李曉惠，任仙娥，楊鋒，黃永春，黃承都，張昆明，劉純友

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)以豆粕為原料，通過低溫脫脂技術(shù)而制得，其蛋白質(zhì)含量在90%以上，并含有將近20種氨基酸，不含膽固醇且營養(yǎng)豐富，具有很高的營養(yǎng)價值。大豆蛋白具有起泡性、溶解性、乳化性、凝膠性等優(yōu)良的功能特性[1]，其中凝膠性賦予大豆蛋白較高的黏彈性和可塑性，在產(chǎn)品應(yīng)用中可以做水、糖、脂肪和一些功能因子的載體，使得大豆蛋白廣泛應(yīng)用于各種食品中，如豆腐及火腿腸[2]。大豆分離蛋白凝膠的形成主要是通過蛋白質(zhì)分子的聚集來實現(xiàn)的。在蛋白質(zhì)聚集過程中，當(dāng)排斥力和吸引力達(dá)到平衡時，就形成了規(guī)則的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

硫酸鈣，又稱石膏，是目前使用較為廣泛的凝固劑。Ca2+能夠屏蔽蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層和雙電層，與羧基上的H+發(fā)生交換作用形成鈣橋。大豆蛋白通過靜電相互作用、疏水相互作用以及鈣橋相互聚集連接形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。硫酸鹽類凝固劑溶解度比較低，凝膠的成膠速度會受到它的影響，它與蛋白反應(yīng)較緩慢，使得其誘導(dǎo)形成的凝膠結(jié)構(gòu)更加細(xì)膩致密，持水性較好[3]。

超聲空化作為有效的物理改性手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性，而水力空化有著與超聲空化相近的空化效應(yīng)，而且相比超聲空化，水力空化耗能低、能效高、處理量大，更易于工業(yè)化生產(chǎn)。水力空化是流動的液體經(jīng)孔板、葉輪或轉(zhuǎn)子時引起的巨大壓差產(chǎn)生的，空化泡潰滅的瞬間會產(chǎn)生高溫、高壓和高剪切力等，可以修飾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)的功能特性[4]。基于此，本實驗研究了SPI通過水力空化處理后其鈣致凝膠行為的變化規(guī)律，為大豆蛋白凝膠制品品質(zhì)的調(diào)控和新產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

大豆分離蛋白(SPI)：山東禹王生態(tài)食品有限公司。

1.2 試劑

牛血清蛋白：上海源葉生物科技公司；硫酸鈣、β-巰基乙醇、三氯乙酸、福林酚、氯化鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水合硫酸銅、尿素等：均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MCR T2流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；JXN-26冷凍高速離心機 貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司；Alpha 1-4 LD Plus真空冷凍干燥機 德國Christ公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡 上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；水力(渦流)空化實驗裝置由實驗室自制，與課題組前期使用的裝置相同[5]。

1.4 方法

1.4.1 水力空化處理SPI

用去離子水配制質(zhì)量濃度為8 g/dL的SPI分散液，室溫下用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器低速攪拌2 h使之充分溶解。取300 mL SPI分散液用作空白對照，剩余分散液倒入水力空化裝置的分散液貯箱中，開啟冷凝水，調(diào)節(jié)壓力為0.4 MPa，進(jìn)行水力空化(10，30，60 min)處理，處理后的SPI分散液用保鮮膜封口，放入冰箱4 ℃冷藏，備用。

1.4.2 鈣致凝膠的制備

將SPI分散液放入水浴鍋中加熱至分散液達(dá)到90 ℃并保溫30 min，冷卻至35 ℃左右。加入硫酸鈣凝固劑(加入量為0.35 g/dL)使之混合均勻，再放入恒溫水浴鍋中90 ℃保溫20 min形成凝膠，冰水浴冷卻至室溫再放入冰箱中冷藏(4 ℃、24 h)，待測。

1.4.3 凝膠強度的測定

將冷藏過夜盛有凝膠樣品的玻璃瓶放置在質(zhì)構(gòu)分析儀的平臺上進(jìn)行穿刺測定，選擇P/0.5的圓柱形探頭，調(diào)整好樣品的位置使探頭對準(zhǔn)瓶子中心，測定參數(shù)為：測前速度為5 mm/s，穿刺和測后速度均為1 mm/s，壓縮距離為10 mm，觸發(fā)力為5.0 g。凝膠強度為下壓至 10 mm 時的最大力量。

1.4.4 凝膠持水性的測定

根據(jù)Yi Shumin等[6]的方法，使用分析天平準(zhǔn)確稱取不同處理時間的凝膠各5 g于離心管中，在臺式高速離心機上離心，離心的速度設(shè)置為8000 r/min，離心20 min，取出離心管后將其倒扣在吸水紙上使水分排干，擦干離心管內(nèi)外的殘留液。以離心前后質(zhì)量之差作為凝膠釋放液體的質(zhì)量。持水性(WHC)計算公式如下：

式中：Wt為樣品中凝膠的總含水量(g)；Wr為離心后釋放的液體質(zhì)量(g)。

1.4.5 凝膠分子間作用力的測定

參照任仙娥等的方法，稍作改動。將SPI凝膠樣品用大蒜壓制器壓碎，各稱取0.5 g于三角瓶中，分別加入SA 溶液(0.6 mol/L NaCl，pH 為7.0)、SB 溶液(0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，pH為7.0)、 SC溶液(0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，pH為7.0)和SD溶液(0.5 mol/L β-巰基乙醇+8 mol/L尿素，pH為7.0)各15 mL，充分溶解后，于10000 r/min離心10 min，向離心所得上清液中分別加入15 mL的20 g/dL三氯乙酸，于10000 r/min離心10 min，向所得沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，溶解后取1 mL溶液，采用 Lowry 法測定蛋白質(zhì)含量。其中離子鍵參與凝膠的貢獻(xiàn)比例為 SA 溶液中溶解的蛋白質(zhì)含量，氫鍵參與凝膠的貢獻(xiàn)比例為 SB 與 SA 溶液中溶解的蛋白質(zhì)含量之差，疏水相互作用參與凝膠的貢獻(xiàn)比例為 SC 與 SB 溶液中溶解的蛋白質(zhì)含量之差，二硫鍵參與凝膠的貢獻(xiàn)比例為SD與SC溶液中溶解的蛋白質(zhì)含量之差。

1.4.6 凝膠形成過程的流變學(xué)特性測定

采用趙城彬等[7]的實驗方法，略作修改。取SPI分散液50 mL于燒杯中，放入水浴鍋中加熱至分散液達(dá)到90 ℃并保溫30 min，冰浴冷卻至35 ℃左右，加入0.35%的硫酸鈣，迅速攪拌使其溶解，再吸取大約3 mL 的分散液于裝載臺上，使用直徑為50 mm的平板進(jìn)行實驗，應(yīng)變和頻率分別設(shè)置為0.5%和1 Hz，在樣品和平板邊緣凹陷處滴加植物油，防止測試時間過長導(dǎo)致樣品水分蒸發(fā)。實驗中的溫度掃描由升溫階段、保溫階段和冷卻階段組成，初始溫度設(shè)置為25 ℃，以2 ℃/min的速率從25 ℃升溫至90 ℃并保溫20 min，再以2 ℃/min的速率從90 ℃降溫至 25 ℃，測定儲能模量(G′)、損耗模量(G″)隨溫度和時間的變化情況。隨后在1～100 rad/s的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄G′和G″隨頻率的變化情況。

1.4.7 掃描電子顯微鏡觀察

使用Phenom ProX掃描電子顯微鏡進(jìn)行凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察，將凝膠樣品切成1 cm的薄片后冷凍干燥24 h，觀察前對干燥好的凝膠樣品進(jìn)行噴金，電壓設(shè)置為10 kV，放大倍數(shù)為300倍[8]。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

實驗中圖表所示的數(shù)據(jù)均為3次以上重復(fù)平行實驗取得，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用軟件SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Duncan檢驗數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，并使用OriginPro 9.1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水力空化處理對SPI鈣致凝膠強度的影響

由圖1可知，水力空化處理(10，30，60 min)可以顯著(P<0.05)提高SPI鈣致凝膠強度。未處理的SPI形成的鈣致凝膠強度為(11.76±0.72) g，水力空化10 min后的SPI鈣致凝膠強度顯著(P<0.05)增加到(36.92±0.43) g，而后隨著空化時間延長至30 min，凝膠強度進(jìn)一步增強并達(dá)到最大值(46.22±0.74) g。這可能是因為水力空化使蛋白質(zhì)分子粒徑減小，提高了蛋白質(zhì)的溶解度[9]，使蛋白與凝固劑硫酸鈣充分接觸，Ca2+發(fā)揮鹽橋作用，加強蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，使得形成的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為緊密均勻，導(dǎo)致凝膠的強度大大增強。劉冉等[10]研究發(fā)現(xiàn)功率超聲處理可以為凝膠形成提供更多的作用位點，從而加速凝膠形成，提高其凝膠強度和凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。但是SPI空化60 min相對空化30 min來說形成的鈣致凝膠強度又有一定的下降，可能是因為在長時間的空化作用下蛋白變性聚合，開始形成蛋白聚合物，影響了凝膠的致密結(jié)構(gòu)，以致于凝膠強度稍有下降。

圖1 水力空化處理對SPI鈣致凝膠強度的影響Fig.1 Effect of HC treatment on calcium induced gel strength of SPI

2.2 水力空化處理對SPI鈣致凝膠持水性的影響

持水性作為重要的凝膠特性之一，能間接地反映出凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度。由圖2可知，SPI經(jīng)過水力空化處理后形成的鈣致凝膠的持水性都有相應(yīng)的增強。未處理的SPI形成的鈣致凝膠持水性為(63.02±0.65)%，水力空化10，30，60 min后SPI形成的鈣致凝膠持水性分別為(68.70±1.97)%、(89.76±0.76)%、(80.54±2.21)%。汪長青等[11]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲預(yù)處理形成的SPI凝膠持水性顯著大于未處理樣品，超聲空化使蛋白質(zhì)粒徑分子減小，有助于形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而可以束縛住凝膠體系中的水，使凝膠具有較高的持水性。

圖2 水力空化處理對SPI鈣致凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of HC treatment on water holding capacity of calcium induced gel of SPI

2.3 水力空化處理對SPI鈣致凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響

2.3.1 溫度掃描

SPI分散液的鈣致凝膠形成曲線隨時間的變化見圖3。

圖3 水力空化處理對SPI鈣致凝膠G′和 G″的影響Fig.3 Effect of HC treatment on G′ and G″ of calcium induced gel of SPI

由圖3可知，在升溫-保溫-冷卻的熱循環(huán)過程中，SPI鈣致凝膠樣品的G′和G″隨時間的變化基本呈現(xiàn)相同的變化趨勢，均先下降再升高。初始升溫階段，與未處理的SPI相比，進(jìn)行空化處理的SPI的G′和G″有所降低，使蛋白溶液體現(xiàn)出了更像液體的流變性。SPI分散液受到了外部應(yīng)力的作用，破壞了分散液的黏彈結(jié)構(gòu)，所以模量隨著溫度的升高而出現(xiàn)短期下降。當(dāng)溫度升高到一定的溫度后，蛋白質(zhì)分子去折疊，蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基就會逐漸被暴露，在硫酸鈣的作用下，蛋白分子發(fā)生了聚集，G′和G″開始增大。最開始G′小于G″，隨著不斷升溫，G′快速增加，當(dāng)G′=G″時，在此溫度下，開始形成凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在交點過后，模量隨著時間的延長不斷增大，繼續(xù)加熱，蛋白分子間不斷發(fā)生交聯(lián)聚集，模量不斷增加，在長時間高溫的暴露下，疏水相互作用成為主要分子間作用力，凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到加強。在保溫的過程中，G′和G″隨時間的延長緩慢增大。在冷卻的過程中，G′和G″迅速增加。這表明在升溫和保溫的過程中，SPI分散液逐漸從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)特征行為的凝膠結(jié)構(gòu)，在冷卻過程中，鈣致凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)得到增強。未進(jìn)行空化處理的SPI在685.4 s時，G′=G″；水力空化處理10，30，60 min的SPI在1217，980.9，1040 s時，G′=G″?？栈蟮腟PI成膠時間相對延后是因為水力空化降低了SPI的黏度。在冷卻階段結(jié)束后空化0，10，30，60 min的SPI最終形成凝膠的G′值分別為655.16，835.74，4723.60，1335.70 Pa。由此可見，水力空化可以顯著提升SPI鈣致凝膠的G′值，且水力空化30 min的SPI形成的凝膠最終G′值最大，進(jìn)一步與前文凝膠強度結(jié)果相印證。秦新生[12]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理30 min 時，SPI/WG蛋白酶致凝膠具有最高的G′值(2938 Pa)，隨后是40 min超聲處理的凝膠(2698 Pa)，均大于未經(jīng)超聲波處理的凝膠(2373 Pa)。

2.3.2 頻率掃描

為了進(jìn)一步檢驗水力空化處理后SPI鈣致凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成情況，模擬凝膠后進(jìn)行頻率掃描。不同水力空化時間下對SPI形成凝膠的頻率掃描見圖4。

圖4 最終形成的SPI鈣致凝膠G′和G″隨角頻率變化的情況

由圖4可知，鈣致凝膠所有樣品的G′值始終大于G″值，表明此時凝膠已經(jīng)形成了較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在全頻率掃描范圍內(nèi)，所有樣品的G′和G″幾乎不隨著頻率的增加發(fā)生變化，即G′和G″對振蕩頻率顯示出較低的依賴性，這說明形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。通過頻率掃描數(shù)據(jù)可以看出，水力空化可提高SPI鈣致凝膠的G′值。

2.4 水力空化處理對SPI鈣致凝膠分子間作用力的影響

由圖5可知，經(jīng)水力空化的SPI形成的鈣致凝膠中離子鍵含量顯著下降(P<0.05)，空化30 min后的SPI凝膠的疏水相互作用和二硫鍵含量與未處理的相比顯著增大(P<0.05)，疏水相互作用和二硫鍵對分子構(gòu)象的改變和蛋白分子聚集起主要作用，是凝膠形成的主要作用力。SPI鈣致凝膠中氫鍵含量均小于2%，說明氫鍵對維持SPI凝膠結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)較小。SPI經(jīng)水力空化處理后分子內(nèi)部的巰基和疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致在硫酸鈣致使蛋白分子交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的同時，形成大量的二硫鍵，疏水相互作用增強，舒展的肽鏈通過二硫鍵和疏水相互作用構(gòu)成蛋白聚集體進(jìn)而形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[13]。

圖5 水力空化對SPI鈣致凝膠分子間作用力的影響Fig.5 Effect of HC on intermolecular forces of calcium induced gel of SPI

2.5 水力空化處理對SPI鈣致凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可知，未經(jīng)水力空化處理的SPI形成的鈣致凝膠微觀結(jié)構(gòu)多呈松散且無規(guī)則的粗糙鱗片狀，經(jīng)水力空化處理后的SPI形成的鈣致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對緊湊致密，尤其水力空化處理30 min后形成了具有致密孔洞和均勻結(jié)構(gòu)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是：一方面由于水力空化顯著降低了蛋白粒徑，增大了SPI的溶解度，使硫酸鈣充分發(fā)揮了鹽橋的作用，促進(jìn)凝膠聚集體的形成。另一方面，水力空化導(dǎo)致游離巰基和疏水基團(tuán)暴露于SPI蛋白分子的表面，有利于分子間疏水相互作用和二硫鍵的形成，形成致密穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。Hu Hao等[14]研究發(fā)現(xiàn)與未處理的SPI酸促凝膠相比，超聲空化處理SPI形成的酸促凝膠具有更致密、更均勻的微觀結(jié)構(gòu)。李素云等[15]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲預(yù)處理的小麥蛋白與殼聚糖復(fù)合物顆粒分布更加均勻，使復(fù)合物形成一種更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖6中d可知，延長水力空化時間到60 min，反而會形成較大的空洞結(jié)構(gòu)，這種變化趨勢與本文的凝膠強度、持水性和流變性質(zhì)的實驗結(jié)果相對應(yīng)。

3 結(jié)論

對SPI分散液進(jìn)行不同時間(10，30，60 min)的水力空化處理顯著改善了鈣致凝膠的凝膠性能。水力空化處理后的SPI形成的鈣致凝膠中二硫鍵含量和疏水相互作用顯著增加，成為凝膠形成的主要分子間作用力。SPI經(jīng)水力空化處理后形成的鈣致凝膠微觀結(jié)構(gòu)也變得更加致密均勻。水力空化處理還顯著地增加了SPI鈣致凝膠的凝膠強度、持水性和凝膠最終的G′值，而且水力空化30 min時均達(dá)到最大值，凝膠強度與未處理樣品相比提高了3.9倍；持水性提升了26.7%；最終形成凝膠的G′值與未處理樣品相比增大了7.2倍?？梢姡栈幚砜勺鳛槭称返鞍踪|(zhì)凝膠產(chǎn)業(yè)中加工的新技術(shù)。