黃東東，鄔萬(wàn)新,，陳彩萍，左志博，張 琳，王 振，郭志琴，袁琳娜，汪靜宇

乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(infiltrating ductal carcinoma, IDC)是由導(dǎo)管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)經(jīng)過(guò)微小浸潤(rùn)性癌(ductal carcinoma in situ with microinvasion, DCIS-MI)發(fā)展而來(lái)[1-2]。在DCIS發(fā)展成IDC的過(guò)程中，宿主局部免疫功能起著重要作用，三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structures, TLS)就是其中重要的免疫功能結(jié)構(gòu)[3-4]。目前，對(duì)于TLS在乳腺DCIS浸潤(rùn)和進(jìn)展過(guò)程中的作用尚不明確。因此，本文著重探討乳腺DCIS中TLS的臨床病理特征，分析其與腫瘤浸潤(rùn)的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集嘉興市第一醫(yī)院2011年12月～2017年12月收治的103例DCIS、32例DCIS-MI和78例IDC手術(shù)標(biāo)本。所有病例均經(jīng)病理確診，術(shù)前未接受放、化療且有臨床隨訪資料。隨訪截至2021年4月30日。DCIS和DCIS-MI患者隨訪3～108個(gè)月(中位隨訪時(shí)間68個(gè)月)，平均年齡(53.85±9.72)歲；IDC患者隨訪6～112個(gè)月(中位隨訪時(shí)間56個(gè)月)，平均年齡(54.69±10.94)歲。

1.2 方法

1.2.1組織學(xué)分組及分型 參照WHO(2019)乳腺腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)分別定義DCIS、DCIS-MI和IDC及進(jìn)行分子分型[5]。乳腺癌分子分型為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER-2過(guò)表達(dá)型和三陰型。

1.2.2免疫組化 采用EnVision兩步法行免疫組化染色。主要試劑：CD3(兔單抗，EP41，1∶100)、CD21(兔單抗，EP64，1∶200)和BCL-6(鼠單抗，ZM-0011，1∶200)購(gòu)自北京中杉金橋公司；CD20(鼠單抗，L26，即用型)購(gòu)自福州邁新公司；PNAD(鼠單抗，MECA-79，1∶50)購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司。采用已知的陽(yáng)性或內(nèi)對(duì)照組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。應(yīng)用全自動(dòng)免疫組化儀(Roche Benchmark XT, USA)執(zhí)行免疫組化染色流程。

1.3 結(jié)果判讀TLS判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)判讀區(qū)為癌灶內(nèi)及其周圍≤5 mm間質(zhì)區(qū)域；(2)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞聚集灶，且有CD3和CD20陽(yáng)性細(xì)胞；(3)聚集灶內(nèi)可見(jiàn)高內(nèi)皮小靜脈(high endothelial venules, HEV)，且PNAD陽(yáng)性；(4)聚集灶內(nèi)伴或不伴生發(fā)中心，有或無(wú)CD21陽(yáng)性濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞(follicular dendritic cell, FDC)、BCL-6陽(yáng)性生發(fā)中心細(xì)胞 (germinal center cell, GC)[6-7]。

TLS密度分級(jí)：(1)在DCIS及DCIS-MI中，將TLS按照導(dǎo)管周圍含有TLS的導(dǎo)管數(shù)量占DCIS總導(dǎo)管數(shù)量的百分比進(jìn)行分級(jí)：無(wú)、低(含TLS的DCIS導(dǎo)管<10%)、中等(含TLS的DCIS導(dǎo)管10%～50%)、高(含TLS的DCIS導(dǎo)管>50%)[6-7]。(2)在IDC中，以TLS占據(jù)癌灶周長(zhǎng)的百分比進(jìn)行分級(jí)：無(wú)、低(TLS占據(jù)癌灶周長(zhǎng)<10%)、中等(TLS占據(jù)癌灶周長(zhǎng)10%～50%)、高(TLS占據(jù)癌灶周長(zhǎng)>50%)[6,8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率方法。生存分析采用Kaplan-Meier。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLS的特征及在DCIS、DCIS-MI和IDC中的分布在DCIS、DCIS-MI和IDC中，TLS均以淋巴細(xì)胞聚集灶形式存在，CD3+細(xì)胞圍繞TLS周邊，CD20+細(xì)胞主要位于GC及套區(qū)，PNAD+HEV存在于TLS內(nèi)部(圖1)。TLS在DCIS和DCIS-MI中主要分布于導(dǎo)管周圍，在IDC中主要分布于浸潤(rùn)灶周邊。

圖1 同一導(dǎo)管原位癌病例連續(xù)切片：A. TLS的組織結(jié)構(gòu)，HE染色；B.CD3+T淋巴細(xì)胞，EnVision兩步法；C.CD20+B淋巴細(xì)胞，EnVision兩步法；D. CD21+濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞，EnVision兩步法；E. BCL-6+生發(fā)中心細(xì)胞，EnVision兩步法；F. PNAD+高內(nèi)皮小靜脈，EnVision兩步法

2.2 TLS與DCIS、DCIS-MI和IDC臨床病理特征的關(guān)系103例DCIS中，不同核級(jí)組間TLS密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)，隨著核級(jí)的增高DCIS中TLS高密度數(shù)增高。DCIS伴有壞死組較無(wú)壞死組的TLS高密度數(shù)增高(χ2=41.127，P<0.001)。DCIS不同分子分型組間TLS密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中HER-2過(guò)表達(dá)型DCIS中TLS高密度比例最高。32例DCIS-MI中，不同分子分型(P=0.019)、核級(jí)(P=0.007)分組間TLS密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨核級(jí)的增高DCIS中TLS高密度數(shù)增高(表1)。

表1 TLS密度與乳腺導(dǎo)管原位癌及乳腺導(dǎo)管原位癌伴微浸潤(rùn)臨床病理特征的關(guān)系

TLS在DCIS中的發(fā)生率78.6%(81/103)，在DCIS-MI中的發(fā)生率96.9%(31/32)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.680，P<0.001)，且在DCIS-MI中高于DCIS。

78例IDC中，不同組織學(xué)分級(jí)(P<0.001)、核級(jí)(P=0.016)、腫瘤直徑(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.043)和分子分型(P=0.001)分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并隨組織學(xué)分級(jí)增高、核級(jí)增高、腫瘤體積增大和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)TLS密度增高，其中HER-2過(guò)表達(dá)型IDC中TLS高密度比例最高(表2)。

表2 TLS密度與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TLS與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系三組病例臨床隨訪中均無(wú)局部復(fù)發(fā)。DCIS和DCIS-MI組有3例發(fā)生肺或骨轉(zhuǎn)移，2例死于乳腺癌。IDC組有5例發(fā)生肺、骨或腦轉(zhuǎn)移，3例死于乳腺癌。生存分析顯示：在DCIS及DCIS-MI中(圖2A)，有TLS組和無(wú)TLS組患者的5年生存率分別是99.3%和100.0%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.518)。在IDC中(圖2B)，有TLS組和無(wú)TLS組患者的5年生存率分別是94.2%和100.0%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.220)。

圖2 A.有TLS組和無(wú)TLS組的乳腺導(dǎo)管原位癌、乳腺導(dǎo)管原位癌伴微浸潤(rùn)患者的生存率；B.有TLS組和無(wú)TLS組的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的生存率

3 討論

TLS是在原沒(méi)有淋巴組織聚集的部位出現(xiàn)的一種獲得性免疫功能結(jié)構(gòu)，目前認(rèn)為它是腫瘤局部免疫的關(guān)鍵因素[3]。本研究中78.6%DCIS的導(dǎo)管周圍存在密度不等的TLS，且隨著DCIS核級(jí)的增高或伴有壞死時(shí)，導(dǎo)管周圍TLS的密度增大。Pruneri等[9]發(fā)現(xiàn)DCIS中64.8%病例的導(dǎo)管周圍存在不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且DCIS的核級(jí)越高，出現(xiàn)圍管型淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象越明顯。同時(shí)，有研究[10-11]在對(duì)DCIS免疫微環(huán)境的研究中發(fā)現(xiàn)：導(dǎo)管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞基因組高拷貝數(shù)和p53突變有關(guān)，此類腫瘤細(xì)胞較易產(chǎn)生新的腫瘤抗原，吸引免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，并在形態(tài)學(xué)上其常表現(xiàn)為高核級(jí)和壞死改變。

本組中96.9%的DCIS-MI導(dǎo)管周圍存在TLS，密度明顯高于DCIS組；其中DCIS成分大部分是高核級(jí)，表明大多數(shù)DCIS-MI來(lái)自高核級(jí)DCIS，且伴隨導(dǎo)管周圍TLS密度增加，微小浸潤(rùn)癌發(fā)生率也增加。Beguinot等[12]在研究DCIS和DCIS-MI關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：DCIS存在2種不同亞型，其中伴有高密度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的DCIS在生物學(xué)上與DCIS-MI類似，認(rèn)為DCIS-MI更多的是來(lái)自于伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的DCIS。Kim等[7]在對(duì)DCIS-MI的研究中同樣發(fā)現(xiàn)TLS數(shù)量明顯多于單純性DCIS。Yuan等[13]在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，癌灶局部浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞對(duì)肌上皮具有破壞作用，利于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的發(fā)生。因此，TLS可能與DCIS腫瘤細(xì)胞早期浸潤(rùn)的發(fā)生有關(guān)。

本組IDC病例隨著癌灶周圍TLS密度的增加，腫瘤的組織學(xué)分級(jí)增高，體積增大，并更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示TLS可能與乳腺癌組織學(xué)不良預(yù)后因素相關(guān)。Toss等[14]在192例同時(shí)含有IDC與DCIS成分的乳腺癌病例中發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)性癌區(qū)域出現(xiàn)了高密度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。Sofopoulos等[15]隨訪了112例乳腺IDC患者，與缺乏TLS的患者相比，瘤周存在TLS患者的無(wú)瘤生存期和總生存期均較差，認(rèn)為TLS是預(yù)后不良的因素。

在乳腺癌分子分型與TLS密度關(guān)系中，DCIS和IDC中HER-2過(guò)表達(dá)型病例的TLS密度均高于其他亞型，提示HER-2陽(yáng)性癌細(xì)胞可能更易激活免疫系統(tǒng)反應(yīng)，在癌灶局部產(chǎn)生TLS。Kim等[7]研究也發(fā)現(xiàn)TLS與HER-2過(guò)表達(dá)/激素受體陰性表型有關(guān)。HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌出現(xiàn)較多TLS的原因，可能與此型乳腺癌表達(dá)可吸引免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的HMGB1和HMGN1蛋白有關(guān)[16]。

目前，有關(guān)TLS與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)果尚不一致。有研究表明IDC瘤周存在的TLS是預(yù)后不良因素[17]；但在三陰型或HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)TLS是預(yù)后良好指標(biāo)[6,17]。這些差異可能與上述研究所涉及的乳腺癌類型不同有關(guān)，TLS常見(jiàn)于三陰型或HER-2過(guò)表達(dá)型的高侵襲性乳腺癌，當(dāng)與低侵襲類型乳腺癌比較預(yù)后時(shí)，可能癌細(xì)胞本身起決定性作用；而在同一類型乳腺癌中，TLS就可能成為預(yù)后有利的因素。本研究未觀察到TLS對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響，可能與樣本量少和隨訪時(shí)間有限有關(guān)。

綜上，乳腺DCIS出現(xiàn)高核級(jí)、壞死和HER-2過(guò)表達(dá)時(shí)常伴有TLS的形成，并且TLS與DCIS早期浸潤(rùn)相關(guān)。進(jìn)一步研究DCIS導(dǎo)管周圍TLS的免疫細(xì)胞組成及效應(yīng)關(guān)系，可為乳腺癌早期抑制腫瘤進(jìn)展方面提供新的思路。