陳雅坤， 劉 佳， 王思偉， 孟憲華， 王 昆， 張建勇， 楊麗萍， 沈旖帆， 趙連生

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心，北京 102200；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050035；4.河北省畜牧總站，河北石家莊 050035；5.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站，寧夏銀川 750004；6.云南省飼草飼料工作站，云南昆明 650225）

燕麥草具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值好、耐干旱、耐嚴寒等特性， 成為目前我國廣泛推廣的禾本科飼草（侯龍魚等，2019）。但由于我國的燕麥草人工草地栽培體系不夠成熟，燕麥草的質(zhì)量參差不齊（解津剛等，2022；侯龍魚等，2019）。 熊乙等（2018）研究了山西、 甘肅和澳洲等3 個產(chǎn)地的燕麥草營養(yǎng)價值發(fā)現(xiàn)， 不同產(chǎn)地燕麥草營養(yǎng)成分存在明顯差異， 澳洲燕麥草中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維較低，山西和甘肅燕麥草粗蛋白質(zhì)含量較高。劉文婷等（2019）通過在全國燕麥主產(chǎn)區(qū)的11 個省研究環(huán)境因素和品質(zhì)性質(zhì)之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)， 蛋白質(zhì)含量與經(jīng)緯度呈顯著正相關(guān)， 淀粉和脂肪含量與經(jīng)緯度呈負相關(guān)。

粗飼料分級指數(shù)（GI）是盧德勛結(jié)合我國飼草現(xiàn)狀提出的飼草品質(zhì)評價方法（紅敏等，2011）。紅敏等（2011）對GI 模型進行驗證、對比發(fā)現(xiàn)，GI 與飼料相對價值（RFV）分級的準確性和順序性較為一致，GI 能準確而科學(xué)地對粗飼料品質(zhì)進行分級劃分。 王艷菲等（2013）報道，GI 在評價飼草品質(zhì)、篩選和優(yōu)化飼草組合、 指導(dǎo)飼草科學(xué)種植等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

燕麥草為反芻動物日糧中重要的粗飼料來源之一（解津剛等，2022）。 因此，掌握其在瘤胃消化吸收規(guī)律、 瘤胃微生物組成對提升其降解率具有重要作用。 Henderson 等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，宿主和飼料是影響瘤胃微生物較大的因素， 其中飼料占主導(dǎo)地位。 Maga 等（2013）同樣發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的大部分變異可歸因于飼料的差異。本試驗以成熟期燕麥干草作為研究對象，通過研究不同分級指數(shù)燕麥干草對奶牛營養(yǎng)物質(zhì)降解率、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物組成的影響，了解其在瘤胃的降解規(guī)律， 為其在奶牛飼料配方中科學(xué)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2022 年1 月，分別在甘肅省定西市、 河北省張家口市和內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟采集成熟期收割打捆的燕麥干草。 樣品采集流程及方法參照《GB/T 14699-2005》（2005），每種飼草樣品采集300 g 左右。 將采集的飼料65 ℃烘至恒重，回潮4 h 后粉碎，過40 目篩制成風(fēng)干樣品。參照《飼料分析與檢驗》（王加啟和于建國，2004）進行常規(guī)營養(yǎng)成分測定。 參照《GB/T 23387-飼草營養(yǎng)品質(zhì)評定GI 法》（2009）進行質(zhì)量分級。 具體營養(yǎng)成分見表1。

1.2 試驗設(shè)計 采用單因素設(shè)計， 試驗分為3組，試驗1 組、試驗2 組和試驗3 組底物是GI 值分別為4.26、10.98、11.60 MJ/d 的燕麥干草， 其等級分別是五級、三級、三級，每組設(shè)置10 個重復(fù)，體外發(fā)酵24 h。

1.3 動物供體與瘤胃液采集 在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗基地選取3 頭健康且裝有永久性瘤胃瘺管的泌乳期奶牛作為試驗供體牛。 奶牛每天飼喂和擠奶2 次（07:00 和18:00），自由采食和飲水。 于晨飼后2 h 通過瘤胃瘺管采集3 頭牛瘤胃液，混合后裝入39 ℃預(yù)熱處理的保溫瓶中，密封后帶回實驗室，使用滅菌后的4層紗布過濾，同時通入CO2，整個過程于39 ℃水浴鍋中進行。

1.4 體外發(fā)酵 參照Menke 等（1988）的方法配制緩沖液，將配制好的緩沖液持續(xù)通入CO2，使緩沖液由藍色變?yōu)榉奂t色， 最后為無色， 并預(yù)熱至39 ℃，備用。 準確稱取0.5 g 飼料置于150 mL 厭氧發(fā)酵瓶中，接種前將發(fā)酵瓶預(yù)熱39 ℃。 使用分裝器迅速向每個發(fā)酵瓶中加入50 mL 緩沖液和25 mL 瘤胃液，并向每個瓶中通入CO25 s 后，立即用瓶塞密封，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWT211，上海智城分析儀器制作公司）中，體外連續(xù)發(fā)酵24 h。

1.5 樣品采集及前處理 在體外連續(xù)發(fā)酵24 h后，迅速將發(fā)酵瓶放入冰水浴中終止發(fā)酵，經(jīng)尼龍袋過濾后，立即測定發(fā)酵液的pH，然后將一部分發(fā)酵液分裝后于-20 ℃冰箱冷凍保存， 用于氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定，另一部分取2 mL 發(fā)酵液放入液氮中速凍， 置于-80 ℃冰箱保存，用于微生物分析。將裝有發(fā)酵殘渣的尼龍袋清洗干凈后，放入65 ℃烘箱中烘至恒重，用于干物質(zhì)降解率（DMD）、粗蛋白質(zhì)降解率（CPD）和中性洗滌纖維降解率（NDFD）的測定。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 營養(yǎng)物質(zhì)降解率測定 干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌纖維（NDF）測定參照《飼料分析與檢驗》（王加啟和于建國，2004）中的方法進行，其中，CP 采用全自動凱氏定氮儀（K1100，山東海能科學(xué)儀器有限公司） 測定，NDF 采用全自動纖維分析儀 （Ankom A2000i Fiber Analyzer，美國ANKOM 公司）測定。 飼料中營養(yǎng)物質(zhì)降解率計算公式如下：

降解率/%=[樣品中營養(yǎng)物質(zhì)含量（g）-降解后殘渣中營養(yǎng)物質(zhì)含量 （g）]/樣品中營養(yǎng)物質(zhì)含量（g）×100。

1.6.2 發(fā)酵指標測定 發(fā)酵液中pH 采用SartoriusPB-10 型pH 計測定；氨態(tài)氮（NH3-N）采用靛酚比色法（2011）測定；VFA 濃度利用氣相色譜儀（Agilent 6890N GC system，Agilent）以外標法測定（王芳等，2016），色譜條件如下：以氮氣為載氣，色譜柱DB-FFAP （30 m×0.25 mm×0.25 μm）， 柱溫70 ℃，3 ℃/min 至125 ℃，再以30 ℃/min 至125 ℃，保持5 min， 進樣口溫度250 ℃， 檢測器溫度280 ℃，恒壓25 kPa，分流比1：20，進樣量20 μL。

1.6.3 瘤胃微生物組成測定 先用E.Z.N.A.Rsoil DNA kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）進行總DNA 抽提， 再用NanoDrop2000 測定DNA 濃度 和 純 度； 使 用 引 物338F （5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對16S rRNA 基 因V3 ～V4 可變區(qū)進行PCR擴增， 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 回收產(chǎn)物純化，用QuantusTMFluorometer （Promega，USA） 對回收產(chǎn)物進行檢測定量。 利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序 （上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.7 數(shù)據(jù)處理 對微生物測序結(jié)果先用fastp（Chen 等，2018）軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，再用FLASH（Magoc∨等，2011）軟件進行拼接，然后使用UPARSE（Edgar 等，2013）軟件，根據(jù)97%（ Edgar等，2013） 的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體，最后利用RDP classifier（Wang，2007）對每條序列進行物種分類注釋， 對比Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（v138）。 對營養(yǎng)指標、發(fā)酵指標和菌群相對豐度運用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 17.0 軟件中單因素方差進行分析， 采用Duncan’s 法進行多重比較，0.05≤P< 0.10 表示有顯著趨勢，P< 0.05 表示差異顯著，P< 0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分級指數(shù)燕麥干草對體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響 由表2 可知， 體外發(fā)酵24 h 時，試驗2 組和試驗3 組的DMD、CPD 和NDFD 極顯著高于試驗1 組（P＜0.01），DMD 比試驗1 組分別高50.95%和55.37%，CPD 比試驗1 組分別高26.12%和94.32%，NDFD 比試驗1 組分別高54.41%和50.47%。 其中試驗2 組和試驗3 組的DMD 和NDFD 差異不顯著（P＞0.05），而試驗3 組CPD 顯著高于試驗2 組（P＜0.01）?？偟膩碚f，試驗2 組和試驗3 組營養(yǎng)物質(zhì)降解率明顯高于試驗1 組。

2.2 不同分級指數(shù)燕麥干草對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表3 可知，在發(fā)酵24 h，各試驗組中pH、異丁酸、異戊酸差異不顯著（P＞0.05），而氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、TVFA 和乙酸/丙酸差異顯著（P＜0.05），且試驗2 組和試驗3 組氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 顯著高于試驗1 組（P＜0.05），除戊酸外，試驗2 組和試驗3 組之間差異不顯著（P＞0.05），其中試驗2 組和試驗3 組氨態(tài)氮比試驗1 組分別高10.85%和16.63%，乙酸比試驗1 組分別高12.41%和10.39%， 丙酸比試驗1組分別高19.45%和12.05%，TVFA 比試驗1 組分別高13.39%和11.05%。 總的來說，試驗2 組和試驗3 組瘤胃發(fā)酵參數(shù)明顯好于試驗1 組。

表3 不同分級指數(shù)燕麥干草對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 不同分級指數(shù)燕麥干草對瘤胃菌群數(shù)量的影響

2.3.1 瘤胃微生物群落操作分類單元（OTU）聚類和Alpha 多樣性分析 本試驗從12 個瘤胃液樣品中獲得307332 條有效序列， 在3%的距離上，12 個樣本共獲得1981 個OTU， 平均每個樣本有1235.42 個OTU， 所有樣本共有的OTU 數(shù)目為618 個。 由表4 可知， 樣本的覆蓋率達到99%以上， 說明測序深度足夠。 其中，3 組OTU 數(shù)目、Shannon 指 數(shù)、Simpson 指 數(shù)、ACE 指 數(shù) 和Chaol指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

表4 燕麥干草體外發(fā)酵瘤胃微生物OTU 數(shù)目和Alpha 多樣性指數(shù)分析

2.3.2 瘤胃微生物群落物種組成分析

2.3.2.1 門水平 本試驗共獲得19 個細菌門分類物種， 燕麥干草各組體外發(fā)酵瘤胃微生物優(yōu)勢菌門相同。 其中， 各組最優(yōu)勢菌群由擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）組成，兩者占整個菌群89%以上，次級優(yōu)勢菌群是疣微菌門（Verrucomicrobiota）、纖維桿菌門（Fibrobacterota）、螺旋菌門（Spirochaetota）、變形菌門（Proteobacteria），其余相對豐度低于1%的門類被聚集到一起，試驗1 組、 試驗2 組和試驗3 組分別為2.54%、2.36%和2.52%。

由表5 可知， 試驗2 組和試驗3 組纖維桿菌門相對豐度低于試驗1 組， 比試驗1 組分別低51.36%（P＞0.05）和55.45%（P＜0.05）；其他菌門相對豐度差異不顯著， 但厚壁菌門相對豐度有顯著差異趨勢（P=0.07），從數(shù)值上看，試驗2 組和試驗3 組要優(yōu)于試驗1 組。

表5 不同分級指數(shù)燕麥干草對體外發(fā)酵瘤胃微生物優(yōu)勢菌門水平（相對豐度＞1%）的影響%

2.3.2.2 屬水平 本試驗共獲得253 個細菌屬分類物種， 其中最優(yōu)勢菌屬是普雷沃氏菌屬（Pre-votella） 和 理 研 菌 科RC9 腸 道 群（Rikenellaceae_RC9_gut_group ），兩者均超過15%；次級優(yōu)勢菌屬15 個， 分別是未知屬F082 菌群（norank_f_F082）、 未知屬擬桿菌目RF16 菌群（norank_f_Bacteroidales_RF16_group）、 琥 珀 酸 菌 屬（Succiniclasticum）、 克里斯滕森菌科R-7 菌群（Christensenellaceae_R-7_group）、 普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、未分類理研菌 科（Unclassified_f_Rikenellaceae）、未 知 屬 未 知目WCHB1-41 菌群（Norank_f_norank_o_WCHB1-41）、瘤胃球菌科的特定菌屬（NK4A214_group ）、未知屬UCG-011（Norank_f_UCG-011）、纖維桿菌屬（Fibrobacter）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG -001）、 鱗 球 菌 屬 （Sphaerochaeta）、未知屬絨毛桿菌科（Norank_f__Muribaculaceae）、 未知屬-擬桿菌屬UCG-001（norank_f_Bacteroidales_UCG-001）、 毛 螺 菌 科-NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_ group）， 其相對豐度均低于10%； 其余相對豐度低于1%的菌屬被聚集到一起，試驗1 組、試驗2 組和試驗3 組分別為19.64%、21.05%和20.99%。

由表6 可知，優(yōu)勢菌屬中，試驗3 組中未分類理研菌科、 未知屬-絨毛桿菌科相對豐度顯著高于試驗1 組和試驗2 組（P＜0.05），試驗2 組和試驗3 組纖維桿菌屬顯著低于試驗1 組（P＜0.05），比試驗1 組分別低51.36%和55.45%； 其他優(yōu)勢菌屬相對豐度差異不顯著（P＞0.05）。

表6 不同分級指數(shù)燕麥干草對體外發(fā)酵瘤胃微生物優(yōu)勢菌屬水平（相對豐度＞1%）的影響%

3 討論

3.1 不同分級指數(shù)燕麥干草對體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響 營養(yǎng)物質(zhì)降解率是評定飼料營養(yǎng)價值的關(guān)鍵指標。 DMD 是影響奶牛采食量（DMI）的關(guān)鍵因素之一，其代表了被瘤胃微生物利用的能力，DMD 越高， 瘤胃發(fā)酵效果就越好，奶牛DMI 就越高，攝入的CP 和能量也就會越多（Lunsin 等，2021；宮福臣等，2013）。在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組燕麥干草DMD 顯著高于試驗1 組， 這說明不同分級指數(shù)燕麥干草營養(yǎng)價值具有明顯的差異， 這可能與試驗1 組的燕麥干草的蛋白含量低， 中性性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量高有關(guān)（陳曉琳等，2014），營養(yǎng)物質(zhì)含量的差異主要來源于地理環(huán)境、品種、收獲時間和加工貯存方式等因素（王吉東等，2022）。

飼料CP 為微生物蛋白合成和瘤胃微生物的生長提供重要的氮源（李小娜等，2012），在本試驗中， 試驗3 組和試驗2 組的CPD 顯著高于試驗1 組， 這可能是由于試驗1 組燕麥干草中CP 含量低，可消化性碳水化合物少，在體外發(fā)酵過程微生物蛋白質(zhì)合成受到限制，CPD 較低（王吉東等，2022）。

飼料中纖維物質(zhì)有利于奶牛的瘤胃發(fā)酵，對于維持奶牛瘤胃的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用，因此，奶牛瘤胃中NDFD 是評價燕麥干草營養(yǎng)價值的重要指標， 其值大小反映了纖維物質(zhì)在瘤胃消化的難易程度 （李勝利等，2014；Oba 等，2006）。在試驗相同的條件下， 提高NDFD 對提高奶牛飼料干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量具有顯著的作用，NDF 主要是由纖維素、 半纖維素和木質(zhì)素等組成，其中半纖維素部分是主要可發(fā)酵的成分，而木質(zhì)素部分結(jié)構(gòu)獨特， 幾乎不會被瘤胃微生物所利用，因此，影響NDFD 主要因素是木質(zhì)素在NDF 中的比例（李小娜等，2012）。 在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組NDFD 燕麥干草顯著高于試驗1 組，這可能是由于GI 等級為五級的燕麥干草的木質(zhì)化程度較高造成的。 由此可見，相同GI 等級燕麥干草NDFD 差異不顯著， 不同等級燕麥干草NDFD 存在較大差異，GI 分級在實際日糧配方應(yīng)用過程中可以用作參考。

3.2 不同分級指數(shù)燕麥干草對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 pH 是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和發(fā)酵狀況的綜合指標， 也是瘤胃微生物正常生長繁殖和發(fā)揮功能的必要條件 （鄭宇慧等，2020）， 其值過高、過低對瘤胃發(fā)酵、微生物生長與功能均會產(chǎn)生不利影響（王芳等，2016）。 有研究報道，瘤胃液pH 正常范圍是5.5 ～7.5 （Calsamiglia 等，2022）。 在本試驗中， 各組發(fā)酵液pH 為6.90 ~6.97，均在正常范圍內(nèi)，這說明瘤胃緩沖液配制合理，達到了維持體外瘤胃環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用（鮑宇紅等，2021；杜超等，2020）。

NH3-N 是評價瘤胃發(fā)酵狀況的關(guān)鍵指標之一，是飼料蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解產(chǎn)物，也是合成瘤胃微生物蛋白的重要前提物質(zhì) （蔣辰宇等，2021）。 NH3-N 濃度能夠綜合反映對飼料蛋白質(zhì)的分解能力和瘤胃微生物對NH3-N 利用的平衡狀 態(tài) （García-gonzález 等，20210）， 瘤 胃 液 中NH3-N 濃度為6 ～30 mg/dL， 其中微生物生長最適范圍為6.30 ～27.50 mg/dL （Wanapat 等，1999）。 在本試驗中， 試驗2 組和試驗3 組的NH3-N 顯著高于試驗1 組，這可能是由于試驗2組和試驗3 組的蛋白含量高， 為瘤胃微生物提供較多的氮源， 使得瘤胃液中的NH3-N 濃度高于試驗1 組，這與本試驗中的粗蛋白質(zhì)降解規(guī)律一致。

VFA 是碳水化合物在瘤胃降解的主要產(chǎn)物，為瘤胃微生物的生長和增殖提供主要的碳架來源（張霞等，2019；Spears 等，2004），能為反芻動物提供60% ～80%的可消化能（王加啟，2011），其大小和組成比例變化可反映了瘤胃的發(fā)酵模式和發(fā)酵程度的變化。 乙酸是奶牛合成乳脂的主要前體物質(zhì)， 丙酸是合成葡萄糖的前體物質(zhì) （程景等，2021）。在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組的乙酸、丙酸和TVFA 含量明顯高于試驗1 組， 可能由于試驗2 組和試驗3 組燕麥干草可溶性碳水化合物較高， 發(fā)酵過程中能釋放充足的能量供瘤胃微生物利用，從而促進了瘤胃發(fā)酵，產(chǎn)生的VFA 含量增多（張畢陽等，2018）。

3.3 不同分級指數(shù)燕麥干草對微生物組成的影響 日糧是影響微生物多樣性的關(guān)鍵因素之一，其中組成成分越復(fù)雜， 微生物多樣性就越高（Menezes 等，2011）。在本試驗中，各組中OTU 數(shù)目、Shannon 指 數(shù)、Simpson 指 數(shù)、ACE 指 數(shù) 和Chaol 指數(shù)均無顯著性差異，說明不同GI 值的燕麥干草對總細菌數(shù)量、 物種豐富度和瘤胃微生物多樣沒有明顯的影響。 在門水平，本試驗與前人結(jié)果類似（李嵐捷等，2017），擬桿菌門和厚壁菌門占主導(dǎo)地位， 且試驗3 組和試驗2 組厚壁菌門比試驗1 組有顯著增加的趨勢， 可能是由于厚壁菌門中含有大量分解飼料中纖維的菌屬， 能夠分解纖維類物質(zhì)供機體利用 （李嵐捷等，2017）， 這也是造成NDFD 出現(xiàn)差異的主要原因。 在屬水平，普雷沃氏菌屬、理研菌屬琥和珀酸菌屬為奶牛瘤胃內(nèi)微生物優(yōu)勢菌屬（Petri等，2019），本研究結(jié)果與其類似，但各組差異不顯著。 在本研究中，試驗2 組和試驗3 組低豐度纖維桿菌屬顯著低于試驗1 組， 這可能與燕麥干草中纖維含量不同有關(guān)。 有研究表明 （魏園等，2018；Weimer 等，1990）， 當(dāng)飼料中纖維素含量增加時， 纖維分解菌相應(yīng)增加。 本試驗還發(fā)現(xiàn)，各組中低豐度未分類理研菌科、未知屬-絨毛桿菌科存在顯著差異， 很可能具有某種重要功能，建議對該菌功能進一步挖掘分析，探索該菌是否有助于奶牛瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)的降解。

4 結(jié)論

在本試驗條件下， 相同GI 等級燕麥干草營養(yǎng)物質(zhì)降解率和瘤胃發(fā)酵特性沒有顯著差異，但不同GI 等級燕麥干草差異顯著，且隨著GI 等級越高，其瘤胃降解特性越好，營養(yǎng)價值越高。不同分級指數(shù)燕麥干草對瘤胃微生物組成沒有顯著影響，但對纖維分解菌、低豐度未分類理研菌科、未知屬-絨毛桿菌科相對豐度具有顯著的影響。