張 艷, 劉雪松, 薛沾枚, 郝敬友, 蘇 景, 史同瑞
(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江齊齊哈爾 161005;2.哈爾濱綠達(dá)生動(dòng)物藥業(yè)有限公司,黑龍江哈爾濱 150039;3.黑龍江省動(dòng)物疫病控制中心,黑龍江哈爾濱 150069)
為提高中草藥藥效,充分發(fā)揮其防治疾病的作用, 需要采用不同的方法對(duì)中草藥材進(jìn)行炮制處理。 提取是中草藥炮制加工較為常用的方法,通過(guò)將中草藥中的有效活性成分提取出來(lái),不僅能夠提高療效、方便臨床用藥,而且還可以降低大量使用中草藥而引起的毒副作用。中草藥的傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法等,這些方法雖然操作簡(jiǎn)單,但存在提取率低,容易破壞中草藥中的有效成分,降低藥物療效等弊端(魏曉楠和郝鐵成,2020)。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,又研發(fā)了超臨界流體萃取法、微波輔助萃取法、超聲波提取法、酶工程提取法、半仿生提取法、超高壓提取法等一些新興的提取方法,并運(yùn)用在中草藥的提取生產(chǎn)中(薛峰等,2020;魏遠(yuǎn)等,2019;顏秀英,2018)。
中草藥酶提取方法是基于生物酶解作用能夠降解中草藥的植物細(xì)胞壁, 從而使胞內(nèi)的活性成分游離至介質(zhì)中, 達(dá)到中草藥活性成分高效提取的效果。生物酶中草藥提取技術(shù)具有提取率高、無(wú)需特殊設(shè)備、成本低廉、安全綠色等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 應(yīng)用高產(chǎn)酶微生物發(fā)酵中草藥的酶提技術(shù), 是現(xiàn)今中草藥酶提領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 試驗(yàn)從板藍(lán)根樣品中分離篩選出1 株貝萊斯芽孢桿菌, 并測(cè)定了分離菌的生物學(xué)特性和產(chǎn)纖維素酶特性, 為其用于板藍(lán)根的生物發(fā)酵提供理論依據(jù)。
1.1 試劑與藥品 細(xì)菌總DNA 提取試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;板藍(lán)根,購(gòu)自購(gòu)自河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司;生化反應(yīng)管和藥敏紙片,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;16S rRNA 引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 試驗(yàn)所用其他常規(guī)試劑均為分析純。
1.2 培養(yǎng)基 板藍(lán)根瓊脂:板藍(lán)根粉100 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,牛肉湯1000 mL,pH 7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉10 g,葡萄糖10 g,蛋白陳10 g,NaCl 5 g,KH2PO41 g, 蒸餾水1000 mL,pH 7.2;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯和纖維素剛果紅培養(yǎng)基,購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。
1.3 試驗(yàn)儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 (型號(hào):DH4000II)、超凈工作臺(tái)(CJ-2S),購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司生;恒溫培養(yǎng)搖床(型號(hào):SPH-2102C),購(gòu)自上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;立式壓力滅菌器(型號(hào):LDZX-75KBS),購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠;PCR 儀, 購(gòu)自日本TaKaRa 公司;高速多功能中草藥粉碎機(jī)(DFY-500),購(gòu)自溫嶺市林大機(jī)械有限公司;PH 計(jì)(FE20),購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.4 菌株分離與篩選 取新鮮板藍(lán)根用水將表面沖洗干凈, 再用無(wú)菌水浸泡2 ~3 h, 然后用75%乙醇漂洗30 s,無(wú)菌水漂洗1 min,2%次氯酸鈉漂洗1 min,75%乙醇漂洗30 s,無(wú)菌水漂洗1 min,重復(fù)進(jìn)行4 次; 取100 μL 最終清洗板藍(lán)根的水涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂,30 ℃培養(yǎng)2 d, 觀察有無(wú)菌落的生長(zhǎng), 確認(rèn)是否徹底消毒(高沙爾·卡依爾哈力等,2021)。 板藍(lán)根樣品干燥處理后剪碎,研磨,取0.1 g接種5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯,30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)16 ~18 h。 取培養(yǎng)液接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,置30 ℃環(huán)境培養(yǎng)18 ~24 h,取不同形態(tài)菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化培養(yǎng)。 取純化菌接種板藍(lán)根瓊脂和點(diǎn)種纖維素剛果紅瓊脂, 篩選既能在板藍(lán)根瓊脂生長(zhǎng)又能在剛果紅培養(yǎng)基形成較大透明圈的細(xì)菌。 測(cè)量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C),計(jì)算H/C,初步對(duì)篩選菌的降解纖維素活力進(jìn)行評(píng)價(jià) (楊捷等,2012)。
1.5 篩選菌株的鑒定 應(yīng)用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA, 上游引物:5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'; 下游引物:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。 PCR 反應(yīng)體系: 總體積25 μL,其中Ex Taq 0.5 μL、10×Buffer 2.5 μL,模板1 μL,dNTPs 為0.5 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O補(bǔ)足25 μL。 擴(kuò)增條件:94 ℃4 min,94 ℃30 s,55 ℃40 s,72 ℃2 min,35 個(gè)循環(huán),72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取3 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè), 反應(yīng)產(chǎn)物送生工生物測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì),分析同源性,構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。
1.6 篩選菌株生物學(xué)特性試驗(yàn)
1.6.1 形態(tài)及生化試驗(yàn) 取在37 ℃環(huán)境培養(yǎng)16、24、48 h 和72 h 的菌株菌液,涂片,革蘭氏染色,鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。取篩選菌分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂,分別置37 ℃自然和5% CO2厭氧環(huán)境培養(yǎng),考察菌株對(duì)氧的需求。 取培養(yǎng)18 ~20 h的菌液接種生化反應(yīng)管,37 ℃培養(yǎng)觀察細(xì)菌生化反應(yīng)特性。
1.6.2 適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)定 取篩選菌于37 ℃環(huán)境130 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h 的培養(yǎng)液, 應(yīng)用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1.0×106cfu/mL,然后接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,分別置10、20、30、35、40、45、50、60、70 ℃環(huán)境130 r/min 振蕩培養(yǎng)。 分別在培養(yǎng)18、24 h 和42 h 取樣,以無(wú)菌肉湯作對(duì)照,測(cè)定各菌液的OD600值。以培養(yǎng)溫度(℃)為橫軸,OD600值為縱軸,繪制菌液含菌量曲線圖。 試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。
1.6.3 適宜生長(zhǎng)酸堿度測(cè)定 取菌液濃度為1.0×106cfu/mL 的菌液,分別接種pH 2、3、4、5、6、7、8、9 的營(yíng)養(yǎng)肉湯,37 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng)。 在培養(yǎng)至18、24 h 和42 h 取樣, 以無(wú)菌肉湯作對(duì)照,測(cè)定各菌液OD600值。 以pH 為橫軸,OD600為縱軸,繪制菌液含菌量曲線圖。 試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。
1.6.4 生長(zhǎng)曲線繪制 取菌液濃度為1.0×106cfu/mL 的菌液,接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,于37 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)。 在培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、30、36、42、48、56、68、80 h 和92 h 取樣,以無(wú)菌肉湯作對(duì)照,測(cè)定各菌液的OD600值。 以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫軸,OD600值為縱軸,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。 試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。
1.6.5 芽孢形成情況 取培養(yǎng)16、20、24、36、48、64、72 h 的菌液,分別用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10 倍倍比稀釋。分別取108、109和1010三個(gè)稀釋度的菌液0.1 mL,涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。 剩余稀釋菌液置80 ℃水浴作用10 ~15 min, 然后吸取0.1 mL 水浴后菌液,涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,計(jì)算芽孢形成率。
芽孢形成率/%=(形成芽孢的菌數(shù)/總菌數(shù))×100。
1.6.6 藥物敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用K-B 法測(cè)定分離菌株的藥物敏感性。 取篩選菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,37 ℃培養(yǎng)18 ~20 h,用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯調(diào)整菌液至0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度, 然后涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,待菌液被瓊脂吸收后粘貼藥敏片, 置37 ℃培養(yǎng)18 h,測(cè)量抑菌圈直徑(R)。 試驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.7 菌株產(chǎn)纖維素酶能力測(cè)定
1.7.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 參考賴國(guó)棟等(2021)的方法進(jìn)行試驗(yàn)。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:取葡萄糖在干燥箱中105 ℃烘干2 h 至恒重。 精確稱(chēng)取葡萄糖100 mg,加入100 mL 容量瓶中,用少量蒸餾水溶解后,定容至刻度,搖勻。 葡萄糖溶液濃度為1 mg/mL,于4 ℃保存冷藏,使用期2 ~3 d。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:取16 支具塞試管,依次編號(hào)0 ~7,并作平行試驗(yàn)。 分別取1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄 糖 溶 液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 和1.4 mL 依次加入各管中,然后再依次加入蒸餾水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL 和0.6 mL,混勻,使各管液量均為2.0 mL。然后各管分別加入DNS 試劑2 mL,混勻,置沸水浴中顯色5 min,立即取出,流水冷卻。 以0 號(hào)管作為參考調(diào)零, 測(cè)定各溶液OD490值。 以葡萄糖量(mg)為橫軸,以O(shè)D490值為縱軸,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.7.2 產(chǎn)纖維素酶活力測(cè)定 參考王琳等(1998)的方法, 取活化菌液以1%接菌量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)18 ~24 h,將發(fā)酵液離心,收集上清即為粗酶液,置4 ℃保存?zhèn)溆?。? 支刻度試管,分別加入3 倍稀釋的粗酶液1 mL, 將其中2 支試管沸水浴滅活20 min, 第3支試管于50 ℃水浴1 min。 然后3 支管中分別加入2 mL 已預(yù)熱至50 ℃的0.5% CMC-Na 緩沖液(pH 4.6),混勻,于50 ℃水浴30 min,結(jié)束后各管立即加入3 mL DNS 試劑,混勻,置沸水浴中顯色5 min 立即取出, 流水冷卻, 用蒸餾水定容至10 mL,以對(duì)照調(diào)零于490 nm 處測(cè)OD 值。 依據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出還原糖含量, 按照以下公式計(jì)算酶活力。 在上述試驗(yàn)條件下,以1 mL 酶液每分鐘水解纖維素生成1 μg 葡萄糖的量為1 個(gè)酶活力單位(U)。
式中:X為纖維素酶酶活力,U/mL;m為吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算的葡萄糖量,mg;n為酶液稀釋倍數(shù);V為酶液體積,mL;t 為時(shí)間,min;5.56 為
1 mg 葡萄糖的μmoL 數(shù)(1000/180=5.56)。
1.7.3 產(chǎn)纖維素酶活力曲線繪制 在篩選菌株發(fā)酵培養(yǎng)18 ~72 h 期間,每隔6 h 取樣1 次,按上述試驗(yàn)方法測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶酶活。 設(shè)3 個(gè)試驗(yàn)組和1 個(gè)對(duì)照組, 每組設(shè)3 個(gè)平行。 以時(shí)間(t)為橫軸,以纖維素酶活力(X)為縱軸繪制曲線,即得篩選菌的產(chǎn)酶曲線。
1.8 纖維素酶特性測(cè)定
1.8.1 熱穩(wěn)定性 取刻度試管8 支, 各管分別加入酶液3 mL,其中7 支為試驗(yàn)管,1 支為對(duì)照管,每組設(shè)3 個(gè)平行。 試驗(yàn)管分別置20、30、40、50、60、70、80 ℃環(huán)境,對(duì)照管置室溫,各管分別在各溫度條件下作用1 h,測(cè)定相對(duì)酶活力。
1.8.2 酸堿穩(wěn)定性 取刻度試管7 支, 各管分別加入粗酶液3 mL, 其中6 支為試驗(yàn)管,1 支為對(duì)照管。 調(diào)節(jié)各管粗酶液pH 至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,對(duì)照管不調(diào)節(jié),30 ℃作用1 h,各管用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液補(bǔ)足9 mL,測(cè)定相對(duì)酶活力。
2.1 產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌篩選 從分離菌株中篩選出1 株能在剛果紅瓊脂形成較大水解圈的細(xì)菌,篩選菌在剛果紅培養(yǎng)基形成的降解圈直徑為9.45 mm,菌落直徑為2.28 mm,菌株H/C 為4.15,說(shuō)明分離菌株降解纖維能力較強(qiáng)。
2.2 篩選菌株鑒定 篩選菌擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,目的片段大小約600 bp(圖1)。菌株測(cè)序結(jié)果顯示, 擴(kuò)增的序列長(zhǎng)度為574 bp,與貝萊斯芽孢桿菌PFY02 和TL4 的同源性達(dá)到100%,篩選菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌,與相似度高的典型菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 并命名為貝萊斯芽孢桿菌NKY1 株(圖2)。
圖1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果
圖2 菌株16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
2.3 篩選菌種的生物學(xué)特性
2.3.1 形態(tài)及生化試驗(yàn)特性 顯微鏡觀察篩選菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽(yáng)性、 粗大桿菌, 菌體兩端鈍圓,多為單在,菌株能夠形成芽孢,芽孢橢圓形,直徑小于菌體(圖3)。 菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖,不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水楊苷,水解七葉苷,吲哚、H2S、V-P 試驗(yàn)陽(yáng)性,M.R、尿素酶、枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性。
圖3 篩選菌的菌體形態(tài)(1000×)
2.3.2 適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)定 由圖4 可知, 在環(huán)境溫度10 ~40 ℃,隨著溫度的上升菌液的OD 值逐漸增大,至35 ℃達(dá)到峰值,各時(shí)間點(diǎn)的OD 值分別為0.150、0.153 和0.161,但與40 ℃比較OD 值差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)溫度大于40 ℃時(shí),菌液OD 值逐漸降低,當(dāng)溫度達(dá)60 ℃時(shí),各時(shí)間點(diǎn)菌液的OD 值均小于0.005。 試驗(yàn)表明,菌株在環(huán)境溫度10 ~60 ℃內(nèi)均能生長(zhǎng),但在30 ~40 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好, 其中35 ~40 ℃是菌株的最適生長(zhǎng)溫度。
2.3.3 適宜生長(zhǎng)酸堿度測(cè)定 由圖5 可知,在pH 5.0 ~8.0 內(nèi)菌株生長(zhǎng)良好,最適pH 約為6.0,各時(shí)間點(diǎn)菌液OD 值分別為0.837、0.995 和1.135;培養(yǎng)基pH 為3.0 ~4.0 時(shí),各時(shí)間點(diǎn)菌液OD 值均低于0.05,不適宜菌株生長(zhǎng)。 培養(yǎng)基pH 為9.0 時(shí),各時(shí)間點(diǎn)菌液OD 值均為0,基本未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。
圖5 篩選菌的適宜生長(zhǎng)酸堿度
2.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 結(jié)果如圖6,菌株在初期培養(yǎng)的4 h 內(nèi)為細(xì)菌生長(zhǎng)的延遲期,OD 值小于0.3;在培養(yǎng)的5 ~12 h 細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,OD 值達(dá)1.201; 在培養(yǎng)的12 ~30 h 為生長(zhǎng)穩(wěn)定期,OD值始終保持1.2 左右;30 h 以后為生長(zhǎng)衰亡期,OD 值持續(xù)下降。
圖6 篩選菌生長(zhǎng)曲線
2.3.5 芽孢形成情況 結(jié)果見(jiàn)圖7, 培養(yǎng)至36 h開(kāi)始產(chǎn)生芽孢,芽孢形成率達(dá)35.4%,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)芽孢數(shù)量增多,72 h 時(shí)芽孢形成率為82.1%。
圖7 篩選菌的芽孢形成情況
2.3.6 藥物敏感性 由表1 可知, 所有受試藥物中,菌株僅對(duì)林可霉素和紅霉素耐藥,對(duì)其余藥物均敏感,表明細(xì)菌的藥物敏感性好。
表1 篩選菌的藥敏試驗(yàn)
2.4 篩選菌種產(chǎn)酶性質(zhì)
2.4.1 產(chǎn)纖維素酶能力測(cè)定
2.4.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 依據(jù)葡萄糖溶液測(cè)定結(jié)果得到回歸方程y=0.8084x-0.0053 (R2=0.9993),葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖8。
圖8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.4.1.2 產(chǎn)纖維素酶曲線 由圖9 可知, 培養(yǎng)至36 h 時(shí)篩選菌的纖維素酶活力達(dá)到最大值,為31.97 U/mL,此后纖維素酶活力呈輕微波動(dòng)。
圖9 產(chǎn)纖維素酶活力曲線
2.4.2 纖維素酶性質(zhì)測(cè)定 熱穩(wěn)定性: 結(jié)果見(jiàn)圖10,溫度低于60 ℃時(shí)菌株的纖維素酶活力比較穩(wěn)定,均高于90%;溫度大于60 ℃時(shí)纖維素酶活力急劇下降, 達(dá)到80 ℃時(shí), 纖維素酶活力低于40%。 酸堿穩(wěn)定性:結(jié)果見(jiàn)圖11,pH 7.0 時(shí)纖維素酶穩(wěn)定性最好,pH 6.0 ~8.0 時(shí)纖維素酶相對(duì)穩(wěn)定, 相對(duì)酶活力均保持在90%以上,pH 3.0 時(shí)纖維素酶穩(wěn)定性急劇下降,相對(duì)酶活力僅約20%。
圖10 菌株產(chǎn)纖維素酶熱穩(wěn)定性
圖11 菌株產(chǎn)纖維素酶酸堿穩(wěn)定性
試驗(yàn)從板藍(lán)根樣品中分離出一株降解纖維素能力強(qiáng),可在板藍(lán)根培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)菌,經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌,其耐藥性差,穩(wěn)定性好,可以作為發(fā)酵板藍(lán)根的菌株。 生化結(jié)果顯示,該菌株可以發(fā)酵葡萄糖和蔗糖,但是對(duì)其他糖、醇等均不發(fā)酵。 這與王帥等(2021)從土壤中分離的貝萊斯芽孢桿菌S-3 和繆伏榮等(2021)從茶葉渣中分離的貝萊斯芽孢桿菌Fb 的生化特性相近。 試驗(yàn)菌株的適宜培養(yǎng)溫度和酸堿度結(jié)果顯示,與陳龍等(2019)分離的高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶貝萊斯芽孢桿菌和王金燕等(2018)分離的貝萊斯芽孢桿菌DY-6 的適宜溫度和酸堿度相一致。 但同時(shí)本試驗(yàn)也與諸多關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的研究結(jié)果存在差異(孫會(huì)剛,2021;徐淑琴;2021;張小波,2020)。 原因可能與試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基、搖床參數(shù)和細(xì)菌不同有關(guān)。
在試驗(yàn)所有受試藥物中,分離的貝萊斯芽孢桿菌僅對(duì)林可霉素和紅霉素耐藥, 對(duì)其余藥物均敏感。 張小波等(2020)從發(fā)病花邊鴨肝臟組織中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌, 分離菌對(duì)丁胺卡那、 哌拉西林、 四環(huán)素等三種藥物中度敏感,對(duì)多黏菌素、氨芐西林、頭孢他啶、苯唑西林、羧芐西林和青霉素等六種藥物耐藥,原因可能是細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)多次傳代和動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中的抗生素添加導(dǎo)致的耐藥基因變化造成的。
試驗(yàn)采用最常用的DNS 法測(cè)定細(xì)菌的產(chǎn)纖維素酶活力, 測(cè)得該菌株產(chǎn)纖維素酶活力為
31.97 U/mL。孫會(huì)剛等(2021)研究產(chǎn)酸性纖維素酶的貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶活力為39.2 U/mL。 陳龍等(2019)研究的高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶活力為 (5.14±0.18)U/mL。 鐘麗娟等(2021)分離的飼用貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活性達(dá)65.63 U/mL。 產(chǎn)生纖維素酶活力差異的原因可能與培養(yǎng)條件和碳源、氮源等的不同有關(guān)。
從板藍(lán)根中分離到的內(nèi)生細(xì)菌為貝萊斯芽孢桿菌,細(xì)菌的繁殖條件容易滿足,具有良好產(chǎn)纖維素酶的能力,適宜作為中草藥發(fā)酵菌種。