāo)記:細(xì)胞培養(yǎng)基∶EdU溶液按照1 000∶1的比例制備EdU稀釋液;(2)每孔加入100 μL EdU培養(yǎng)液孵育2 h,傾去培養(yǎng)基;(3)PBS浸洗細(xì)胞1~2次,每次3 min;(4)每孔加入100 μL細(xì)胞固定液,室溫固定20 min;(5)PBS浸洗細(xì)胞1~2次,每次3 min;(6)每孔加入100 μL DAPI染液,避光、室溫、脫色搖床孵育約20 min,傾去細(xì)胞染液;(7)每孔每次加入100 μL PBS浸洗1~3次,于100倍顯微鏡下觀察著色情況并拍照。胃癌細(xì)胞增殖指數(shù)(%)=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRIM11-NC或TRIM11-siRNA 24 h后,收集各組細(xì)胞,PBS浸洗3次,離心后傾去細(xì)胞液,細(xì)胞重懸將濃度調(diào)整為1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作,在488 nm處分別激發(fā)525 nm和620 nm帶孔濾波器,檢測FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)熒光,從而得到三組胃癌細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測TRIM11、PI3K、Akt的表達(dá) 收集各組細(xì)胞;4 ℃條件下裂解30 min,期間每隔5 min震蕩1次;BCA法測定蛋白質(zhì)濃度;凝膠電泳;濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜;上樣;用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入TRIM11小鼠單克隆抗體(1∶1 000),PI3K小鼠多克隆抗體(1∶1 000),Akt兔多克隆抗體(1∶1 000)以及β-actin抗體(1∶2 000),4 ℃孵育過夜,加入對應(yīng)HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗((1∶5 000)孵育1~2 h;搖床上搖晃,TPBS洗滌5 min×3次,加入顯影液,顯影并拍照。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中TRIM11蛋白表達(dá)水平癌旁正常胃黏膜組織中TRIM11陽性率11.7%(14/120),胃癌癌組織中TRIM11陽性率為80.8%(97/120),TRIM11表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01,圖1)。

圖1 胃組織中TRIM11蛋白表達(dá)水平,EnVision法:A.癌旁組織;B.癌組織

2.2 胃癌組織中TRIM11 mRNA表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中TRIM11 mRNA高表達(dá)68例,低表達(dá)52例。胃癌組織中TRIM11 mRNA表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度均有關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度均無關(guān)(P>0.05,表1)。

表1 TRIM11 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌細(xì)胞中TRIM11 mRNA表達(dá)水平與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,胃癌細(xì)胞系HGC-27、BGC-823和AGS中TRIM11 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,圖2)。其中AGS中TRIM11 mRNA表達(dá)水平最高,應(yīng)用該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 正常胃黏膜上皮細(xì)胞及胃癌細(xì)胞中TRIM11 mRNA表達(dá):與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,*P<0.05,**P<0.01

2.4 轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA對胃癌細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA后,Western blot檢測TRIM11蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示:與Control組相比,TRIM11-siRNA組細(xì)胞TRIM11蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),TRIM11-NC組無顯著變化(P>0.05,圖3)。EdU檢測顯示:與Control組相比,轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA組細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.01),轉(zhuǎn)染TRIM11-NC組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖4)。

圖3 Western blot檢測TRIM11蛋白表達(dá)水平:與Control組相比,**P<0.01

圖4 EdU檢測胃癌細(xì)胞增殖情況:與Control組相比,**P<0.01

2.5 轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA對胃癌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:與Control組相比,轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01),轉(zhuǎn)染TRIM11-NC組細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖5)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞凋亡情況:與Control組相比,**P<0.01

2.6 轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA對胃癌細(xì)胞PI3K/Akt信號的影響Western blot檢測顯示:與Control組相比,轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),轉(zhuǎn)染TRIM11-NC組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05,圖6)。

圖6 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá):與Control組相比,**P<0.01

3 討論

TRIM11作為TRIM基因家族成員之一,其在多種疾病中的作用日益受到重視。TRIM11不僅可維持機體的正常生理狀態(tài)(如細(xì)胞生長、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等),而且還參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[11-12]。新近研究發(fā)現(xiàn),TRIM11能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)程[13]。然而,目前有關(guān)TRIM11在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的機制尚不清楚。

既往研究證實,TRIM11可通過激活MAPK信號通路,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖,延長細(xì)胞周期[10]。另外,在肝癌組織中TRIM11表達(dá)顯著升高,且TRIM11表達(dá)水平與肝癌患者疾病進(jìn)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān),提示TRIM11可能是肝癌患者治療的潛在靶點[14]。本研究首先通過免疫組化檢測TRIM11在120例手術(shù)切除胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá),結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比,胃癌組織中TRIM11陽性細(xì)胞比例顯著升高,表明TRIM11表達(dá)與胃癌疾病進(jìn)展可能存在一定的相關(guān)性。本組檢測TRIM11 mRNA表達(dá)并對其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果顯示TRIM11 mRNA表達(dá)與胃癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤深度均有相關(guān)性,而與患者年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度均無關(guān),提示TRIM11可能是胃癌疾病發(fā)生、發(fā)展的潛在靶標(biāo)分子。細(xì)胞增殖和凋亡的失衡是腫瘤細(xì)胞惡性生長和病變關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。既往研究顯示敲低TRIM11能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29增殖,促進(jìn)凋亡[16]。因此,本研究進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實驗探討TRIM11對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果顯示與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比,胃癌細(xì)胞系TRIM11 mRNA表達(dá)水平顯著升高,與文獻(xiàn)報道一致。與Control組相比,TRIM11-siRNA組細(xì)胞TRIM11蛋白表達(dá)顯著降低,表明胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA成功。EdU和流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:與Control組相比,轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低,凋亡指數(shù)顯著升高,表明TRIM11能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在在胃癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[17]。研究顯示激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[18]。另外,PI3K/Akt信號通路的激活促進(jìn)MMP-2表達(dá)增加,活性增強,從而介導(dǎo)細(xì)胞外基底膜膠原降解,并最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞向外周圍浸潤,促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。因此,針對PI3K/Akt信號通路靶向治療越來越受到研究者的關(guān)注。本研究通過Western blot檢測顯示:與Control組相比,轉(zhuǎn)染TRIM11-siRNA組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量均顯著降低,表明TRIM11能夠通過激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo),促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡。

綜上,胃癌組織中TRIM11呈高表達(dá),且其與胃癌的惡性病理因素相關(guān),TRIM11能夠通過PI3K/Akt信號促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。本研究仍存在一定不足,實驗僅從細(xì)胞層面上初步揭示了TRIM11對胃癌增殖和凋亡的影響和機制,未在動物實驗進(jìn)一步驗證。為此在后續(xù)的研究中將通過構(gòu)建胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型,明確TRIMM11對移植瘤生長作用,為胃癌診斷和治療提供可靠的實驗依據(jù)。

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