魯松松，趙夏下，祁重霞，杜雨薇

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

高原土著動(dòng)物的血紅蛋白（Hb，hemoglobin）普遍進(jìn)化出較高的氧親和力，屬于生理適應(yīng)的經(jīng)典例子［1］。大量的比較研究結(jié)果顯示，高海拔嚙齒類動(dòng)物通常具有較低海拔近緣物種更高的血紅蛋白或血液氧親和力［2-4］。低氧條件下，Hb氧親和力的升高使得動(dòng)、靜脈氧分壓差值最大化，從而有效提高機(jī)體的氧運(yùn)輸效率［5］。有頜類脊椎動(dòng)物的Hb 是由2 個(gè)相同α 亞基和2 個(gè)相同β 亞基組成的異源四聚體，每個(gè)亞基包含一個(gè)血紅素（Heme）輔基，亞鐵離子（Fe2+）位于卟啉環(huán)中心位置，可逆地與1分子氧氣結(jié)合以發(fā)揮Hb 的運(yùn)輸功能。四聚體結(jié)構(gòu)賦予Hb與配體結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)和變構(gòu)效應(yīng)。Hb氧親和力的進(jìn)化改變主要涉及α 和β 亞基的氨基酸突變引起的協(xié)同效應(yīng)（固有氧親和力）及變構(gòu)效應(yīng)（變構(gòu)因子的敏感度）的改變。

高原鼢鼠Eospalax baileyi是青藏高原特有的地下鼠，隸屬鼴形鼠科Spalacidae 鼢鼠屬M(fèi)yospalax凸顱亞屬Eospalax。其生存不僅要面臨高原和密閉洞穴雙重低氧的挑戰(zhàn)，同時(shí)還受到洞穴高二氧化碳環(huán)境的影響。據(jù)報(bào)道，高原鼢鼠棲息地大氣氧分壓約為海平面水平的65%，其居住洞穴內(nèi)（地下18 cm）氧含量約為大氣的83%～88%，且CO2含量最高值可達(dá)大氣含量的48.6 倍［6］。已有的研究表明，高原鼢鼠長期生活在如此嚴(yán)苛的環(huán)境中，其形態(tài)特征、心肺器官、血液循環(huán)系統(tǒng)以及分子水平都表現(xiàn)出適應(yīng)低氧-高二氧化碳環(huán)境的特征，如心臟每搏輸出量、肺部單位面積肺泡數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和Hb 含量、動(dòng)靜脈氧分壓差等氧氣運(yùn)輸?shù)母鳝h(huán)節(jié)均呈現(xiàn)出協(xié)同的改變［7-9］。最新的研究結(jié)果表明，高原鼢鼠純化Hb 的固有氧親和力顯著高于小鼠，且加入DPG 和CL-等變構(gòu)因子后高原鼢鼠Hb 的P50值（Hb 50%氧飽和度下的氧分壓）依然顯著低于小鼠［10］，說明高原鼢鼠升高的Hb 氧親和力可能是遺傳基礎(chǔ)改變引起的，是自然選擇的結(jié)果。值得注意的是，在相同條件下，高原鼢鼠Hb 的固有氧親和力［P50僅為（706.23 ±7.98）Pa］，顯著低于其他嚙齒類近緣種，如小鼠［（960.26 ±3.99）Pa］、家鼠（約為984.20 Pa）、高原鼠類鹿鼠Peromyscus maniculatus（1 010.80～1 170.40 Pa）及同樣營嚴(yán)格地下生活的6 種非洲鼴形鼠（982.87～1 401.82 Pa）［11-13］。高原鼢鼠成體Hb 的P50值與哺乳動(dòng)物胚胎型Hb（532.00～798.00 Pa）更接近［14］。此外等電聚焦電泳結(jié)果顯示，高原鼢鼠成體紅細(xì)胞中表達(dá)了2 種主要Hb 組分，一種含量稍高的組分具有較低的等電點(diǎn)（pI，isoelectric point），另一種含量稍低的組分具有較高的pI［10］，這與其他哺乳動(dòng)物完全不同（成體紅細(xì)胞中僅表達(dá)1 種主要Hb 亞型）［1］。為維持機(jī)體在不同環(huán)境中的氧供需平衡，理論上機(jī)體可以通過對具有不同氧合特性的Hb 亞型（氧親和力不同）的表達(dá)調(diào)節(jié)，從而可逆地調(diào)節(jié)血氧親和力，但這種調(diào)節(jié)機(jī)制較常見于鳥類，在哺乳動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)［1，15-16］。因此，鑒定兩種Hb亞型的組成是目前深入理解和闡釋高原鼢鼠Hb適應(yīng)低氧-高二氧化碳環(huán)境機(jī)理的關(guān)鍵。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，基因組和轉(zhuǎn)錄物組學(xué)研究在非模式動(dòng)物中廣泛應(yīng)用，近期高原鼢鼠基因組和多個(gè)組織轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)使用權(quán)限的開放，極大地便利了對高原鼢鼠基因組Hb基因的鑒定和表達(dá)分析。本文通過比較基因組和轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析了高原鼢鼠基因組中Hb基因組成及在成體各組織中的表達(dá)情況，初步鑒定了兩種成體Hb亞型的組成，并通過分子進(jìn)化及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析深入探討了高原鼢鼠Hb 進(jìn)化出較高氧親和力的潛在機(jī)制。本研究首次發(fā)現(xiàn)哺乳類動(dòng)物胚胎型αE基因在成體中表達(dá)，這可能是成體高原鼢鼠Hb 具有異常高氧親和力的主要原因，為哺乳動(dòng)物低氧適應(yīng)的研究和高原醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 血紅蛋白基因鑒定和基因簇結(jié)構(gòu)分析

從數(shù)據(jù)庫中下載小鼠（NCBI，GRCm39）、銀星竹鼠（NCBI，RhiPru_1.0）、以 色 列 鼴 鼠（NCBI，S. galili_v1.0）和 高 原 鼢 鼠（NGDC，plateau_zokor_v2.1）基因組序列及其注解文件（GFF）?；蜃⒔馐褂肂LAST 軟件（2.11.0 版）［17］，比對到的基因組片段通過GenScan 在線服務(wù)（https：//www.genes.mit.edu/GENSCAN.html）進(jìn)行基因、編碼區(qū)序列（CDS，coding sequence）和蛋白質(zhì)預(yù)測。通過Mega 軟件將對齊后的序列進(jìn)行手動(dòng)矯正。本文將CDS 序列內(nèi)提前出現(xiàn)終止密碼子和堿基缺失/插入導(dǎo)致的三聯(lián)密碼子錯(cuò)位認(rèn)定為假基因。對NCBI數(shù)據(jù)庫中存放的基因組、基因簇DNA 序列全長使用Nucleotide 庫根據(jù)各基因在基因組片段的位置獲取。高原鼢鼠Hb基因及基因簇DNA序列全長使用自編Perl語言腳本進(jìn)行提取。基因簇結(jié)構(gòu)可視化使用GSDS2.0 在線服務(wù)完成（http：//gsds. cbi. pku.edu.cn/）。

1.2 轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄本從頭組裝

本文選用NCBI 數(shù)據(jù)庫中高原鼢鼠所有組織樣品的轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)以評估高原鼢鼠Hb基因的表達(dá)， 包括腎臟、 骨骼肌和視網(wǎng)膜組織（PRJNA282349，N=1），以及腦（PRJNA342079，N=3）和肝臟組織（PRJNA211727，N=3）。選用小鼠胚胎及成體組織的測序數(shù)據(jù)，以驗(yàn)證嚙齒類基因組中胚胎型和成體型Hb基因的組成，包括3.5 d（PRJNA674788，N=3）和5.5 d（PRJNA683789，N=3）單囊胚，13～15 d肝臟（PRJNA625751，N=3）、心臟（PRJNA602232，N=3）和腦（PRJNA670344，N=3）組織，成 體 心 臟（PRJNA264588，N=3）、肝 臟（PRJNA668230，N=3）、腦（PRJNA674888，N=3）、骨骼?。≒RJDB10551，N=3）、腎臟（PRJNA543476，N=3）及視網(wǎng)膜（PRJNA435475，N=3）。轉(zhuǎn)錄物組測序基礎(chǔ)數(shù)據(jù)使用自編Perl語言腳本進(jìn)行過濾（刪除低質(zhì)量值的雙末端測序reads）。使用Trinity 軟件（2.11.0 版）［18］對過濾后的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行從頭組裝，得到轉(zhuǎn)錄本后，使用上述BLAST法鑒定Hb基因的轉(zhuǎn)錄本。從頭組裝的轉(zhuǎn)錄本用于進(jìn)一步確定基因組注解中預(yù)測的假基因及CDS序列的準(zhǔn)確性。

1.3 血紅蛋白基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建和分子進(jìn)化分析

本文分別采用最大似然（maximum likelihood）和貝葉斯（Bayesian）法對Hb基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生重建。DNA 全長序列用MUSCLE 軟件［19］對齊后，使用Treefinder 軟 件（http：//www. treeFinder. de/）和Mrbayes 軟件（3.2.7a）［20］分別構(gòu)建最大似然樹和貝葉斯樹。其中，最大似然樹使用Propose Model 插件選擇最優(yōu)替代模型后，采用bootstrap 抽樣檢驗(yàn)法（1 000 次）評估分枝節(jié)點(diǎn)的支持率。貝葉斯樹構(gòu)建參數(shù)設(shè)置為廣義時(shí)間可逆（GTR，general time reversible）模型，8 條鏈同時(shí)運(yùn)行1 000 000 代，采用頻率為1 000。舍棄前25%的老化樣本（burnin）后，采用多數(shù)決定原則統(tǒng)計(jì)共有樹及其分枝節(jié)點(diǎn)的貝葉斯后檢驗(yàn)概率（Bayesian posterior probabilities）。

本文以轉(zhuǎn)錄本中鑒定的CDS 序列為基礎(chǔ)，使用PAML4 軟件（4.9j）［21］的分枝位點(diǎn)模型（branch site）分析了高原鼢鼠和甘肅鼢鼠成體表達(dá)Hb基因的潛在正選擇位點(diǎn)。選用MA模型并指定鼢鼠分枝為前景分枝以檢測該分枝中可能的正選擇位點(diǎn)，并使用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法（BEB，bayes empirical bayes）計(jì)算正選擇位點(diǎn)的后驗(yàn)概率，比較模型選擇空模型（null model）。上述模型間差異顯著性采用似然比檢驗(yàn)（LRT，likelihood ratio test）進(jìn)行測試。

1.4 血紅蛋白基因表達(dá)分析

過濾后的轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)使用Bowtie2 軟件（2.2.9版）［22］比對到各物種Hb基因的CDS序列上，比對參數(shù)設(shè)置為-D 20-R 3-N 0-L 20-i S，1，0.50。比對結(jié)果使用自編Perl 語言腳本進(jìn)行reads 數(shù)量統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算各組織中Hb基因的表達(dá)量?；虮磉_(dá)量表示為每百萬reads 比對到CDS 序列每千堿基上的 數(shù) 量（RPKM，reads per kilobase per million mapped reads），RPKM＜1 時(shí)為不表達(dá)基因。單樣品測序數(shù)據(jù)僅用于評估基因是否表達(dá)。對有生物學(xué)重復(fù)樣品的測序數(shù)據(jù)（N=3），使用SPSS 軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)差異的顯著性（P＜0.05時(shí)差異顯著）。

1.5 蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

使用ExPASy 在線服務(wù)（www.expasy.org）完成蛋白質(zhì)pI、總平均親水指數(shù)（GRAVY，grand average of hydropathicity）和氨基酸親水性/極性等物理化學(xué)性質(zhì)分析。血紅蛋白四聚體同源建模使用Modeller軟件（9.24 版）［23］完成，同源模板選擇小鼠去氧合成體血紅蛋白X 射線晶體衍射結(jié)構(gòu)（3HRW，0.28 nm），共構(gòu)建100 個(gè)模型，使用DOPE 和GA341 方法進(jìn)行評估并選擇最優(yōu)模型用于結(jié)構(gòu)比較。同源結(jié)構(gòu)比較和3D 結(jié)構(gòu)顯示使用VMD 軟件（1.9.3 版）［24］。血紅素“口袋”（heme pocket）體積計(jì)算使用GHECOM 1.0 在線服務(wù)（https：//pdbj.org/ghecom/）完成。

2 結(jié) 果

2.1 鼴形鼠科動(dòng)物α和β基因簇結(jié)構(gòu)

本文對高原鼢鼠、銀星竹鼠和以色列鼴鼠3個(gè)鼴形鼠科物種基因組中的Hb基因進(jìn)行了重新鑒定，與已有研究結(jié)果相符［25］，3種鼠類Hb基因中，α和β兩個(gè)亞家族基因分別位于兩個(gè)不同基因組片段且家族成員間相互聚集成簇（圖1）。比較分析結(jié)果顯示，3 種鼠類α基因簇長度不盡相同，其中高原鼢鼠（GWHABJZ00000029：10 108 817～10 119 436 bp）和 銀 星 竹 鼠（VZQC01006430：2 529 015～2 541 954 bp）長度相近，約為11 kb；而以色列鼴鼠（NW_008353596：4 698 608～4 724 458 bp）長度與小鼠和人相近，約為26 kb。與小鼠相比（5′-αE，αA1，αQ2，αA2，αQ1-3′），3 種鼴形鼠科物種的α基因家族明顯收斂，基因簇中僅保留了3個(gè)基因，排列模式為5′-αE，αA，αQ-3′。3種鼠類的β基因簇長度差異較大，分別為高原鼢鼠53 kb（165 907～219 796 bp）、銀星竹鼠110 kb（196 599～306 296 bp）和以色列鼴鼠86 kb（752 279～838 350 bp），但基因數(shù)量相對保守，均包含7個(gè)家族成員。與嚙齒目其他鼠類的研究相似［26］，3種鼴形鼠科鼠類β基因簇5′端為單拷貝的胚胎型ε基因，3′ 端為至少2 個(gè)胚后表達(dá)型β基因。

圖1 嚙齒類動(dòng)物α和β基因簇結(jié)構(gòu)Fig.1 Genomic structure of the α-and β-globin gene family in rodents

2.2 血紅蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于嚙齒類動(dòng)物α（圖2a）和β基因（圖2b）DNA序列全長重建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，結(jié)果顯示最大似然樹和貝葉斯樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在α基因樹中，鼴形鼠科鼠類3 個(gè)單拷貝α基因分別與小鼠和人 類αA（MLbs = 0.75，Bapp = 0.99）、αQ（MLbs =1.00，Bapp = 1.00）及αE（MLbs = 0.95，Bapp =1.00）形成主要分枝，其中αA和αQ兩個(gè)主要分枝形成姊妹分枝組成一個(gè)根分枝（MLbs= 0.99，Bapp =1.00）。本文在所有嚙齒目物種中均未發(fā)現(xiàn)與人類αD基因直系同源的基因。上述結(jié)果說明，鼴形鼠科鼠類3 個(gè)α基因?yàn)?∶1 直系同源基因，且嚙齒類動(dòng)物基因組中αD基因已被刪除。

圖2 嚙齒類動(dòng)物α和β基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.2 Maximum likelihood phylogram describing relationships among the α-and β-globin genes of rodents

在β基因樹中，鼴形鼠科鼠類β基因形成4個(gè)主要分枝：與小鼠和人類ε基因1∶1 同源的分枝（ε分枝，MLbs=0.79，Bapp=0.99）；與小鼠γ基因同源的分枝（包括了鼴形鼠科鼠類γ基因及高原鼢鼠γ2基因，MLbs=0.92，Bapp=1.00）；鼴形鼠科鼠類γ 1、銀星竹鼠和以色列鼴鼠γ2基因、高原鼢鼠和以色列鼴鼠兩個(gè)σ假基因（MLbs = 1.00，Bapp = 1.00）；鼴 形 鼠 科 鼠 類β1、β2和β3基 因（MLbs = 0.99，Bapp=1.00）。已有的研究結(jié)果表明，現(xiàn)存嚙齒類動(dòng)物ε/γ和σ/β基因分別起源于真獸亞綱動(dòng)物共同祖先中原ε（protoε）和原β（protoβ）基因的一次基因復(fù)制事件［27］。與上述結(jié)果相符，ε分枝與除小鼠γ1基因外的所有γ基因聚為一個(gè)根分枝（MLbs=0.80，Bapp=0.94），同時(shí)所有β基因與除高原鼢鼠和以色列鼴鼠兩個(gè)σ假基因外的所有σ基因聚為一支（MLbs =0.85，Bapp=0.98）。值得注意的是，高原鼢鼠和以色列鼴鼠兩個(gè)σ假基因和小鼠γ1遠(yuǎn)離了σ或γ分枝。出現(xiàn)這個(gè)結(jié)果的原因可能是高原鼢鼠和以色列鼴鼠γ基因（供體）與鄰近的σ基因（受體）及小鼠σ基因（供體）與鄰近的γ基因（受體）間發(fā)生過基因轉(zhuǎn)換事件（染色體不平等交換），使得受體基因在系統(tǒng)發(fā)生樹中遠(yuǎn)離原分枝而更接近供體分枝，這種情況在脊柱動(dòng)物β基因簇中較為常見［28-29］。

2.3 小鼠和高原鼢鼠Hb基因的表達(dá)

小鼠胚胎和成體組織Hb基因表達(dá)結(jié)果（圖3、圖4）表明，胚胎和成體階段Hb基因具有不同的表達(dá)譜，即使在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期Hb基因的表達(dá)譜也明顯不同。在胚胎發(fā)育早期（3.5～5.5 d），僅檢 測 到αA1和αA2兩 個(gè) 基 因 被 表 達(dá)，RPKM 分 別 為3.96 ±2.68 和2.11 ±0.68。在胚胎發(fā)育后期（13～15 d），除γ1和兩個(gè)假基因（σ和αQ1）外其他所有基因均檢測到被表達(dá)，RPKM 范圍為（1.12 ±0.39）～（38 254.00 ±3 295.14）。其中αE、ε和γ基因在胚胎腦組織（14 d）中的表達(dá)量最高，RPKM 分別為213.98 ±30.93、1 111.30 ±174.57 和31.29 ±8.99；αA1、αQ2、αA2、β1和β2基因在胚胎肝臟組織（15 d）中的表達(dá)量最高，RPKM 分別為38 254.00±3 295.14、30.15 ±2.96、26 120.00 ±2 278.35、30 849.00 ±3 071.05 和24 313 ±2 645.87。在成體階段，αA1、αA2、β1和β2在心臟、骨骼肌、腦、肝臟、腎臟、視網(wǎng)膜和睪丸中均被表達(dá)，RPKM 范圍為（4.60 ±1.68）～（389.03 ±190.56），其他基因未檢測到表達(dá)（RPKM＜1）。

圖3 α基因在小鼠胚胎和成體多個(gè)組織中的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of α-globin genes in multiple tissues of mice embryo and adult stages

圖4 β基因在小鼠胚胎和成體多個(gè)組織中的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of β-globin genes in multiple tissues of mice embryo and adult stages

在成體高原鼢鼠肝臟和腦組織轉(zhuǎn)錄本中，本研究僅鑒定到αA、αE和β1基因的表達(dá)及完整的CDS 序列，其他基因RPKM 均小于1 且CDS 序列不完整。如圖5 所示，高原鼢鼠肝臟和腦組織中αA（RPKM 分 別 為2 079.70 ±593.66 和1 655.90 ±475.47）和β1（RPKM 分 別 為869.12 ±147.64 和1 361.5±387.91）基因的表達(dá)量均顯著高于小鼠同源基因的表達(dá)量（αA1基因RPKM 分別為157.04 ±13.45 和210.83 ±37.56；αA2基 因RPKM 分 別 為137.15 ±9.55 和200.49 ±34.43；β1基因RPKM 分別為188.88±14.74和53.58±8.64；β2基因RPKM分別為93.29 ±7.27 和44.73 ±8.90）。值得注意的是，在成體高原鼢鼠腦組織中αE基因被檢測到表達(dá)（RPKM為2.58±0.53），小鼠中該基因僅表達(dá)于胚胎期（14和15 d）的肝臟和腦組織。

圖5 成體小鼠和高原鼢鼠肝臟和腦中血紅蛋白基因表達(dá)水平（*P＜0.05）Fig.5 Expression level of Hb genes in liver and brain of adult mice and plateau zokor(*P＜0.05)

2.4 高原鼢鼠成體表達(dá)基因的正選擇位點(diǎn)

Pu等［10］的研究結(jié)果表明，高原鼢鼠血紅蛋白α和β 亞基分別具有17 和24 個(gè)氨基酸差異，其中α 111、α131、β4、β5 和β115 等5 個(gè)氨基酸突變可能是高原鼢鼠Hb 固有氧親和力升高及與變構(gòu)因子和CO2敏感度改變的主要因素。本文采用分枝位點(diǎn)模型以高原鼢鼠各基因?yàn)榍熬胺种Γ╢oreground），分析了上述突變是否是正自然選擇的結(jié)果（表1）。αA、αE和β 1基 因Model A0 的lnL值 分 別 為-1 165.27、-1 261.79 和-1 317.58，Model A1 的lnL值分別為-1 161.67、-1 261.79 和-1 312.34。LRT 檢驗(yàn)結(jié)果顯示αA和β1基因拒絕Model A0 模型（P＜0.01），說明高原鼢鼠這兩個(gè)基因的某些位點(diǎn)可能受到正選擇。BEB 分析結(jié)果顯示，αA和β1基因 分 別 有1 個(gè)（24Leu）和3 個(gè)（43Ser，61Ser 和87His）位點(diǎn)可能具有大于1 的ω值，后檢驗(yàn)概率分別為0.933、0.639、0.939和0.711。

表1 高原鼢鼠成體表達(dá)血紅蛋白基因的正選擇分析Table 1 Maximum likelihood analysis of adult Hb genes from rodents under branch-site models

2.5 高原鼢鼠血紅蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)

已有研究表明，成體高原鼢鼠至少表達(dá)了2種Hb 亞型，其中低等電點(diǎn)的亞型相對含量稍高于另外一種高等電點(diǎn)亞型；成體小鼠只表達(dá)一種Hb 亞型，等電點(diǎn)與高原鼢鼠含量高的亞型相近［10］?；诨虮磉_(dá)分析結(jié)果，本文推測成體高原鼢鼠的兩種Hb 亞型為成體αA型（αAβ1）2和胚胎αE型（αEβ1）2。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）進(jìn)一步證實(shí)了該推測，αA型Hb 是所有已知脊椎動(dòng)物成體表達(dá)的主要亞型，這種模式在成體高原鼢鼠中依然保守，αA型與αE亞型相比具有較低的pI 值（分別為7.17 和7.92）。小鼠成體表達(dá)基因預(yù)測蛋白質(zhì)序列結(jié)果顯示，2 個(gè)α（αA1和αA2）和2 個(gè)β（β1和β2）基因最終翻譯為完全相同的氨基酸序列，故非變性電泳條帶只有1條（1個(gè)主要Hb組分），其αA和β多肽pI分別為7.97和7.13，這與高原鼢鼠αA型Hb兩個(gè)亞基的pI 更為接近（7.17 和7.95）。此外，高原鼢鼠所有Hb亞基的GRAVY 數(shù)值均較低，說明高原鼢鼠2種Hb亞型的親水性均較小鼠高。

表2 小鼠和高原鼢鼠血紅蛋白α和β多肽物理化學(xué)性質(zhì)分析1）Table 2 Predicted physicochemical properties of hemoglobin α and β polypeptides from mice and plateau zokor

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較分析結(jié)果（圖6）顯示，高原鼢鼠成體Hb β亞基的24個(gè)氨基酸突變中有12個(gè)（41、43、58、61、68、69、70、72、76、80、86 和87 位）位于血紅素“口袋”的開口處，3 個(gè)潛在正選擇位點(diǎn)剛好也在其中。分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算結(jié)果未檢測到明顯影響其T 態(tài)到R 態(tài)轉(zhuǎn)變的因素（氫鍵或鹽鍵形成或丟失），且這些位點(diǎn)也不是典型的變構(gòu)因子或CO2的結(jié)合位點(diǎn)［10］。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示（圖6～圖7），41Tyr-Phe和43Asp-Ser兩個(gè)氨基酸突變使得該區(qū)域親水性和極性減弱，該區(qū)域由無規(guī)則卷曲變?yōu)楦€(wěn)定的α 螺旋；70Ala-Ser 和86Ala-Ser 由非極性氨基酸突變?yōu)闃O性氨基酸，增強(qiáng)了該區(qū)域的親水性和極性，這可能是高原鼢鼠β亞基具有較小鼠高的親水性的主要原因，同時(shí)結(jié)合87Ser-His 突變，使得86～87 位氨基酸區(qū)域由無規(guī)則卷曲變?yōu)棣?螺旋；與43 和86～87 位氨基酸突變相反，80Ser-Asp 的反向突變使得原α螺旋變?yōu)闊o規(guī)則卷曲。上述突變造成的區(qū)域構(gòu)象改變，尤其是80 位氨基酸區(qū)域α 螺旋的消失可能引起血紅素“口袋”的夾角增大，最終使得血紅素口袋的體積增大（由小鼠的1.132 0 nm3增加到高原鼢鼠的1.189 4 nm3），有利于提高O2的運(yùn)輸效率。

圖6 小鼠和高原鼢鼠α型血紅蛋白（αAβ1）2的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.6 Models of the three-dimensional structure of(αAβ1)2 of mice and plateau zokor

圖7 小鼠和高原鼢鼠血紅蛋白β亞基氨基酸殘基的疏水性和極性Fig.7 The hydrophobicity and polarity of amino acid residues in hemoglobin β polypeptides of mice and plateau zokor

3 討 論

系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系結(jié)果表明，嚙齒目動(dòng)物共同祖先中α和β基因簇排列模式可能為5′-αE，αA，αQ-3′和5′-ε，γ，σ（pesudo），β-3′，在現(xiàn)存不同譜系中α和β基因亞家族經(jīng)歷了較為復(fù)雜的基因復(fù)制、刪除、同源重組和假基因事件［26，30］。本文研究結(jié)果顯示，鼴形鼠科物種α基因簇高度保守，均保留了3 個(gè)單拷貝αE，αA和αQ基因，但β基因簇在3 個(gè)物種中分別經(jīng)歷了不同的基因復(fù)制、刪除、同源重組和假基因化事件?；谙到y(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建結(jié)構(gòu)，本文推測鼴形鼠科共同祖先中α和β基因簇中基因排列模式分別為5′-αE，αA，αQ-3′和5′-ε，γ，γ1，σ（pseudo+γ1重組），β-3′，其中原γ基因經(jīng)過復(fù)制后產(chǎn)生γ和γ1，γ1基因（供體）與σ假基因（受體）發(fā)生過同源重組。盡管3 種鼴形鼠科物種具有相似的β基因簇排列模式，但它們的γ2基因起源不同，高原鼢鼠起源于共同祖先中γ基因的復(fù)制，另外兩個(gè)物種則起源于γ1基因的復(fù)制。高原鼢鼠、銀星竹鼠和以色列鼴鼠β基因簇3′端的2～3 個(gè)β基因均為物種特異性基因復(fù)制事件的產(chǎn)物，其中高原鼢鼠和銀星竹鼠β2基因及以色列鼴鼠β3基因產(chǎn)生后不久就經(jīng)歷了假基因化事件。與小鼠和人類相比，3 個(gè)鼴形鼠科物種α和β基因簇仍然保留了5′端胚胎特異性表達(dá)基因和3′端成體特異性表達(dá)基因的排列模式［25-26，30］。

在成體高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄本中，本文檢測到αA、αE和β1三個(gè)基因的表達(dá)。理論上，這3個(gè)基因可以翻譯并最終合成成體αA型（αAβ1）2和胚胎αE型（αEβ1）2兩種Hb 亞型。與等電聚焦電泳結(jié)果相符［10］，本研究結(jié)果顯示預(yù)測的αE亞基具有較αA亞基高的pI 值。已有的研究結(jié)果表明，所有哺乳動(dòng)物的αE基因僅在胚胎發(fā)育時(shí)期被表達(dá)，截至目前尚無證據(jù)表明哺乳動(dòng)物成體階段表達(dá)該基因［1，25］。小鼠胚胎和成體時(shí)期轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步驗(yàn)證和細(xì)化了這種模式，即αE基因僅在胚胎發(fā)育后期（13～15 d）被表達(dá)，而αA基因則在胚胎和成體所有組織中被表達(dá)。高原鼢鼠是首個(gè)被檢測到在成體表達(dá)胚胎αE型Hb的哺乳動(dòng)物，αE型Hb具有較αA型更高的氧親和力，兩種氧親和力不同的Hb 形成對血氧親和力調(diào)節(jié)的一種級聯(lián)機(jī)制，因此理論上成體高原鼢鼠血氧親和力的調(diào)節(jié)范圍可達(dá)兩種亞型Hb 固有氧親和力的極限值［1］。上述結(jié)果可部分解釋高原鼢鼠成體表達(dá)的兩種Hb 亞型及其具有異常高的固有氧親和力的原因。根據(jù)基因表達(dá)分析結(jié)果，成體高原鼢鼠腦組織中αE基因的表達(dá)量（RPKM 僅為2.58 ±0.53）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于αA基因的表達(dá)量1 655.90±475.47，這與電泳結(jié)果中蛋白質(zhì)相對含量的結(jié)果差別較大。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能有2個(gè)：①αE基因可能在其他未被測序的組織中被高表達(dá)，該推測尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；②αE基因編碼多肽的穩(wěn)定性可能較高，使得其可以在紅細(xì)胞內(nèi)積累到較高的濃度。蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示，與小鼠相比，高原鼢鼠αA多肽的穩(wěn)定性明顯降低，而αE和β基因編碼多肽的穩(wěn)定性明顯升高，該結(jié)果支持第2種推測，即高原鼢鼠通過提高αE和β基因編碼多肽的穩(wěn)定性，最終使αE型Hb積累到與αA型Hb相近的濃度。分子進(jìn)化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果進(jìn)一步佐證，兩種類型Hb 的表達(dá)對成體高原鼢鼠適應(yīng)極端低氧環(huán)境是有利的，其中高氧親和力的αE型Hb 有利于肺部毛細(xì)血管從低氧環(huán)境中裝載更多的氧氣，而低氧親和力的αA型Hb則有利于氧氣釋放到需氧組織的過程。

分子進(jìn)化分析結(jié)果表明，高原鼢鼠αE基因相對保守未檢測到正選擇位點(diǎn)，但αA和β基因均顯示有顯著的正選擇位點(diǎn)。蒲鵬［31］已較為深入地研究了氨基酸突變對高原鼢鼠αA型Hb 結(jié)構(gòu)的影響，本文主要探討了Hb β 亞基血紅素“口袋”開口處12 個(gè)氨基酸突變可能對結(jié)構(gòu)造成的影響。結(jié)果表明氨基酸突變對β 亞基結(jié)構(gòu)最突出的影響是43 和86～87位氨基酸突變，這些突變通過形成兩個(gè)α螺旋使血紅素口袋區(qū)域更加穩(wěn)定，同時(shí)80 位氨基酸突變使得開口夾角處α螺旋消失，部分緩解了該區(qū)域的張力使得血紅素“口袋”的開口略微增大。此外，70Ala-Ser 和86Ala-Ser 兩個(gè)突變明顯增加了β 亞基潛在的親水性。因此，本文推測高原鼢鼠Hb β 亞基的12個(gè)氨基酸突變是其穩(wěn)定性提高的關(guān)鍵因素，同時(shí)氨基酸突變引起的親水性升高，均有利于αE型Hb組裝以及積累到較高濃度。

綜上所述，高原鼢鼠成體表達(dá)的兩種Hb 亞型分別為（αAβ1）2和（αEβ1）2；其異常高的氧親和力可能主要由（αEβ1）2高表達(dá)引起；Hb β 亞基血紅素“口袋”開口處12 個(gè)氨基酸突變對提高β 亞基穩(wěn)定性和親水性起到關(guān)鍵作用。本文對αE型Hb 最終積累到較高濃度推測及兩種Hb 亞型的實(shí)際氧親和力尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。