袁紅霞 龍歆孜 陳虹亮 周安文 蔡友香 羅麗裴

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種專性細胞內(nèi)病原體，可通過感染陰道、尿道、直腸粘膜、眼結(jié)膜等部位引起人類各種疾病，如致盲性沙眼、男性前列腺炎、女性輸卵管炎癥和不孕癥、新生兒眼結(jié)膜炎和肺炎等［1］。早在2012年WHO 預(yù)估全球每年Ct 感染率可高達1.31 億，超過梅毒、淋病位居首位［2］。此外，未經(jīng)正規(guī)治療的Ct 活動性感染幾率高達89%［3］。可見，Ct 感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。然而，Ct 感染后通常無明顯癥狀，易被忽視而延誤診治，以致感染持續(xù)反復(fù)遷延，造成不可逆的病理變化及嚴(yán)重并發(fā)癥［4］。因此，建立Ct 感染快速及準(zhǔn)確地的診斷方法尤為重要。研究表明，Ct 感染引起的病變主要是由于其感染期間釋放的宿主因子引發(fā)的炎癥，而分泌型蛋白可克服宿主防御機制，以改變細胞質(zhì)液泡腔內(nèi)環(huán)境、修飾細胞質(zhì)液泡膜、操縱宿主細胞胞質(zhì)溶膠中的宿主信號通路，在活動性感染過程中產(chǎn)生并顯著富集［5］。故本研究通過基因工程方法篩選特異性重組抗原，以分泌型蛋白為包被抗原建立間接ELISA 法檢測Ct 感染血清，評價其診斷應(yīng)用價值，為Ct 感染臨床診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Ct 菌株（美國菌種保藏中心）、Hela 細胞（上海中科院細胞庫）、質(zhì)粒提取試劑盒和PCR 純化試劑盒（OMEGA 工業(yè)儀器中國總公司）、DNA 和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（美國EpochBiolabs 生物技術(shù)公司）、蛋白印跡法檢測試劑盒（Amersham Biosciences 公司）、Ct IgG ELISA 檢測試劑盒（晶美生物工程有限公司）、瓊脂糖（重慶奧哲科技有限公司）、胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司）、電泳儀及水平電泳槽（美國Bio?Rad 公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進科學(xué)儀器廠）、DU640 型核酸蛋白定量分析儀和高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）、Hema4800 型PCR 儀（珠海黑馬生物科技有限公司）等。PBS、TBS、緩沖液、LB 培養(yǎng)基等配制均參考《分子克隆實驗指南》［6］。

1.2 臨床標(biāo)本

收集2020年01月至2021年12月湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科采集的220 份疑似為Ct 感染的人血清樣本，其中包括性傳播性疾病87 例、泌尿生殖系統(tǒng)感染71 例、不孕不育癥患者35 例、呼吸道感染27 例，均采用經(jīng)晶美公司Ct IgG ELISA 試劑盒檢測，其中，Ct檢測陽性者60例，Ct檢測陰性者160例。

1.3 實驗方法

1.3.1 獲取基因序列

通 過 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez）對沙眼衣原體已知分泌型效應(yīng)蛋白進行Ct 蛋白篩選，用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行蛋白?蛋白間同源性對比，找到同源性最高的假定蛋白。通過檢索，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒糖蛋白3（plasmid glycopro?tein 3，Pgp3）基因（序列號：CP002055）同源性在94%～100%之間，故將其作為本次研究的目的基因。

1.3.2 PCR 擴增產(chǎn)物檢測

根據(jù)Pgp3基因序列，對照pET30a（+）載體上的多克隆酶切位點，在引物的5′端添加合適的酶切位點，上游引入NdeⅠ，下游引入XhoⅠ，分別加上保護性堿基，獲得引物序列為5′?GGAATTC?CATATGATGGG AAATTCTGGTTTTTACTT?3′、5′?CCGCTCGAGTTAACCAT TTGTTTGTTGTTT?TAC?3′。提取Ct DNA 模板進行PCR 擴增。

1.3.3Pgp3表達載體的構(gòu)建及鑒定

對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化，OMEGA 質(zhì)粒試劑盒進行pET30a 質(zhì)粒DNA 的提取，在0.2 mLEP管中加入NdeⅠ和XhoⅠ試劑等，37℃水浴雙酶切8 h，終止酶切反應(yīng)后加入1 μL 溴酚藍上樣緩沖液，混勻后在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳（5 v/cm），觀察電泳結(jié)果并保存實驗結(jié)果。在DNA 擴增儀上，按94℃5 min、94℃1 min、退火60℃1 min、延伸72℃2 min、末次循環(huán)后72℃10 min 的條件進行反應(yīng)，結(jié)果同樣以電泳鑒定。

1.3.4 重組蛋白Pgp3 的IPTG 誘導(dǎo)表達

將含有重組菌的LB 液體培養(yǎng)基按1∶50 的體積接種到5 mL 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：37℃、13 000 rpm，離心半徑9.54 cm，離心20 min，pET30a 空載培養(yǎng)方法一樣。當(dāng)瓶中菌液呈云霧狀時，分裝到小搖菌瓶中（其中溫度分別為：10℃、16℃、24℃、30℃、37℃；濃度分別為：不加IPTG、加0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L 的IPTG），繼續(xù)37℃，180 r/min 搖床上培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h 后，對菌液進行4℃，13 000 r/min，離心半徑8.31 cm，離心10 min，棄去上清，將樣品加入聚丙烯酰胺凝膠中，蛋白電泳，觀察最適重組蛋白IPTG 誘導(dǎo)溫度及濃度。

1.3.5 重組蛋白Pgp3 的Western?blot 分析

將剪切好的PVDF 膜激活，并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液，使用電泳儀在125 mA 下靜置1 小時。結(jié)束后的聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至緩沖液中待用，在4℃，220 mA 穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取膜到合適的容器中，加入1×PBST 搖5～10 min，棄PBST，在10 mL PBSM 中封閉，4℃下孵育過夜，并與血清在室溫下輕輕攪拌孵育2 h。在PBST?中洗滌3 次后，將膜與辣根過氧化物標(biāo)記的二抗1∶10 000 稀釋，室溫孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（electrochemilu?minescence imaging，ECL）顯色，觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.3.6 間接ELISA 法的建立及其初步評價

以棋盤滴定法確定包被濃度（1 μg/mL）和血清稀釋度（1∶100），以含1 μg/mL 純化重組蛋白的碳酸鹽緩沖液包被96 孔微量反應(yīng)板，4℃過夜，經(jīng)5%脫脂奶粉的PBS 液封閉。以晶美公司Ct Ig G ELISA 陽性和陰性血清標(biāo)本試劑盒為對照，與自建間接法平行檢測220 例臨床血清標(biāo)本，檢測結(jié)果計算敏感度、特異度、符合率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析；計數(shù)資料以n描述，采用卡方檢驗；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pgp3 目的基因的PCR 擴增

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的基因Pgp3在對應(yīng)的位置上（大小約564 bp）可見清晰的條帶，與預(yù)期片段一致。見圖1。

圖1 Pgp3 基因的PCR 擴增Figure 1 The PCR amplification of the Pgp3 gene

2.2 p ET30a/Pgp3 表達載體鑒定

在對應(yīng)的位置上（大小約792 bp）可見清晰的條帶。見圖2。經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，得到大小約為792 bp 的清晰條帶。見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a/Pgp3 的PCR 鑒定Figure 2 PCR characterization of the recombinant plasmid pET30a/Pgp3

圖3 重組質(zhì)粒pET30a/Pgp3 的雙酶切鑒定Figure 3 Identification of the double enzyme digestion of the recombinant plasmid pET30a/Pgp3

2.3 重組蛋白Pgp3 的表達情況

誘導(dǎo)溫度為10℃時條帶最粗。見圖4。誘導(dǎo)得到0.6 mmol/L 出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白條帶最粗。見圖5。

圖4 pET30a/Pgp3 蛋白表達最佳誘導(dǎo)溫度Figure 4 Optimal induction temperature of pET30a/Pgp3 protein expression

圖5 pET30a/Pgp3 蛋白表達最佳誘導(dǎo)濃度Figure 5 Optimal inducible concentration of pET30a/Pgp3 protein expression

2.4 重組蛋白Pgp3 的Western?blot 分析

陰性血清中無重組蛋白的表達，陽性血清有一條反應(yīng)較弱的明顯條帶，抗HIS 標(biāo)簽有一個明顯的清晰條帶。見圖6。

圖6 pET30a/Pgp3 表達Pgp3 蛋白的Western?blot 分析Figure 6 A Western?blot analysis of the pET30a/Pgp3?expressing Pgp3 protein

2.5 重組蛋白Pgp3 在Ct 感染診斷中的初步應(yīng)用

用商品化晶美公司Ct Ig G ELISA 試劑盒及建立的間接重組蛋白Pgp3 ELISA 法檢測220 份臨床血清標(biāo)本，結(jié)果顯示：陽性標(biāo)本中，重組蛋白Pgp3的敏感度為86.21%（50/58），特異度為93.83%（152/162），與Ct IgG 試劑盒符合率為91.82%［（50+152）/220］，重組蛋白Pgp3 ELISA 間接法和Ct IgG ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.056，P=0.814）。見表1。

表1 重組蛋白Pgp3 ELISA 間接法和Ct IgG ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of results by recombinant protein Pgp3 ELISA and Ct IgG ELISA kit

3 討論

Ct 的質(zhì)粒含有8 個開放閱讀框，即Pgp1～8，其中PGP4、5 參與染色體基因的表達，PGP1、2、6、8 與質(zhì)粒的維護和復(fù)制相關(guān)，為只有Pgp3 是唯一一個能分泌到宿主細胞質(zhì)的質(zhì)粒糖蛋白［7?9］。因此，本研究從生物信息角度篩選了Pgp3作為假定效應(yīng)蛋白基因。

研究以Ct 血清標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA 為模板，對Pgp3基因進行PCR 擴增，同時選用含有原核表達載體pET30a 成功地構(gòu)建了pET30a/Pgp3重組質(zhì)粒；通過對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定分析，證實了Pgp3基因的一致性，確保了下一步研究的可靠性。p ET30a 表達載體具有HIS?tag 小分子標(biāo)簽，有利于蛋白的純化，但不同的培養(yǎng)誘導(dǎo)濃度及培養(yǎng)溫度對其表達效率可能存在一定影響［10］。既往研究表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度低及劑量的減少可避免包涵體的形成［11］。本研究經(jīng)反復(fù)摸索和優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)Pgp3重組蛋白在10℃、0.6 mmol/L IPTG 濃度下呈現(xiàn)良好的表達效果，同時發(fā)現(xiàn)該條件下Pgp3重組蛋白以包涵體形式表達，且能得到較多的可溶性蛋白。包涵體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可用低濃度的表面變性劑、活性劑等除去其中雜質(zhì)，有利于純化包涵體［12］。本研究在確定Pgp3重組蛋白表達條件及形式后，按照常規(guī)的方法進行純化，再經(jīng)Western?Blot 鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蛋白電泳膠塊上大小約29 KD 處的Pgp3 目的蛋白的存在較好的特異性，證明可用于針對Ct 感染的抗原診斷方法的后續(xù)實驗研究。

臨床診斷研究初步證明，以Pgp3 重組蛋白建立間接ELISA 檢測和Ct Ig G ELISA 試劑盒比較，重組蛋白Pgp3 的敏感度為86.21%，特異度為93.83%，Pgp3 重組蛋白建立間接ELISA 檢測與Ct IgG 試劑盒符合率為91.82%。從數(shù)據(jù)上看，Pgp3重組蛋白的敏感度略高與Ct IgG 試劑盒，但二者比較并無顯著性差異。但從總體研究來看，以Ct Pgp3 重組蛋白為基礎(chǔ)建立的間接ELISA 法具有較好的敏感性和特異性，可用于Ct 活動性感染的特異性抗體檢測。有研究表明，Pgp3 為外膜復(fù)合體的組成成分，具有很強的免疫原性［13］。在動物實驗研究中，Pgp3 作為毒力因子，可促進巨噬細胞和樹突狀細胞的吞噬功能，其基因缺失或表達異常將引起小鼠體內(nèi)的播散感染，如輸卵管病變及胃腸道的感染，不過其致病機制目前仍不明確［14］。在臨床診斷上，Wills 等［15］比較以其與其他三種以商品化Ct ELISA 檢測試劑盒比較，Pgp3 蛋白的特異性和敏感性分別為95%和74%，明顯高于其他三種商品化ELISA。因此也證實了Pgp3 蛋白在Ct 感染的診斷上可能有較高的診斷價值。

綜上所述，本研究獲得了純化的Ct 重組蛋白Pgp3，其具有較好的免疫原性，同時，以Pgp3 蛋白建立的間接ELISA 法的具有較好的特異性和敏感度，且與商品Ct IgG ELISA 試劑盒檢測結(jié)果符合率高，可能有望作為Ct 活動期感染的血清學(xué)診斷的候選抗原。