徐洪雨， 李鈺瑩

(1.山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院， 山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草高效生產(chǎn)模式創(chuàng)新重點實驗室， 山西 太谷 030801)

紫花苜蓿(MedicagostaviaL.)是一種重要的多年生飼用豆科植物，具有營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性廣等優(yōu)點。它還是世界上栽培最廣泛的作物之一，常作為種質(zhì)資源用于飼料的育種[1]。我國苜蓿種植區(qū)分布在全國14個省，從低緯度到高緯度均有分布。然而，極端的環(huán)境條件影響苜蓿的生長和質(zhì)量，并限制其生存范圍，如低溫、鹽漬和干旱脅迫[2]。在美國中西部、加拿大、北歐及我國東北等地，苜蓿常常無法抵御嚴酷的冬季條件[3]。2012年，我國內(nèi)蒙古通遼苜蓿的返青率在50%以下[4]；2012—2020年間，內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗優(yōu)質(zhì)苜蓿生產(chǎn)基地也多次發(fā)生返青率低的問題[5]。

當植物暴露在非冷凍溫度下時，可通過調(diào)整自身獲得抗寒性，從而適應(yīng)后期的冰凍條件，并能夠生存下來。從進化的角度來講，此過程稱之為冷適應(yīng)或冷馴化[6]。植物冷適應(yīng)過程，體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控冷誘導基因表達的變化[7]。其中，生理生化變化涉及生長形態(tài)[8]、膜結(jié)構(gòu)和細胞骨架等[9]；積累可溶性糖(如蔗糖、棉子糖和海藻糖)和低分子量含氮化合物(脯氨酸、甘氨酸和甜菜堿)，改變膜的組成和性能[10-11]。有些耐寒植物能夠產(chǎn)生特異蛋白，通過降低冰點來保護細胞結(jié)構(gòu)[12-13]。在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控冷誘導基因變化方面，研究最廣泛的耐凍途徑為CBF(C-repeat Binding Factor)信號通路[14]。它包括三個基因CBF1，CBF2和CBF3，這些基因共享一個保守的AP2 DNA結(jié)合區(qū)，并通過啟動子中特征良好的冷重復(fù)/干旱響應(yīng)(CRT/DRE)調(diào)控元件激活冷響應(yīng)基因(COR)的表達[15]。CBF1和CBF3基因受CBF2的負調(diào)控，并對誘導整個CBF調(diào)節(jié)子和冷適應(yīng)的提升具有協(xié)同累加效應(yīng)[16-18]。此外，CBF信號通路可提高植物的抗寒性，對擬南芥(Arabidopsisthaliana)[19]、大麥(Hordeumvulgare)[20]、白楊(Populussimonii)[21]和水稻(Oryzasativa)[22]等的研究均已證實此結(jié)果。MtCBF3(又名MtDREB1C)的克隆及在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的過表達誘導了冷調(diào)節(jié)基因(COR)的表達，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性[23]。冷適應(yīng)過程非常復(fù)雜，幾乎涉及到細胞的每一個過程，如何找出調(diào)控植物耐寒性的關(guān)鍵過程是一個巨大挑戰(zhàn)[18]。

近年來，核糖核酸(RNA)測序分析已成為一種可以生成大量基因序列并構(gòu)建表達譜的有效方法[24]?？购砸蛑参锓N類而異，在一定程度上也取決于特定組織或器官對冷凍脅迫的反應(yīng)。近年來，在應(yīng)對鹽漬和干旱脅迫中，人們對紫花苜蓿進行了多項研究，包括單核苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)、基因鑒定及轉(zhuǎn)錄組的分析[25-26]。在冷脅迫條件下，苜蓿轉(zhuǎn)錄組的變化也有學者進行了測定，但仍未能有效篩選出影響抗寒性的關(guān)鍵基因。植物物質(zhì)代謝過程并不是由單個基因所決定，因此篩選單個基因并通過研究其功能來解析苜蓿的抗寒機制往往效率較低。2020年，苜蓿基因組的發(fā)布，對于轉(zhuǎn)錄組研究奠定了堅實基礎(chǔ)[27]。借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及KEGG數(shù)據(jù)庫分析，篩選冷適應(yīng)過程的關(guān)鍵生物通路，進一步分析參與的基因或基因模塊，將為解析苜蓿冷適應(yīng)調(diào)節(jié)機制提供新的思路。

本研究選擇我國種植廣泛且抗寒性差異較大的苜蓿品種‘肇東’和‘WL440HQ’作為試驗材料，借助高通量測序技術(shù)對冷適應(yīng)處理前后苜蓿的基因表達進行測定。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果，篩選冷適應(yīng)處理前后差異表達基因，進一步從代謝的角度分析與苜蓿冷適應(yīng)過程抗寒性變化相關(guān)的代謝過程，以及冷適應(yīng)后2品種苜蓿抗寒性差異的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇我國北方常用的苜蓿品種‘WL440HQ’(WL，秋眠級6)和‘肇東’(ZD，秋眠級2)作為試驗材料。2020年5月，將苜蓿種子播種在沙質(zhì)試驗田內(nèi)，幼苗期每2日澆水一次，保持土壤濕潤。此外，及時控制雜草生長及病蟲害的發(fā)生。

播種一個月選擇生長一致的苜蓿幼苗移栽至PVC管，而后在培養(yǎng)箱里進行試驗處理，移栽定植每管4株。PVC管的規(guī)格為直徑10 cm，高15 cm。移栽時，管內(nèi)的填充物是由土壤、珍珠巖和蛭石按重量比100∶30∶55混合而成，其田間持水量為151%([濕重-干重]/干重)。移栽后，先將材料放在培養(yǎng)箱(中國廣東泰宏器械)內(nèi)進行2周的恢復(fù)生長，期間培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度設(shè)置為24℃/20℃(晝/夜)、光周期為14 h/10 h(晝/夜)和光照為300～400 μmol·m-2·s-1?；謴?fù)生長后，進行2個階段的溫度控制試驗，包括適應(yīng)性生長和冷適應(yīng)處理。本研究試驗處理設(shè)置3次生物學重復(fù)，共需苜蓿苗48株，其中包括2品種×2階段×3生物學重復(fù)×每管4株。

1.2 試驗處理

恢復(fù)生長后進行適應(yīng)性生長和冷適應(yīng)處理(詳見圖1)，期間每日補水控制PVC管內(nèi)的基質(zhì)含水量為田間持水量的75%，且每日隨機變換PVC管的位置。階段1為適應(yīng)性生長，18℃(晝/夜)環(huán)境下培養(yǎng)1周后在S1點取樣。所得樣品采用“品種+試驗階段_生物學重復(fù)”的方式進行命名，S1點所得樣品分別命名為WL1_1，WL1_2，WL1_3，ZD1_1，ZD1_2和ZD1_3。階段2為冷適應(yīng)處理，先在2℃(晝/夜)下培養(yǎng)1周，而后將溫度降低到-2℃(晝/夜)再培養(yǎng)1周，在S2點再次取樣，所得樣品分別命名為WL2_1，WL2_2，WL2_3，ZD2_1，ZD2_2和ZD2_3。在2個試驗階段，光周期設(shè)置為12 h/12 h(晝/夜)，光強100～150 μmol·m-2·s-1。

圖1 試驗處理過程Fig.1 The experimental process of two phases

1.3 取樣

取樣時，每個品種隨機選擇3管，每PVC管里的4株材料上摘取的葉片作為1個生物學重復(fù)的樣品。取樣完成后，葉片樣品分別用做低溫半致死溫度(LT50)和轉(zhuǎn)錄組的測定。其中，新鮮樣品通過測定細胞液相對滲透率，計算LT50以評價樣品的抗寒性；另一份樣品液氮速凍后放于-80℃?zhèn)溆茫糜赗NA測序。

1.4 低溫半致死溫度

本研究根據(jù)LT50評價樣品的抗寒性，即細胞內(nèi)離子相對滲透性達到50%時所對應(yīng)的處理溫度，其測定方法參考Xu[28]。離體冷凍測試前，將新鮮的葉片放于2 mL的離心管內(nèi)，4℃下放置2 h，然后放在冰上做短暫的保存。冷凍測試時，在ZX-5C恒溫循環(huán)器(智信，中國上海)內(nèi)通過一系列逐漸降低的溫度對樣品進行離體冷凍。對于取樣點S1的樣品，冷凍溫度分別為-4℃，-6℃，-8℃，-10℃，-12℃，-14℃，-16℃，-18℃和-20℃；對于取樣點S2的樣品，冷凍溫度設(shè)置為-5℃，-8℃，-11℃，-14℃，-17℃，-20℃，-23℃，-26℃和-29℃。在每一溫度下冷凍1 h后，取出一份裝有相應(yīng)樣品的離心管并放置在冰里過夜保存。次日，將裝有樣品的離心管先在4℃下緩沖2 h。而后，將樣品轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管內(nèi)，加入5 mL的去離子水后在搖床HZQ-A(恒瑞，江蘇)上搖12 h。隨后，使用電導率儀FE38(Mettler Toledo，上海)測定樣品的電導率并記為EL1。測定完EL1后，將樣品在120℃下蒸煮30 min，測定電導率記為EL2。細胞液相對滲透率大小及樣品LT50大小分別根據(jù)公式(1)和公式(2)進行計算。在公式(1)中，EL為去離子水的電導率，在公式(2)中，x代表冷凍溫度，y代表相對電導率，A和B是常數(shù)。在抗寒性比較分析中，采用最小顯著差數(shù)法進行差異顯著性判斷，差異顯著性水平P< 0.05。

相對電導率(%)=(EL1-EL)/(EL2-EL)×100

(1)

y(%)=A/(1+B×e-kx)×100

(2)

1.5 RNA的提取、文庫的建立及轉(zhuǎn)錄組測序

本研究使用Trizol試劑(Invitrogen，USA)并根據(jù)說明書提取葉片的總RNA。使用AMPure XP系統(tǒng)(Beckman Coulter，Austrilia)對RNA進行純化，并用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，USA)對RNA質(zhì)量進行評估。RNA測序工作用生物標記技術(shù)完成(北京，中國)，使用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina?(NEB，USA)構(gòu)建RNA-Seq建庫。在總RNA中使用帶有磁珠的poly-T oligo對mRNA進行純化。用逆轉(zhuǎn)錄酶將打碎后的RNA片段合成第一鏈cDNA，然后使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二條cDNA鏈。將這些片段連接到測序適配器上，在Illumina HiSeq 2500平臺上對文庫制備物進行測序，生成平均長度為150 bp的原始數(shù)據(jù)，本研究原始序列存入NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(PRJNA814482)。

1.6 序列比對及功能注釋

測序完成后，去除接頭和低質(zhì)量序列(含有poly-N及堿基質(zhì)量值小于Q20的Reads)，對原始數(shù)據(jù)進行過濾，從而獲得Clean Data。本研究最終采用堿基質(zhì)量值≥Q30的Reads。而后，使用HISAT2軟件將Clean Reads參考紫花苜蓿基因組進行比對[27]。比對分析完成后利用String Tie軟件將比對上的Reads進行重新組裝和定量。根據(jù)重新組裝結(jié)果，通過以下數(shù)據(jù)庫對基因功能做進一步注釋分析，其中包括Nr(NCBI冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫)、Nt(NCBI冗余核苷酸序列數(shù)據(jù)庫)、Pfam(蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫)、KOG/COG (同源蛋白質(zhì)集群數(shù)據(jù)庫)、Swiss-Prot(手工注釋和審查蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫)、KO(全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫)和GO(基因本體數(shù)據(jù)庫)。

1.7 差異表達基因

在轉(zhuǎn)錄組分析中，本研究從階段間比較的角度橫向分析苜蓿對冷適應(yīng)過程的響應(yīng)，從階段內(nèi)比較的角度縱向分析2品種苜蓿響應(yīng)冷適應(yīng)低溫的差異性。其中，階段間比較包括ZD2 vs ZD1和WL2 vs WL1對比組，階段內(nèi)比較包括ZD1 vs WL1和ZD2 vs WL2對比組。其中，各樣品對比組差異表達基因的篩選方法如下：使用Bowite 2軟件將Clean Reads與組裝序列進行比對，將比對上的Reads進行計數(shù)，并使用RSEM方法估計豐度，以獲得FPKM、TPM和預(yù)期計數(shù)；基于負二項分布模型，用DESeq 2軟件鑒別樣本間的差異表達基因。為控制錯誤發(fā)現(xiàn)率，對得到的P值用Benjamini和Hochberg方法進行調(diào)整。當調(diào)整后的P<0.01時，DESeq 2軟件便將此基因選定為差異表達基因。隨后，在對差異表達基因進行KEGG通路分析時，根據(jù)某生物通路富集差異基因的數(shù)目進行排序，以此評價各生物通路在試驗中的活躍程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗寒性

圖2為冷適應(yīng)前后2品種苜蓿LT50的大小，LT50越低，抗寒性越強。與S1點相比，經(jīng)過冷適應(yīng)處理后，在S2點WL和ZD的抗寒性均顯著提高(P<0.05)，其中ZD抗寒性提高的程度較大。冷適應(yīng)結(jié)束后，WL的LT50達到-15.72℃，而ZD的LT50達到-24.70℃。冷適應(yīng)結(jié)束后，ZD的抗寒性顯著高于WL(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序

根據(jù)樣本間的相關(guān)性熱圖3判斷，WL1，WL2，ZD1和ZD2四組樣品內(nèi)的生物學重復(fù)的重復(fù)性均較好。在WL2組內(nèi)的生物學重復(fù)中，只有WL2_1與另外2樣品的重復(fù)略差，但相關(guān)性系數(shù)仍達到0.70。本研究完成了12個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得38.2 Gb Clean Data，其中各樣品Clean Data中Q30堿基百分比≥93%。各組樣品Clean Reads與參考基因組進行序列比對，比對效率為90.75%～94.08%。基于比對結(jié)果，進行基因表達量分析，最終根據(jù)基因在不同樣品中的表達量識別篩選差異表達基因，并進一步進行KEGG富集分析。

圖2 冷適應(yīng)處理前后苜蓿的低溫半致死溫度Fig.2 Semilethal temperature of alfalfa before and after cold acclimation注：“*”表示同一時間不同品種間差異顯著(P<0.05)，“ns”表示品種間無顯著差異Note:“*” means significant difference between two alfalfa at the same time point at the 0.05 level,and “ns” means no significant difference between two alfalfa

2.3 同一苜蓿品種不同時間點間轉(zhuǎn)錄表達的對比分析

根據(jù)本研究基因差異表達熱圖結(jié)果判斷，ZD2 vs ZD1和WL2 vs WL1的基因表達可以被明顯分開。經(jīng)過冷適應(yīng)處理后，ZD2 vs ZD1中的差異基因數(shù)共有26 986個，包含14 699個上調(diào)基因和12 287個下調(diào)基因；WL2 vs WL1中的差異基因數(shù)共有25 018個，包含13 123個上調(diào)基因和11 895個下調(diào)基因。在冷適應(yīng)過程中，ZD和WL共同上調(diào)的基因有9 416個，共同下調(diào)的基因有7 890個(圖4)。此外，在ZD中為上調(diào)基因而在WL中卻為下調(diào)的基因有12個；在ZD中為下調(diào)基因而在WL中為上調(diào)的基因共有13個。

在ZD2 vs ZD1和WL2 vs WL1對比組中，借助KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異基因參與的生物通路。圖5展示了富集差異基因數(shù)目最多的前30條生物通路，即冷適應(yīng)過程中2品種苜蓿體內(nèi)較活躍的通路。經(jīng)對比，2品種苜蓿體內(nèi)活躍度排名前30的生物通路名稱及排序無明顯差別，且這些生物通路均涉及到“細胞的信號轉(zhuǎn)導”和“物質(zhì)代謝(包括糖、蛋白質(zhì)、脂、氨基酸、脂肪酸)”等過程。這些生物通路與苜蓿響應(yīng)冷適應(yīng)過程中的低溫環(huán)境有關(guān)，如植物激素信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、植物MAPK信號通路、糖酵解和糖異生、甘油磷脂代謝、甘油脂代謝和泛素介導的蛋白質(zhì)水解作用等過程。

圖3 試驗樣本之間的相關(guān)性熱圖Fig.3 Heat map of correlation between experimental samples

圖4 階段間比較中差異基因韋恩圖Fig.4 Venn diagrams of differentially expressed genes in comparisons within phases

2.4 同一時間點不同苜蓿品種間轉(zhuǎn)錄表達的對比分析

根據(jù)本研究基因差異表達熱圖結(jié)果判斷，ZD1 vs WL1和ZD2 vs WL2的基因表達可以被明顯分開。據(jù)圖6分析，冷適應(yīng)處理前，ZD1 vs WL1中共篩選差異基因1 490個，包含 635個上調(diào)基因和855個下調(diào)基因。冷適應(yīng)處理后，ZD2 vs WL2中共篩選差異基因1 968個，包含946個上調(diào)基因和1 022個下調(diào)基因。其中，ZD2 vs WL2與ZD1 vs WL1共有99個相同的上調(diào)基因和154個相同的下調(diào)基因。此外，在ZD2 vs WL2樣品對比組中為下調(diào)基因，而在ZD1 vs WL1中為上調(diào)基因的數(shù)量只有1個(MS.gene26754，GO:0016758 transferase activity,transferring hexosyl groups)。

本研究在同一試驗階段內(nèi)進行了差異基因的篩選，進一步又對這些差異基因進行了KEGG富集分析。根據(jù)KEGG分析后所富集的差異基因數(shù)目，對富集的生物通路進行了排序。圖7展示了與ZD1 vs WL1相比，在ZD2 vs WL2中活躍度排序位次有所提高的生物通路。冷適應(yīng)處理前后，在ZD1 vs WL1和ZD2 vs WL2中差異表達基因的變化，從而導致圖7中統(tǒng)計的生物通路在2品種苜蓿中的活躍度有所改變，這些活躍度提高的生物通路，可能是導致冷適應(yīng)后2品種苜?？购援a(chǎn)生差異的原因。

圖5 階段間比較中差異基因數(shù)最多的30條生物通路Fig.5 The 30 metabolic pathways with the largest number of differentially expressed genes in comparison between phases

圖6 階段內(nèi)比較中差異基因韋恩圖Fig.6 Venn diagrams of differentially expressed genes in comparison within phases注：位次變化=在ZD2 vs WL2比較中的位次-在ZD1 vs WL1比較中的位次。此圖只統(tǒng)計了位次有所提高的生物通路，數(shù)字表示位次上升的級數(shù)Note:Rank change = Rank in ZD2 vs WL2-Rank in ZD1 vs WL1. This figure only counts the biological pathways that the rank increased,and the numbers indicate the progression of rank

3 討論

本研究在冷適應(yīng)前后，分別對比了‘肇東’和‘WL440HQ’2品種苜蓿的抗寒性，結(jié)果表明經(jīng)過冷適應(yīng)處理后，2品種苜蓿抗寒性均有顯著性提高，但提高的程度有所不同，冷適應(yīng)處理后品種間抗寒性存在顯著性差異。為了解冷適應(yīng)過程溫度變化對苜蓿代謝的影響，本研究分別對同一品種苜蓿冷適應(yīng)前后進行了轉(zhuǎn)錄表達分析，篩選2品種苜蓿在冷適應(yīng)前后的差異表達基因，并進一步進行KEGG分析。結(jié)果如圖5所示，對于‘肇東’和‘WL440HQ’而言，冷適應(yīng)處理前后差異表達基因所參與的通路并無明顯差異，這些通路涉及“細胞的信號轉(zhuǎn)導”和“物質(zhì)代謝(包括糖、蛋白質(zhì)、脂、氨基酸、脂肪酸)”等過程。此外，配合試驗處理過程分析，這些通路不僅是苜蓿對冷適應(yīng)低溫環(huán)境的響應(yīng)，還可能與苜?？购缘奶岣哂嘘P(guān)，具體包括植物激素信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、植物MAPK信號通路、糖酵解和糖質(zhì)新生、甘油磷脂代謝、甘油脂代謝和泛素介導的蛋白質(zhì)水解作用等。

圖7 與ZD1 vs WL1相比，在ZD2 vs WL2中活躍度排序位次提高的生物通路Fig.7 Metabolic pathways with increased activity rank in ZD2 vs WL2 compared to ZD1 vs WL1

在本研究中，植物激素信號轉(zhuǎn)導參與了苜蓿對冷適應(yīng)低溫環(huán)境的響應(yīng)。有研究表明，植物激素信號介導非生物脅迫響應(yīng)存在多種機制，包括ABA、水楊酸、生長素、乙烯和茉莉酸[29]。激素作為信號分子，在調(diào)節(jié)基因表達中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如ABA是一種苜蓿體內(nèi)重要的應(yīng)激激素，它能是苜蓿對寒冷及冰凍脅迫做出響應(yīng)，可能與ABA依賴通路中PP2C基因的表達有關(guān)[30]。

本研究中，2品種苜蓿冷適應(yīng)前后部分差異表達基因均顯著富集于泛素介導的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)(見圖5)，是苜蓿對低溫響應(yīng)的代謝通路之一。泛素介導的蛋白質(zhì)水解作用參與許多生物學過程，包括植物的生長以及對新環(huán)境條件的適應(yīng)[31]。3種酶參與靶蛋白的泛素化，可解決環(huán)境脅迫導致的蛋白質(zhì)異常積累，包括E1泛素激活酶、E2泛素綴合酶和E3泛素連接酶[32]。E3連接酶是決定靶蛋白特異性的關(guān)鍵酶，據(jù)其基序可分為不同的家族，與E6-AP羧基端、Ring/U-box和后期酶促復(fù)合體、Skp1-Cullin-F-box復(fù)合體同源。F-box蛋白是Skp1-Cullin-F-box復(fù)合體的亞基，參與逆境響應(yīng)，可由不同的環(huán)境脅迫條件而觸發(fā)，如低溫、干旱或鹽堿脅迫[33-35]。近年來，在植物中發(fā)現(xiàn)了許多涉及激素信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞周期轉(zhuǎn)換的F-box蛋白[36-38]，通過過表達F-box蛋白可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗氧化能力和抗旱能力[39]。在苜蓿對低溫脅迫響應(yīng)的研究中，學者們也發(fā)現(xiàn)了冷凍處理可誘導F-box蛋白的表達，在低溫脅迫中發(fā)揮重要作用[30]。據(jù)前人的研究基礎(chǔ)及本研究結(jié)果判斷，泛素介導的蛋白水解可能是調(diào)控苜?？购缘闹匾緩街?。

在本研究中，2品種苜蓿在冷適應(yīng)處理前后，部分差異表達基因均可顯著富集于淀粉和蔗糖代謝通路?？扇苄蕴强商岣呒毎麧B透壓、減少胞間水分含量、降低胞間冰形成的數(shù)量[40]，還可降低胞液的冰點[41]，是植物應(yīng)對低溫脅迫的重要響應(yīng)。即使在結(jié)冰脫水的情況下，可溶性糖仍可以保護細胞的結(jié)構(gòu)[42]和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[40]。有學者認為蔗糖是苜蓿應(yīng)對低溫脅迫的重要響應(yīng)，甚至將其含量用來評估品種的抗寒性[43]；但也有學者認為棉子糖和水蘇糖才是保護苜蓿不受凍害最有效的糖類物質(zhì)[44]。也有研究表明，一分子的蔗糖與一分子的肌醇半乳糖苷結(jié)合，在棉子糖合成酶的作用下可生成一分子的棉子糖。棉子糖在水蘇糖合成酶的作用下，再結(jié)合一分子的肌醇半乳糖苷有可生成一分子的水蘇糖。因此，蔗糖分子可稱為棉子糖和水蘇糖合成的原料[45]，而蔗糖又可通過淀粉水解得到[46]。由此可見，淀粉和蔗糖的代謝通路是苜蓿對低溫環(huán)境的重要響應(yīng)。

感知低溫信號，調(diào)控冷誘導基因的表達，是植物應(yīng)對低溫脅迫的重要路徑，MAP級聯(lián)反應(yīng)就是其中一種重要的感知低溫信號和調(diào)控基因表達的途徑。低溫脅迫引起細胞Ca2+濃度變化，從而激活鈣調(diào)蛋白受體激酶CRLK1/2，引起MAPK級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導冷調(diào)節(jié)基因COR表達量的變化[47]。冷調(diào)節(jié)基因的表達，進一步調(diào)控細胞生理生化過程以應(yīng)對脅迫環(huán)境。在植物冷適應(yīng)過程中，細胞膜組分的變化，可提高細胞膜流動性從而提高植物的抗寒能力[48]。SFR2是一種對擬南芥耐凍性至關(guān)重要的基因，它可編碼葉綠體外膜的半乳糖脂質(zhì)重塑酶，通過一系列加工轉(zhuǎn)移過程改變膜的組分，最終起到穩(wěn)定細胞膜的作用[49]。在本研究中，冷適應(yīng)前后差異表達基因涉及甘油磷脂代謝和甘油脂代謝，二者為細胞膜重要組分，2代謝過程可能與冷適應(yīng)過程溫度環(huán)境的降低以及苜?？购缘奶岣哂嘘P(guān)。

為進一步了解2品種苜蓿對冷適應(yīng)低溫環(huán)境響應(yīng)的差異，本研究在冷適應(yīng)前后的2時間點分別進行了品種之間轉(zhuǎn)錄表達的對比分析，篩選出2苜蓿品種之間在冷適應(yīng)前后的差異表達基因，并進一步進行生物通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與冷適應(yīng)處理前相比，冷適應(yīng)處理后共有66條生物通路的活躍程度有所提高(見圖7)。其中，這些通路主要涉及代謝，包括脂肪酸、氨基酸、脂質(zhì)、聚糖、萜類和多酮類化合物等物質(zhì)的代謝和能量代謝。在以往的研究中，已表明脂肪酸[48]、氨基酸[44]、脂質(zhì)[50]、聚糖[51]、萜類和多酮類化合物[52]等物質(zhì)對苜?？购缘姆e極影響，同樣也有研究表明了能量代謝與植物抗寒性的關(guān)系[53]。因此，冷適應(yīng)處理后2品種苜蓿抗寒性的差異受多種代謝通路共同影響，特別是活躍度變化比較明顯的氨基酸、脂肪酸類物質(zhì)的代謝。對于這些代謝可進一步開展更深入的研究，如對代謝通路所涉及的基因模塊及基因的功能的研究。

4 結(jié)論

經(jīng)過冷適應(yīng)處理，‘肇東’和‘WL440HQ’苜蓿的抗寒性均有所增強，‘肇東’苜蓿提高的幅度較大?！凹毎男盘栟D(zhuǎn)導”和“物質(zhì)代謝(包括糖、蛋白質(zhì)、脂、氨基酸和脂肪酸)”等相關(guān)生物通路，不僅是苜蓿對冷適應(yīng)降溫環(huán)境的響應(yīng)，還可能與此過程中苜?？购缘奶岣哂嘘P(guān)，具體包括植物激素信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、植物MAPK信號通路、糖酵解和糖質(zhì)新生、甘油磷脂代謝、甘油脂代謝和泛素介導的蛋白質(zhì)水解作用等。造成冷適應(yīng)處理后2品種苜蓿抗寒性出現(xiàn)差異是多種生物通路共同作用的結(jié)果，主要涉及“物質(zhì)代謝(包括脂肪酸、氨基酸、脂質(zhì)、聚糖、萜類和多酮類化合物等)”和“能量代謝”等相關(guān)生物通路，特別是脂肪酸和氨基酸類物質(zhì)的代謝。