陳雪梅，先琳，勾選枝，黎英

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.閩西特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工公共服務(wù)平臺(tái)，福建 龍巖 364012)

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一，作為流行較廣的民間食品，其歷史悠久、生產(chǎn)成本低、制作工藝簡(jiǎn)單，所得產(chǎn)品脆嫩芳香、口感獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，有著廣闊的市場(chǎng)。但是，泡菜在發(fā)酵期間，乳酸菌之外的一些雜菌(腸桿菌、假單胞菌、黃桿菌屬和葡萄球菌屬)生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶會(huì)將蔬菜本身含有的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[1-2]。過量的亞硝酸鹽不僅會(huì)使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而導(dǎo)致血液失去運(yùn)輸氧的能力而引起組織缺氧，而且會(huì)與各種胺類反應(yīng)生成亞硝胺，產(chǎn)生極強(qiáng)的致癌作用[3-4]。因此，亞硝酸鹽一直都是泡菜食用安全的重要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一。

目前，測(cè)定食品中亞硝酸鹽的依據(jù)是GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》，其中，第二法(即鹽酸萘乙二胺法)是歷年國家標(biāo)準(zhǔn)中都有的方法。該方法的樣品預(yù)處理?xiàng)l件適合肉制品，對(duì)于其他樣品僅可作為參考[5]。本法利用亞硝酸鹽在弱酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與N-1-萘基乙二胺耦合形成紫紅色化合物[6]，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量比較，且一般的實(shí)驗(yàn)室都具備其測(cè)定條件。但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，紫甘藍(lán)等具有花青素的泡菜在預(yù)處理過濾后的溶液仍具有一定的顏色，主要原因是乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液脫色能力較差；另外，泡菜在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，有機(jī)酸的累積會(huì)改變樣液的pH值[7]，這都嚴(yán)重影響了比色測(cè)定結(jié)果。因此，對(duì)于帶有天然色素的泡菜樣品，在測(cè)定亞硝酸鹽時(shí)有必要對(duì)泡菜預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行改進(jìn)或優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)以紫甘藍(lán)泡菜為樣品，研究測(cè)定亞硝酸鹽含量時(shí)樣品的預(yù)處理方法。采用飽和硼砂溶液進(jìn)行常溫振蕩提取，再用活性炭和乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液進(jìn)行脫色澄清，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)研究樣品預(yù)處理時(shí)活性炭、硼砂飽和溶液、提取時(shí)間和沉淀劑對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響，以加標(biāo)樣品的回收率為指標(biāo)，優(yōu)化或改進(jìn)預(yù)處理?xiàng)l件，以期解決泡菜中天然色素和有機(jī)酸對(duì)測(cè)定的干擾，從而取得更準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫甘藍(lán)泡菜：自制，參考文獻(xiàn)[8-9]制作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

JA202電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；JYL-C19V九陽料理機(jī) 九陽股份有限公司；ZWYR-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；PH-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 廈門柏嘉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硼酸鈉、亞硝酸鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、冰醋酸、活性炭粉等：均為AR級(jí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，2.50 mL 5 μg/mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0，2，4，6，8，10，12.5 μg亞硝酸鹽)分別置于25 mL比色管中，于各管中加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，靜置3～5 min后，各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用1 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列中的亞硝酸鹽質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程。

1.3.2 紫甘藍(lán)泡菜亞硝酸鹽的測(cè)定方法

1.3.2.1 紫甘藍(lán)泡菜的預(yù)處理

取紫甘藍(lán)泡菜10.0 g→加1倍水勻漿→用100 mL水移至250 mL三角瓶中→加一定量的飽和硼砂溶液和活性炭→常溫振蕩提取一定時(shí)間→轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中→加沉淀劑(220 g/L乙酸鋅、106 g/L亞鐵氰化鉀)→定容→靜置30 min→過濾→棄去前30 mL濾液，收集后面的濾液備用。

1.3.2.2 紫甘藍(lán)泡菜亞硝酸鹽的測(cè)定及計(jì)算

取樣品濾液20 mL→顯色→定容至25 mL→于538 nm處測(cè)定吸光度→由線性方程計(jì)算20 mL樣品濾液中亞硝酸鹽質(zhì)量x→計(jì)算樣品中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω。

式中：ω為樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；x為20 mL樣品濾液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，μg；m為紫甘藍(lán)泡菜的質(zhì)量，g；250為樣品處理液總體積，mL；20為比色時(shí)取樣品濾液體積，mL。

1.3.3 紫甘藍(lán)泡菜預(yù)處理?xiàng)l件的研究

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究紫甘藍(lán)泡菜樣品預(yù)處理時(shí)飽和硼砂用量、活性炭用量、提取時(shí)間、沉淀劑用量對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響，以加標(biāo)樣品回收率為指標(biāo)，篩選出回收率接近100%的預(yù)處理?xiàng)l件。然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3.4 加標(biāo)樣品回收率的計(jì)算

取兩份重量相同的紫甘藍(lán)泡菜，其中一份添加5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL作為加標(biāo)樣品。將兩份樣品采用相同的方法進(jìn)行預(yù)處理并分別測(cè)定亞硝酸鹽含量，計(jì)算亞硝酸鹽回收率P：

式中：m為紫甘藍(lán)泡菜的質(zhì)量，g；ω1為樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；ω2為加標(biāo)樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；m0為加入的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)、亞硝酸鹽質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of nitrite

由圖1可知，亞硝酸鹽質(zhì)量在0～12.5 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為y=0.0279x+0.0086，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9971。

2.2 紫甘藍(lán)泡菜預(yù)處理的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 活性炭用量對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響

取紫甘藍(lán)泡菜6份，勻漿，同時(shí)準(zhǔn)備各加標(biāo)樣品。在固定飽和硼砂溶液6.5 mL、常溫下200 r/min振蕩提取30 min、沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL的條件下，研究活性炭用量(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g)對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 活性炭用量對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on the nitrite recovery rate

由圖2可知，隨著活性炭用量的增加，回收率先降低再升高，然后再降低?；钚蕴康闹饕饔檬敲摮龢悠分泻械奶烊簧鼗ㄇ嗨兀瑫r(shí)也能澄清濾液。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不添加活性炭時(shí)，樣品濾液呈微紫紅色，顯色后顏色非常深，吸光度為0.489～0.522，超出測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的吸光度范圍，但回收率僅有58.9%。可見，紫甘藍(lán)中天然色素對(duì)亞硝酸鹽的比色測(cè)定造成很大的干擾。使用活性炭后，樣品濾液變得澄清無色。由于活性炭用量不同，其對(duì)紫甘藍(lán)色素的脫除率也不同，而紫甘藍(lán)色素是由多種花色苷組成的，顏色的變化受pH值的影響較大[10]，所以不同活性炭用量預(yù)處理樣品后測(cè)得的亞硝酸鹽回收率不同。當(dāng)活性炭用量為0.4 g時(shí)，亞硝酸鹽回收率最接近100%。

2.2.2 飽和硼砂溶液用量對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響

取紫甘藍(lán)泡菜5份，勻漿，在活性炭用量0.4 g、常溫下200 r/min振蕩提取30 min、沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL的條件下，研究飽和硼砂溶液分別為0，3.5，6.5，9.5，12.5 mL時(shí)對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著飽和硼砂溶液用量的增加，回收率先升高再降低。飽和硼砂溶液是亞硝酸鹽的提取劑，測(cè)定不同飽和硼砂用量下提取液的酸堿性，其pH值分別為4.15，8.79，9.08，9.17，9.22，可見亞硝酸鹽在pH為9.0左右時(shí)提取回收率較高。當(dāng)飽和硼砂用量由6.5 mL增加至12.5 mL時(shí)，pH由9.08增加至9.22，增幅緩慢，有類似緩沖溶液的作用。而鹽酸萘乙二胺法的顯色必須在弱酸性條件下，過多的飽和硼砂溶液會(huì)影響后續(xù)顯色反應(yīng)的酸堿性，這可能也是硼砂用量多時(shí)回收率降低的原因。飽和硼砂用量為6.5 mL時(shí)，回收率最接近100%。

圖3 飽和硼砂溶液用量對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響Fig.3 Effect of saturated borax solution dosage on the nitrite recovery rate

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響

將勻漿后的紫甘藍(lán)泡菜平均分成5份，在各樣品中加入飽和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g，分別于常溫下200 r/min振蕩提取10，15，20，25，30 min，然后加入乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL，過濾后取樣品濾液顯色測(cè)定。樣品提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the nitrite recovery rate

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率變化幅度不大，在95%～105%范圍內(nèi)波動(dòng)，說明提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的影響不大。主要原因是亞硝酸鹽易溶解于水，只要樣品勻漿均勻，就有利于亞硝酸鹽的溶解和提取。出于節(jié)約時(shí)間成本的考慮，選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間為10 min。

2.2.4 沉淀劑對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的影響

固定飽和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g、常溫下200 r/min振蕩提取10 min，研究沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液分別為0，1.0，3.0，5.0 mL時(shí)對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 沉淀劑用量對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響Fig.5 Effect of precipitant dosage on the nitrite recovery rate

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液在使用時(shí)等體積混合，通過反應(yīng)會(huì)生成氰亞鐵酸鋅沉淀，能吸附樣品中的蛋白質(zhì)、果膠等干擾物質(zhì)，從而使樣液澄清。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不添加沉淀劑的樣品濾液渾濁色暗，從而導(dǎo)致吸光度增大，回收率遠(yuǎn)高于100%。而添加沉淀劑的樣品濾液澄清透明，隨著沉淀劑用量的增加，回收率先上升再下降，當(dāng)沉淀劑用量為3.0 mL時(shí)，回收率最接近100%，且沉淀劑由3.0 mL增加至5.0 mL時(shí)，回收率略有下降，但變化幅度不大。

2.3 紫甘藍(lán)泡菜預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫甘藍(lán)泡菜預(yù)處理時(shí)活性炭用量、飽和硼砂用量和沉淀劑用量對(duì)亞硝酸鹽的測(cè)定影響較明顯。為了獲得更好的預(yù)處理?xiàng)l件，選擇活性炭(A)、飽和硼砂溶液(B)、沉淀劑(C)3個(gè)因素，以亞硝酸鹽回收率(Y)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7.0軟件提供的Box-Behnken Design設(shè)計(jì)17組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，分析各因素及各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，并建立數(shù)學(xué)模型。實(shí)驗(yàn)的因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design scheme and results

續(xù) 表

由Design-Expert 7.0軟件分析可得，響應(yīng)值(回收率Y)與各因素之間的回歸方程為：Y=101.02+2.44A-3.30B-1.66C-2.68AB+0.35AC-1.02BC-4.89A2-1.46B2-6.23C2。

由表3可知，該回歸模型的影響顯著(P=0.0011<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.5894>0.05)，說明該回歸模型與實(shí)際情況擬合程度良好，且3個(gè)因素對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響均達(dá)顯著水平(P<0.05)，影響大小的順序?yàn)锽(飽和硼砂溶液)>A(活性炭)>C(沉淀劑)，可見該回歸模型中3個(gè)因素對(duì)紫甘藍(lán)泡菜亞硝酸鹽回收率的影響是可信的，用該方程進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值和實(shí)際測(cè)定值之間相關(guān)性較高。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test design

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

活性炭(A)、飽和硼砂溶液(B)、沉淀劑(C)3個(gè)因素交互作用對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響見圖6。

由圖6可知，AB交互作用的曲面相對(duì)陡一些，說明活性炭和飽和硼砂溶液交互作用對(duì)回收率的影響更顯著。根據(jù)回歸模型方程預(yù)測(cè)回收率為100%的最佳預(yù)處理?xiàng)l件是活性炭0.40 g，飽和硼砂溶液7.85 mL，沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.04 mL。在實(shí)際操作中將預(yù)處理?xiàng)l件適當(dāng)調(diào)整：活性炭0.40 g，飽和硼砂溶液7.80 mL，沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.00 mL，其他條件為常溫下200 r/min振蕩提取10 min。

2.3.3 最佳預(yù)處理?xiàng)l件的確定

用改進(jìn)后的最佳預(yù)處理?xiàng)l件和GB 5009.33-2016第二法中的預(yù)處理方法分別對(duì)紫甘藍(lán)泡菜及加標(biāo)樣品進(jìn)行預(yù)處理并測(cè)定亞硝酸鹽，做3次平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和回收率見表4。

表4 兩種方法的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及回收率Table 4 Experimental phenomenon and recovery rate of two methods

由表4可知，采用國標(biāo)方法所得濾液帶有一定顏色，平均回收率為81.3%，3次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.42%。采用改進(jìn)的預(yù)處理方法所得的濾液無色、澄清、透明，平均回收率為98.5%，與國標(biāo)方法測(cè)得的回收率相比，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性更高；由于消除了樣品天然色素的干擾，3次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也比較小，RSD=0.30%?？梢姡倪M(jìn)的預(yù)處理方法不僅提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好。

3 結(jié)論

以紫甘藍(lán)泡菜為樣品，采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽含量，樣品預(yù)處理方法如下：取紫甘藍(lán)泡菜10.0 g，加水勻漿，加7.80 mL飽和硼砂溶液和0.40 g活性炭，常溫200 r/min振蕩提取10 min，加入沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.00 mL，定容至250 mL，靜置30 min，過濾，棄去前30 mL濾液，收集后面的濾液備用。

通過對(duì)國標(biāo)預(yù)處理方法適當(dāng)改進(jìn)，可得無色澄清樣液，平均加標(biāo)回收率為98.5%，與國標(biāo)方法測(cè)得的回收率相比，測(cè)定結(jié)果不僅準(zhǔn)確性更高，而且穩(wěn)定性更好。