鄭 珂，李國平，王麗梅,2，黃 立，張 聲

口腔癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，現(xiàn)全球每年有89萬例新增病例，已成為全球第6常見的癌癥[1]?？谇击[狀細胞癌占口腔癌的90%，5年生存率僅50%～60%，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者生存的重要因素[2-3]。嗜神經(jīng)侵犯是腫瘤沿神經(jīng)播散的一種重要方式，現(xiàn)認為嗜神經(jīng)侵犯是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個連續(xù)和多步驟的過程，嚴重影響口腔腫瘤外科的完整切除[4]。最差的侵襲模式(worst pattern of invasion type, WPOI)是病理形態(tài)學上口腔鱗狀細胞癌腫瘤浸潤前沿的侵襲模式。WPOI有5種侵襲模式，其中WPOI-5代表腫瘤前沿離散浸潤的衛(wèi)星灶與腫瘤主體的距離或兩個衛(wèi)星灶之間的距離大于1 mm，是一種離散跳躍式的侵襲方式[5-6]，預(yù)示腫瘤高侵襲性。第8版口腔腫瘤AJCC分期將嗜神經(jīng)侵犯和WPOI-5作為重點關(guān)注的病理參數(shù)[7]。既往關(guān)于口腔鱗狀細胞癌嗜神經(jīng)侵犯的研究主要是關(guān)注否發(fā)生嗜神經(jīng)侵犯，而對嗜神經(jīng)侵犯的程度研究不足[8]。本實驗通過回顧性分析口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征及預(yù)后與嗜神經(jīng)侵犯程度和WPOI的關(guān)系，為口腔鱗狀細胞癌的治療及預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年1月～2016年12月福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的口腔鱗狀細胞癌標本189例。剔除失訪病例及HE切片不完整病例，最終納入135例。納入標準：(1)術(shù)后病理診斷為口腔鱗狀細胞癌，部位包括舌、牙齦、口底、頰、腭部；(2)初治病例，術(shù)前未接受放、化療或免疫治療；(3)進行標準手術(shù)，術(shù)后依據(jù)分期給予標準輔助治療；(4)隨訪資料完整；(5)本實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批件號20190268)。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤或非原發(fā)性口腔癌；(2)切緣陽性的姑息性手術(shù)切除病例；(3)非口腔鱗狀細胞癌相關(guān)性死亡病例。根據(jù)第8版AJCC分期系統(tǒng)進行分期。通過定期電話或門診病歷系統(tǒng)進行隨訪，開始時間為腫瘤確診時間，終點事件為腫瘤相關(guān)性死亡。

1.2 口腔鱗狀細胞癌嗜神經(jīng)侵犯和WPOI-5組織病理學評估方法所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水、浸蠟、包埋，4 μm厚切片，HE染色，由2名病理醫(yī)師獨立復(fù)習所有HE切片，評估腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)被膜外浸潤、嗜神經(jīng)侵犯及WPOI等組織學特征。

嗜神經(jīng)侵犯的評估采用目前國際上廣泛認可的嗜神經(jīng)侵犯標準：腫瘤接近神經(jīng)，包繞至少1/3的范圍，即腫瘤細胞圍神經(jīng)生長；或腫瘤細胞進入神經(jīng)鞘三層結(jié)構(gòu)任意一層內(nèi)(神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜)，即腫瘤細胞侵入神經(jīng)內(nèi)生長[9]。單灶或多灶嗜神經(jīng)侵犯的評估標準：單灶嗜神經(jīng)侵犯的定義為該病例所有切片鏡下僅查見1處嗜神經(jīng)侵犯，多灶嗜神經(jīng)侵犯定義為2處或2處以上嗜神經(jīng)侵犯[10]。對部分因腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞束與小神經(jīng)束難以區(qū)分或2名病理醫(yī)師意見不一致的病例行S-100染色，確定是否為神經(jīng)束。

WPOI有5種類型：WPOI-1指侵襲前沿呈鈍性推擠性生長；WPOI-2指侵襲前沿呈指狀生長；WPOI-3指侵襲前沿表現(xiàn)為島狀分布的腫瘤細胞大巢，組成腫瘤巢的細胞數(shù)>15個；WPOI-4指侵襲前沿表現(xiàn)為島狀分布的腫瘤細胞小巢，組成腫瘤巢的細胞數(shù)≤15個；WPOI-5指腫瘤侵襲前沿見衛(wèi)星灶呈現(xiàn)離散播散，衛(wèi)星灶距離主瘤體病灶的距離或2個衛(wèi)星灶之間的距離>1 mm。如果在切片中查見WPOI-5侵襲模式，不論多少均判定WPOI-5陽性[5-6]。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，嗜神經(jīng)侵犯、WPOI-5與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗、精確概率法；生存分析采用Kaplan-Meier函數(shù)、Log-rank檢驗；多因素生存分析采用Cox回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征135例口腔鱗狀細胞癌患者年齡20～89歲，中位年齡56歲；其中男性91例，女性44例；分化程度：高分化62例，中分化52例，低分化21例；行淋巴結(jié)清掃者124例，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；淋巴結(jié)被膜外浸潤21例，無淋巴結(jié)被膜外浸潤103例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期35例，Ⅲ期28例，Ⅳ期50例。135例中嗜神經(jīng)侵犯51例(37.8%)(圖1)，其中單灶侵犯34例，多灶侵犯17例；WPOI-5者30例，發(fā)生率為22.2%(30/135)(圖2)。

2.2 口腔鱗狀細胞癌中嗜神經(jīng)侵犯與臨床病理特征的關(guān)系嗜神經(jīng)侵犯與腫瘤浸潤深度(P<0.001)、分化程度(P=0.018)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.038)及TNM分期(P=0.019)等相關(guān)。多灶嗜神經(jīng)侵犯與較深的浸潤深度(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、淋巴結(jié)被膜外浸潤(P=0.03)及較高的TNM分期(P<0.001)等相關(guān)。除浸潤深度(P=0.004)外，單灶神經(jīng)侵犯與其余臨床病理特征無明顯相關(guān)性(表1)。

表1 嗜神經(jīng)侵犯與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 口腔鱗狀細胞癌中WPOI-5與臨床病理特征的關(guān)系WPOI-5與腫瘤浸潤深度(P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)及TNM分期(P=0.018)等相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)被膜外浸潤無關(guān)(表2)。

表2 WPOI-5與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 口腔鱗狀細胞癌中嗜神經(jīng)侵犯及WPOI-5與預(yù)后的關(guān)系生存分析結(jié)果顯示：多灶嗜神經(jīng)侵犯者預(yù)后較差，5年總生存率僅為35.29%(Log-rank檢驗χ2=27.671，P<0.001，圖3A)；WPOI-5者術(shù)后5年總生存率僅為43.33%(Log-rank檢驗χ2=27.671，P=0.002，圖3B)。單因素Cox回歸分析顯示：患者年齡、分化程度、嗜神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及WPOI-5與患者總生存相關(guān)(P<0.05)；多因素Cox回歸分析顯示：患者年齡、腫瘤分化程度及嗜神經(jīng)侵犯是預(yù)后的獨立危險因素，多灶嗜神經(jīng)侵犯的相對危險度高達5.644(P<0.001，表3)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析口腔鱗狀細胞癌中嗜神經(jīng)侵犯及WPOI-5與患者預(yù)后關(guān)系：A.不同嗜神經(jīng)侵犯狀態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系；B.不同WPOI-5狀態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系

表3 口腔鱗狀細胞癌患者預(yù)后的Cox回歸分析

3 討論

TNM分期系統(tǒng)是腫瘤分期分組及預(yù)測預(yù)后的標準工具。第8版AJCC在口腔癌TNM分期章節(jié)增加了腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)被膜外浸潤兩個參數(shù)，提高了口腔癌預(yù)后分層的準確性[7]。然而，仍有部分相同TNM分期患者顯示不同的預(yù)后，需要尋找新的標志物增強預(yù)后預(yù)測及分層管理。

早先認為嗜神經(jīng)侵犯僅是癌細胞在腫瘤局部的一條低阻力侵襲通道。隨著分子生物學的發(fā)展，近年來認為嗜神經(jīng)侵犯是腫瘤細胞與神經(jīng)微生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜對話，是腫瘤進展的連續(xù)和多步驟過程，與多種腫瘤高侵襲性生物學行為相關(guān)[11]。既往報道口腔鱗狀細胞癌嗜神經(jīng)侵犯的發(fā)生率范圍跨度極大(5.2%～71%)，推測可能與不同研究中嗜神經(jīng)侵犯評估標準的差異有關(guān)[12-14]。本實驗嚴格使用Liebig等[9]提出的嗜神經(jīng)侵犯標準，由2名病理學家獨立評估，并對有疑問的病例輔以S-100染色以確定神經(jīng)束，發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌中嗜神經(jīng)侵犯的發(fā)生率為37.8%(51/135)，與文獻報道的范圍相符。

有研究發(fā)現(xiàn)嗜神經(jīng)侵犯與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學分級相關(guān)[15-16]，而Chang等[17]并未發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。但這些研究均未區(qū)分神經(jīng)侵犯的程度。本實驗通過分析腫瘤是否存在嗜神經(jīng)侵犯，顯示伴嗜神經(jīng)侵犯與更深的浸潤深度、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期等不良臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)；進一步分析單灶與多灶嗜神經(jīng)侵犯，發(fā)現(xiàn)多灶嗜神經(jīng)侵犯與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)被膜外浸潤、TNM分期顯著相關(guān)，而單灶嗜神經(jīng)侵犯除浸潤深度外，與其他臨床病理參數(shù)無關(guān)。本實驗結(jié)果提示：多灶嗜神經(jīng)侵犯預(yù)示口腔鱗狀細胞癌的高侵襲性，建議有必要將單灶及多灶嗜神經(jīng)侵犯進行區(qū)分。

口腔鱗狀細胞癌中WPOI的相關(guān)研究較少。Brandwein等[5]首先將口腔鱗狀細胞癌侵襲前沿的侵襲模式分5種類型，建立風險預(yù)測模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ期患者WPOI-5的局部復(fù)發(fā)風險增高。Chatterjee等[18]發(fā)現(xiàn)WPOI-5與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。WPOI形態(tài)對應(yīng)的分子機制尚不明了，部分研究提示W(wǎng)POI可能與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。Suresh等[19]發(fā)現(xiàn)差分化口腔鱗狀細胞癌的侵襲前沿E-cadherin表達量降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高；Qin等[20]驗證了其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣蛋白表型。本實驗發(fā)現(xiàn)WPOI-5不僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且伴WPOI-5者腫瘤浸潤深度更深，臨床分期更高，驗證了WPOI-5與侵襲性臨床行為相關(guān)。

關(guān)于口腔鱗狀細胞癌的預(yù)后評估，本實驗發(fā)現(xiàn)通過常規(guī)HE染色即可觀察的許多組織學參數(shù)對口腔鱗狀細胞癌的生存預(yù)后具有預(yù)測作用，如腫瘤浸潤深度、分化程度、嗜神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及WPOI-5在單因素Cox回歸分析中均與患者總生存相關(guān)(P<0.05)；多因素Cox分析顯示：患者年齡、分化程度及嗜神經(jīng)侵犯程度是總生存的獨立危險因素，其中多灶嗜神經(jīng)侵犯的相對危險度高達5.644，顯示了多灶嗜神經(jīng)侵犯在口腔鱗狀細胞癌預(yù)后預(yù)測中的權(quán)重作用，近期Larson等[21]的研究亦得出相似的結(jié)論。

綜上所述，口腔鱗狀細胞癌中多灶嗜神經(jīng)侵犯及WPOI-5是腫瘤進展的重要因素，嗜神經(jīng)侵犯是影響患者總生存率的獨立危險因素，在口腔鱗狀細胞癌的病理評估中要重視嗜神經(jīng)侵犯及WPOI-5的評估，神經(jīng)侵犯應(yīng)區(qū)分單灶及多灶，多灶嗜神經(jīng)侵犯可作為口腔鱗狀細胞癌有力的預(yù)后預(yù)測因子。