曲守方 黃傳峰 于婷 黃杰

胚胎植入前非整倍體篩查（preimplantation ge?netic testing for aneuploidy，PGT?A）是對體外受精的胚胎，進(jìn)行染色體非整倍性及染色體拷貝數(shù)變異（Copy number variants，CNV）檢測，篩選正常的胚胎植入子宮的一種早期篩查方法，能夠提高種植率、妊娠率及活產(chǎn)率。1993年首次報(bào)道了經(jīng)胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantation genetic Screening，PGS）后獲得成功妊娠的病例，這項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用性逐漸拓展［1?2］。目前PGS 檢測方法主要包括熒光原位雜交（fluorescence in situ hybrid?ization，F(xiàn)ISH）、比較基因組雜交技術(shù)（comparative genomic hybridization，CGH）和高通量測序（next generation sequencing，NGS）等方法［3?4］。其中高通量測序技術(shù)已經(jīng)成為臨床上使用較多的胚胎染色體分析技術(shù)，多項(xiàng)臨床對照試驗(yàn)均表現(xiàn)出胚胎經(jīng)染色體篩查后妊娠率有所提高［5］。

目前國內(nèi)已經(jīng)有多家公司開發(fā)基于高通量測序技術(shù)的胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒。中國食品藥品檢定研究院于2017年研制胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，用于胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒上市前的注冊檢測。2019年國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)YY/T 1657?2019 胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（測序法）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，用于規(guī)范該類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)。本研究使用胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，評(píng)價(jià)基于半導(dǎo)體測序法的胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 樣本

胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑與儀器

胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）和測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法），購自東莞博奧木華基因科技有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 購自美國Invitrogen 公司；PCR 擴(kuò)增儀，型號(hào)：Veriti，購自美國Thermo Fisher 公司；熒光定量儀，型號(hào)：Qubit 3.0，購自美國Life Technology 公司；熒光定量QPCR 儀，型號(hào)：StepOne Plus，購自美國ABI 公司；基因測序儀，型號(hào)BioelectronSeq 4000，購自東莞博奧木華基因科技有限公司。

1.3 方法

按照胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）的說明書，取國家參考品置于Veriti 型PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行細(xì)胞裂解及片段化，并制備文庫。將文庫進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和單細(xì)胞擴(kuò)增后純化。純化的DNA 使用Qubit 3.0 熒光定量儀和Qubit dsDNA HS Assay Kit 進(jìn)行定量，樣本的濃度要求≥20 ng/μL，確定單細(xì)胞擴(kuò)增是否成功。將純化的單細(xì)胞擴(kuò)增DNA 繼續(xù)進(jìn)行片段化和純化后，進(jìn)行末端修復(fù)、接頭連接以及PCR 擴(kuò)增等步驟，構(gòu)建文庫。將文庫純化后，使用StepOne Plus 熒光定量QPCR 儀和試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行文庫定量。按照文庫上機(jī)濃度的要求，混合各個(gè)文庫。

按照測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法）說明書，混合文庫使用基因測序儀BioelectronSeq 4 000進(jìn)行測序。使用試劑盒配套的全自動(dòng)分析軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生信分析，從而識(shí)別染色體拷貝數(shù)變異。計(jì)算比對到基因組中的測序讀長數(shù)并歸一化成拷貝數(shù)值；然后采用環(huán)狀二元分割算法（Cir?cular Binary Segmentation，CBS）識(shí)別染色體拷貝數(shù)的斷點(diǎn)位置，進(jìn)而將染色體分段（segment）并計(jì)算每個(gè)分段的平均拷貝數(shù)值（CBS Ratio），最后統(tǒng)計(jì)各染色體分段的Z?score 和顯著性水平。CBS Ratio 值的顯著性水平（P?value）采用R 軟件（版本3.4.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用t?檢驗(yàn)計(jì)算P?value。將Z?score 大于3 或小于?3、且P?value 小于0.0001 的染色體分段判斷為染色體拷貝數(shù)變異陽性。

2 結(jié)果

2.1 陽性參考品結(jié)果

對于65 個(gè)異常片段大于4 Mb 的國家陽性參考品，試劑盒均能檢出對應(yīng)的染色體異常，檢出率為100%。國家陽性參考品19?del（7）?25.3M 在7號(hào)染色體100.5 Mb?125.8 Mb 位置存在片段大小約25.3 Mb 的拷貝數(shù)缺失，其Z?score 為?28.6。見圖1；其他國家陽性參考品的相應(yīng)異常區(qū)域?qū)?yīng)的染色體Z?score 均>3 或3或

圖1 國家陽性參考品19?del（7）?25.3M 的結(jié)果Figure 1 The result of nationalpositive reference for 19?del（7）?25.3M

圖2 國家陽性參考品（異常片段大于4Mb）結(jié)果Figure 2 The result of national positive reference materials（abnormal fragments>4 Mb）

圖3 國家陽性參考品22?del（7）?1.5M 的結(jié)果Figure 3 The result of national positive reference for 22?del（7）?1.5M

圖4 國家陽性參考品（異常片段小于等于4 Mb）結(jié)果Figure 4 The result of national positive reference materials（abnormal fragments ≤4 Mb）

2.2 陰性參考品結(jié)果

10 個(gè)國家陰性參考品均未檢出試劑盒范圍內(nèi)的染色體異常，其Z?score 均小于3 且大于0，顯著性水平P?value>0.0001，如國家陰性參考品97?NC1在1?22 號(hào)染色體和性染色體區(qū)域內(nèi)均未檢測出異常區(qū)域。見圖5、圖6。

圖5 國家陰性參考品97?NC1 結(jié)果Figure 5 The result of national negative reference material for 97?NC1

圖6 國家陰性參考品結(jié)果Figure 6 The result of national negative reference materials

2.3 嵌合體參考品結(jié)果

對30%嵌合的嵌合體樣本檢出率為50%（3/6），相對應(yīng)的70%嵌合體樣本檢出率為83.3%（5/6）。見圖7。國家嵌合體參考品110?0.3?del（4）?37.7M是兩種細(xì)胞不同比例的混合，30%嵌合比例細(xì)胞在4 號(hào)染色體153.1 Mb?190.8 Mb 位置存在大小約37.7 Mb 拷貝數(shù)缺失，其Z?score 為?16.5；70%嵌合比例細(xì)胞在15號(hào)染色體23.6 Mb?28.5 Mb位置存在大小約4.9 Mb 拷貝數(shù)缺失，其Z?score 為?10.5，結(jié)果顯示30%嵌合和70%嵌合的細(xì)胞均正確檢出。見圖8。

圖7 國家嵌合體參考品結(jié)果Figure 7 The result of national chimera reference materials

圖8 國家嵌合體參考品110?0.3?del（4）?37.7M 結(jié)果Figure 8 The result of national chimera reference material for 110?0.3?del（4）?37.7 M

3 討論

在體外受精形成的胚胎中，約50%存在染色體異常，可導(dǎo)致移植后早期胚胎丟失、自然流產(chǎn)和死產(chǎn)，是限制輔助生殖技術(shù)成功率和有效推廣的重要原因之一?；诟咄繙y序的胚胎植入前染色體非整倍體檢測，檢測胚胎卵裂球細(xì)胞或者囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的DNA，獲得樣本中23 對染色體數(shù)量的差異，對胚胎染色體非整倍體或部分染色體拷貝數(shù)變異進(jìn)行植入前輔助診斷，選擇正常胚胎植入子宮，從而提高輔助生殖的成功率。而單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）技術(shù)的選擇與評(píng)價(jià)，不同測序平臺(tái)的數(shù)據(jù)量要求，分析算法的選擇以及陰陽性預(yù)測的劃分標(biāo)準(zhǔn)等，這些均是影響胚胎植入前染色體非整倍體檢測結(jié)果的因素［6］。目前單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增包括多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplifica?tion，MDA）、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（multiple annealing and looping?based amplification cycles，MALBAC）和簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate oligonucleotide primerPCR，DOP?PCR）等技術(shù)方法，每種方法各有自己的優(yōu)勢［7?8］。為使胚胎植入前遺傳學(xué)篩查更加規(guī)范并能夠有效地實(shí)施，國內(nèi)外發(fā)布不同的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)的指南性文件和專家共識(shí)［9?10］。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析一直被用作診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，然而它費(fèi)時(shí)費(fèi)力且很大程度上依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，染色體分辨率很低，為5～10 M。高分辨率染色體微陣列分析（CMA）技術(shù)可以檢測染色體數(shù)目異常、微缺失/重復(fù)、單親二體，在人力資源有限的產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室中，CMA 可以單獨(dú)用于代替細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析?？截悢?shù)變異測序（CNV?Seq）分辨率為0.2 Mb，用于檢測具有臨床意義的染色體異常［11］。2020年，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）等發(fā)布對CNV 致病性評(píng)估的最新指南，對>100 kb 的CNV 進(jìn)行分類，分為致病性CNV（patho?genic CNV，pCNV）、可能致病性CNV（1ikely patho?genic CNV，lpCNV）和良性CNV（benign CNV，bC?NV）等5 類［12］。CNV 是良性的或者是致病性的，取決于它們的位置和基因含量，致病性CNV 越來越多地與復(fù)雜疾病相關(guān)，尤其是一些結(jié)構(gòu)性先天性異常［13］。參考臨床上致病性CNV 的異常片段大小和檢測方法的靈敏度，我們將染色體異常片段大小設(shè)置為4Mb，用于評(píng)價(jià)試劑盒CNV 檢測能力。胚胎嵌合是指在胚胎的組成細(xì)胞中存在兩種或以上不同染色體組成的細(xì)胞系，對于介于正常與異常之間的整倍體/非整倍體嵌合胚胎，需要設(shè)置嵌合報(bào)出的閾值［14］。對于嵌合胚胎的檢測，不同研究報(bào)道對于診斷染色體嵌合推薦的閾值，國際胚胎植入前遺傳學(xué)診斷協(xié)會(huì)（Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS）推薦的嵌合報(bào)出閾值是20%～80%［15?16］。

中國食品藥品檢定研究院研制了胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，用于試劑盒的注冊檢測和上市后監(jiān)督抽驗(yàn)工作。為了評(píng)價(jià)試劑盒對囊胚篩選中染色體不同大小CNV 的檢測能力，國家參考品設(shè)置了不同異常片段大小的國家陽性參考品，并規(guī)定異常片段大于4 Mb 的陽性參考品對應(yīng)的染色體異常要求檢出率達(dá)到100%，異常片段小于等于4 Mb 的陽性參考品對應(yīng)的染色體異常要求檢出率達(dá)到30%以上。研究結(jié)果顯示胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）對異常片段大于4 Mb 的國家陽性參考品均能夠檢出對應(yīng)的染色體異常，對異常片段小于等于4 Mb 的國家陽性參考品的檢出率為86.7%，符合要求。針對嵌合胚胎，國家參考品設(shè)置了30%嵌合的嵌合體樣本，要求其檢出率應(yīng)達(dá)到30%以上，同時(shí)要求相對應(yīng)的70%嵌合體樣本的檢出率應(yīng)達(dá)到60%以上。研究結(jié)果顯示試劑盒對30%嵌合比例國家嵌合體參考品的檢出率為50%，對70%嵌合比例國家嵌合體參考品的檢出率為83.3%，符合相應(yīng)的要求。對于國家陰性參考品，試劑盒均未檢出范圍內(nèi)的染色體異常。本研究表明胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）能夠符合國家參考品的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率和嵌合體參考品符合率的要求，國家參考品能夠?qū)ε咛ブ踩肭叭旧w非整倍體檢測試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，具有很好的適用性。